馮曉璞蘭坤張肖怡宋瑞瑞王銳張宇

自制雙管套管在大鼠前扣帶回皮層置管給藥的方法*

馮曉璞①蘭坤①張肖怡①宋瑞瑞①王銳①張宇①

目的：自制雙管套管在大鼠腦部前扣帶皮層雙側(cè)注射藥物。方法：首先自制雙管套管，在立體定位儀的指引下將雙管套管精確定位埋置并插入堵絲，然后用牙科水泥和螺釘將其固定于顱腦頂部；待大鼠術(shù)后體重恢復(fù)，將連接有微量進樣器的注射針插入已埋置好的套管，用微量注射泵將藥物緩慢注射于兩側(cè)前扣帶皮層區(qū)域；給藥完畢后即可觀察大鼠的行為反應(yīng)；如此可反復(fù)多次給藥進行長期實驗觀察。結(jié)果：藥物被準(zhǔn)確注射到目的腦區(qū)，即雙側(cè)前扣帶皮層，實驗過程中大鼠狀態(tài)良好，行為反應(yīng)如預(yù)期。結(jié)論：自制雙管套管的方法簡便易行、經(jīng)濟可靠，實驗取得良好的效果。

前扣帶回皮層； 雙管套管； 腦內(nèi)置管； 大鼠

在一些神經(jīng)生理學(xué)和神經(jīng)藥理學(xué)的實驗中，觀察大腦內(nèi)雙側(cè)分布的核團在神經(jīng)環(huán)路中的作用時，需要進行雙側(cè)腦區(qū)同時給藥以便于研究。由于大腦神經(jīng)環(huán)路較多并且復(fù)雜，而實驗中腦室或某一腦區(qū)局部給藥多用于觀察特定腦區(qū)或核團在某一神經(jīng)功能活動中的作用或研究藥物和內(nèi)源性活性物質(zhì)對神經(jīng)系統(tǒng)的作用[1-2]。局部埋置導(dǎo)管給藥主要有以下優(yōu)點：一是通過導(dǎo)管將藥物注入腦內(nèi)特定區(qū)域，可在小范圍局部干預(yù)目標(biāo)核團或腦區(qū)的功能活動，便于更精確探索目

標(biāo)核團或腦區(qū)在功能活動中起的作用；二是可以分不同時間點多次給藥，觀察藥物作用的時效性，掌握實驗動物對藥物刺激的反應(yīng)；三是埋置導(dǎo)管術(shù)后5～10 d時手術(shù)應(yīng)激已消失，血腦屏障已修復(fù)，可在動物清醒、自然狀態(tài)下觀察動物的行為表現(xiàn)[3]。

實驗若埋置的是單管導(dǎo)管，那么單管導(dǎo)管可以購買（國內(nèi)有生產(chǎn)），也可自己制作，其方法國內(nèi)已有文獻[4]介紹，但有些實驗是需要埋置雙管套管的。雙管套管國內(nèi)還沒有廠家可以生產(chǎn)，若購買國外的產(chǎn)品，價格昂貴，實驗中大量使用會有較大經(jīng)濟負擔(dān)；若用兩個單管分別埋置，像前扣帶皮層（ACC）這樣左右對稱的腦區(qū)間隔距離又小于并排兩個單個給藥導(dǎo)管的導(dǎo)管間距，不利于準(zhǔn)確定位[5-6]。本研究室近年的工作集中于前扣帶皮層神經(jīng)元參與痛情緒反應(yīng)的相關(guān)研究，需要在動物大腦前扣帶皮層部位給予相關(guān)受體的激動劑或者拮抗劑[7-8]。實驗中需要大量的雙管套管，在實驗中，筆者結(jié)合以往的使用經(jīng)驗，在不影響實驗的規(guī)范性的前提下，自制了用于ACC腦區(qū)雙側(cè)給藥的雙管套管，并設(shè)計了將管道固定于立體定位儀上的裝置，提高了實驗的效率，使實驗成本大大降低。下面就制作方法和使用體會進行介紹。

1 材料與方法

1.1 實驗器材

1.1.1 套管系統(tǒng)

1.1.1.1 基本裝置 25 G橙色平頭針頭（也可將注射用25 G針頭加工）；注射內(nèi)芯外徑0.30 mm，可順暢插入25 G注射針頭；注射內(nèi)芯連接PE管（瑞沃德，規(guī)格型號62303），外徑0.5 mm，內(nèi)徑0.25 mm；導(dǎo)管堵頭用直徑0.2 mm或0.3 mm的304不銹鋼鋼絲做成。

