王秀娟孫堯

乏氧條件下miR-29a通過AMPK調(diào)控胰島β細(xì)胞功能的研究

王秀娟①孫堯②

目的：觀察乏氧條件下miRNA調(diào)節(jié)AMPK對(duì)胰腺β細(xì)胞發(fā)揮的作用。方法：經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)及Real-time PCR，觀察在乏氧條件下miR-29a通過AMPK調(diào)控胰島β細(xì)胞功能的發(fā)揮。結(jié)果：INS-1細(xì)胞，主要表達(dá)AMPKα2，其磷酸化AMPK活性在乏氧條件下增加。用Real time PCR檢測(cè)AMPK的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)乏氧說明在胰腺β細(xì)胞，主要表達(dá)AMPKα2亞基。乏氧能促進(jìn)HIF-1α表達(dá)，促進(jìn)AMPK的活化。同時(shí)AMPK可能受miR-29a的調(diào)節(jié)。結(jié)論：乏氧條件下胰島β細(xì)胞主要表達(dá)為AMPKa2，說明AMPK能促進(jìn)胰島β細(xì)胞細(xì)胞增殖。

AMPK； 胰腺β細(xì)胞； 乏氧； miR-29a

胰腺是一腺體器官，內(nèi)分泌胰腺包括胰島，約有100～1000激素分泌細(xì)胞散布在外分泌組織和通過血管團(tuán)相互聯(lián)系。胰島的功能主要是通過產(chǎn)生多種激素維持代謝平衡，這些激素調(diào)節(jié)血糖水平。胰腺β細(xì)胞的功能受很多分子的調(diào)控包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、各種代謝分子及microRNA（miRNA）等構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，精確調(diào)控其行為[1-3]。miRNA是一種內(nèi)源性的非編碼RNA，廣泛存在于真核生物中。而乏氧上調(diào)miR-29a通過AMPK抑制胰腺β細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡及促進(jìn)自噬。筆者采用分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的方法研究特分析如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 RPMI 1640培養(yǎng)液 RPMI 1640培養(yǎng)基干粉為Invitrogen產(chǎn)品，去離子水配制，每升加入2.0 g的碳酸氫鈉，充分溶解后用HCl調(diào)pH至7.4，0.22 μm濾膜過濾后4 ℃保存使用。

1.1.2 DMEM培養(yǎng)液 DMEM培養(yǎng)基干粉為Invitrogen產(chǎn)品。去離子水配制，每升加入3.7 g的碳酸氫鈉，充分溶解后用HCl調(diào)pH至7.4，0.22 μm濾膜過濾后4 ℃保存使用。

1.1.3 D-Hank’s液配制 1 L含有0.12 g Na2HPO4·7H2O，0.06 g KH2PO4，0.35 g NaHCO3，0.4 g KCl，8 g NaCl。

1.1.4 0.25%胰蛋白酶 1L D-Hank’s液（pH 7.4）含有2.5 g胰酶，充分溶解后過濾除菌于4 ℃保存。

1.1.5 其他材料 細(xì)胞培養(yǎng)用各式培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板和

其他耗材，均購(gòu)自Corning公司。

1.1.6 10×PBS 室溫保存，使用時(shí)以水稀釋至1×PBS，調(diào)pH 7.4。

1.1.7 Real-time PCR相 關(guān) 試 劑 Olig（dT）18、dNTP、逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑購(gòu)自Promega公司；2×SYBR Green PCR Master Mix（Takara公司，日本），此混合物中含有dNTP、MgCl2、Taq DNA多聚酶、抗Taq單克隆抗體和SYBR Green I、II等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) INS-1細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存，培養(yǎng)在RPMI1640并含有2 mmol/L Gln，另外加100 kU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素，1 mmol/L丙酮酸鈉，完全的培養(yǎng)基含有10%滅活的胎牛血清，培養(yǎng)37 ℃，5% CO2條件下[4-5]。乏氧處理的條件是1% O2。

1.2.2 Real-time PCR 使用Primer Premier software 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，DNA序列由上海生物工程有限公司合成，Real-time PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋簾釂?dòng)95 ℃ 3 min，然后95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s擴(kuò)增40循環(huán)，最后0.5 ℃/s作融解曲線。使用Light Cycler軟件分析結(jié)果。目的基因與內(nèi)參Ct值各自通過標(biāo)準(zhǔn)曲線轉(zhuǎn)換為濃度值，以各目的基因和GAPDH基因的濃度比值表示mRNA的相對(duì)水平[6-8]。

2 結(jié)果

2.1 乏氧條件下胰島β細(xì)胞AMPK的表達(dá)情況 為研究乏氧條件下胰島β細(xì)胞AMPK的表達(dá)情況，將INS-1細(xì)胞放于常氧和乏氧（1% O2）條件下培養(yǎng)，觀察不同乏氧時(shí)間4、12和24 h的AMPK表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在INS-1細(xì)胞，主要表達(dá)AMPKα2，其磷酸化AMPK活性在乏氧條件下增加（圖1）。用Real time PCR檢測(cè)AMPK的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)乏氧說明在胰腺β細(xì)胞，主要表達(dá)AMPKα2亞基（圖2）。當(dāng)HIF-1α被抑制后，磷酸化AMPK下降，同時(shí)AMPK也下降。說明乏氧能促進(jìn)HIF-1α表達(dá)，促進(jìn)AMPK的活化（圖3）。

2.2 miR-29a調(diào)節(jié)AMPK在胰島細(xì)胞的表達(dá) AMPK在胰島細(xì)胞有很重要的作用，筆者用生物學(xué)軟件對(duì)調(diào)節(jié)AMPK的3’UTR的miRNAs進(jìn)行了預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)AMPK的3’UTR區(qū)有miR-29a結(jié)合位點(diǎn)，說明AMPK可能受miR-29a的調(diào)節(jié)，因此構(gòu)建了AMPK的3’UTR的報(bào)告基因載體，證明了AMPK是miR-29a的靶基因（圖4）。將INS-1細(xì)胞在乏氧條件下培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，乏氧能下調(diào)miR-29a的表達(dá)（圖5）。

圖1 磷酸化AMPK活性在乏氧條件下的情況

圖2 胰腺β細(xì)胞表達(dá)情況

圖3 HIF-1在乏氧條件下AMPK的活化情況

圖4 miR-29a調(diào)節(jié)AMPK情況

3 討論

AMPK在細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激是活性增加。ROS誘導(dǎo)激活A(yù)MPK被認(rèn)為對(duì)許多藥物的有益效果是非常重要的。例如，已報(bào)道二甲雙胍通過線粒體衍生的RNS激活A(yù)MPK。在小鼠骨骼肌AMPK被活化，氧化應(yīng)激和增強(qiáng)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，并不依賴于AMP或AMP/ATP比值的變化。同樣，在細(xì)胞培養(yǎng)條件下，缺氧誘導(dǎo)的AMPK活化依賴于線粒體ROS而AMP/ATP比值沒有顯著的變化[9]。過氧化氫已被觀察到，能夠強(qiáng)烈誘導(dǎo)

活化AMPK。

圖5 乏氧條件下miR-29a的表達(dá)

線粒體尤其線粒體受損是細(xì)胞ROS產(chǎn)生的主要來源，線粒體損傷與許多慢性疾病有關(guān)如糖尿病，神經(jīng)退行性疾病和癌癥。AMPK可通過幾個(gè)機(jī)制調(diào)節(jié)線粒體ROS的產(chǎn)生[10]。解偶聯(lián)蛋白是線粒體陰離子載體蛋白的大家庭成員，解偶聯(lián)蛋白促進(jìn)線粒體膜上的陰離子轉(zhuǎn)移。UCP2在控制線粒體ROS生產(chǎn)中起著重要的作用是治療肥胖、糖尿病及衰老的潛在靶點(diǎn)[11]。研究表明，一個(gè)在氧化還原調(diào)控AMPK的作用機(jī)制是通過上調(diào)線粒體UCP2表達(dá)。例如，通過AICAR激活A(yù)MPK，或過表達(dá)組成性激活A(yù)MPK，抑制O2生產(chǎn)和降低酪氨酸硝化前列環(huán)素合酶在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在高糖處理[12]。AMPK參與NPY/刺鼠相關(guān)肽的作用。后者似乎是由于了UCP2表達(dá)的調(diào)控，導(dǎo)致神經(jīng)元的調(diào)控線粒體ROS的產(chǎn)生。培養(yǎng)MIN6胰島瘤細(xì)胞。此外，在動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)激活A(yù)MPK導(dǎo)致胰島UCP2表達(dá)的增加，此結(jié)果與在β細(xì)胞缺失的細(xì)胞結(jié)果一致[13]。盡管這些研究結(jié)果，AMPK調(diào)節(jié)UCP2表達(dá)和功能的詳細(xì)的機(jī)制仍然不完全清楚。新研究表明，AMPK調(diào)節(jié)自噬從而調(diào)節(jié)線粒體ROS的產(chǎn)生。眾所周知的，受損的蛋白質(zhì)和DNA的或不正常的線粒體可導(dǎo)致線粒體產(chǎn)生ROS增強(qiáng)[14]。因此，細(xì)胞有各種特定的機(jī)制來控制這些受損細(xì)胞器，這樣的機(jī)制之一就是細(xì)胞自噬，從細(xì)胞中消除不正常的線粒體是至關(guān)重要的[14]。自噬缺陷導(dǎo)致生產(chǎn)ROS；這是由自噬功能失調(diào)的細(xì)胞或動(dòng)物的許多實(shí)驗(yàn)結(jié)果的支持。例如，從agt7缺陷小鼠的骨骼肌細(xì)胞表現(xiàn)為線粒體呼吸和ROS水平增加[15]。

筆者的研究發(fā)現(xiàn)乏氧條件下胰島β細(xì)胞主要表達(dá)AMPKα2，而AMPKα1表達(dá)很低，說明AMPK在細(xì)胞的表達(dá)存在組織特異性。進(jìn)一步的結(jié)果說明AMPK能促進(jìn)胰島β細(xì)胞細(xì)胞增殖。

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Study on the Function of AMPK Regulation in Pancreatic β Cells under Hypoxic Conditions Via miR-29a

/WANG Xiu-juan，SUN Yao.//Medical Innovation of China，2014，11（18）：069-071

Objective：To explore the mechanism by which miRNA plays roles in pancreatic β cells through regulating AMPK under hypoxic condition. Method：Under the condition of lack of oxygen miR - 29 a by AMPK regulation islet beta cell function were observed by cell culture and Real - time PCR.Result：The INS-1 cell primarily expressed AMPKα2， which the phosphorylation activity of AMPK was increased under hypoxic condition. the expression of AMPK was detected by Real time PCR， which suggested that pancreatic β cells primarily expressed AMPKα2 under hypoxic condition. Hypoxia could accelerate the expression of HIF-1α and the activation of AMPK. Meanwhile， AMPK might be regulated by miR-29a.Conclusion：Under the condition of lack of oxygen islet beta cells mainly expressed as AMPKa2，AMPK can promote cell proliferation islet beta cells.

AMPK； Pancreatic β cells； Hypoxia； miR-29a

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.18.023

2014-04-21） （本文編輯：蔡元元）

①河北聯(lián)合大學(xué) 河北 唐山 063000

②河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院

王秀娟

First-author’s address：Hebei United University，Tangshan 063000，China