1.1.1.2 雙管套管的制作 將25 G橙色針頭的塑料柄削為合適的厚度（大約0.6 mm），然后將兩個經(jīng)過處理的25 G橙色針頭用萬能膠并排粘在一起，使兩個針頭的距離固定為1.2 mm。將不銹鋼絲裁剪約為25 mm的小段，然后彎成U形，在針頭內(nèi)插入U形不銹鋼絲，將多余的堵絲剪掉，使得U型不銹鋼堵絲在針頭平面以下0.2 mm，雙針頭給藥管制作完成，見圖1。

圖1 自行制作實驗用套管實物圖

1.1.1.3 套管系統(tǒng)的直徑和長度選擇 筆者在側(cè)腦室所要置管的目標(biāo)位置是前扣帶皮層即Bregma向前2.6 mm，旁開0.6 mm，深度為顱骨平面下1.6 mm[9]。此長度在250～270 g重的SD大鼠剛好可以垂直達到前扣帶皮層，在250～270 g SD大鼠剛剛穿透皮層進入前扣帶皮層，這樣就基本避免了定位偏差時相對粗大的外管對大腦的損傷。自制給藥系統(tǒng)裝置的示意圖見圖2。

圖2 自制給藥系統(tǒng)裝置的示意圖

1.1.1.4 套管系統(tǒng)給藥過程 裝有給藥管的套管系統(tǒng)，將連接有PE管的注射內(nèi)芯插入自制套管內(nèi)即可給藥，見圖3。

圖3 自制給藥系統(tǒng)裝置給藥過程示意圖

1.1.1.5 套管系統(tǒng)高溫消毒

1.1.2 其他器材 微量給藥泵；顱骨釘，直徑1.4 mm，長度2.5 mm（瑞沃德，型號62512）

1.2 實驗用品 滅菌棉球；用新潔而滅浸泡消毒過的手術(shù)器械；石蠟油；滅菌黑墨水。

1.3 手術(shù)方法 （1）雄性SD大鼠（體重250 g左右），1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（40 mg/100 g）[10]。（2）將動物固定于立體定向儀上，齒桿前上緣低于耳桿中心3.3 mm。頭頂皮膚剃毛，消毒。（3）切開顱頂皮膚筋膜，以無菌干棉球涂擦顱骨表面清楚暴露Bregma點，并用藍墨水標(biāo)記。進針點定位于Bregma點前2.6 mm，矢狀縫兩側(cè)各0.6 mm，見圖4。在擬埋管及固定顱骨釘處（直徑1 mm左右）鉆孔，共鉆5孔，注意將顱骨鉆透但不要傷及腦實質(zhì)。在埋管部位鉆孔完成后可見清亮的腦脊液流出[4]。（4）用消毒棉球止血，干燥

術(shù)野。選用直徑為1.4 mm，長度為2.5 mm的顱骨釘。將裝有堵絲的自制套管系統(tǒng)垂直固定于立體定向儀的縱向坐標(biāo)上，精確定位于Bregma點向前2.6 mm，旁開0.6 mm處。將管道埋入與顱骨緊密相貼。再次干燥術(shù)野。再在術(shù)野表面滴涂石蠟油封閉并保護腦組織。之后采用牙托水泥將套管，顱骨，顱骨釘緊密粘合[3]。將粉劑和溶劑按比例混合后凝固時間為5～10 min。應(yīng)避免粘和物體表面有水，否則粘和不牢。（5）待牙托粉自凝塑料完全凝固后松開固定管道的裝置。（6）術(shù)后腹腔注射青霉素20萬單位/只，防止感染。（7）將大鼠放回籠，休養(yǎng)5～7 d，體重恢復(fù)后再進行后續(xù)實驗。（8）給藥時將內(nèi)芯取出，給藥針從套管進入給藥。給藥結(jié)束后將內(nèi)芯插入。一次給藥結(jié)束，可多次給藥。

圖4 給ACC埋置雙導(dǎo)管的平面位置示意圖

2 結(jié)果

藥物被準(zhǔn)確注射到目的腦區(qū)，即雙側(cè)前扣帶皮層，實驗過程中大鼠狀態(tài)良好，行為反應(yīng)如預(yù)期。

3 討論

在研究神經(jīng)功能活動的環(huán)路時，需要對雙側(cè)核團或腦區(qū)進行同步干預(yù)。在腦立體定位儀的定標(biāo)下將帶內(nèi)芯的導(dǎo)管埋置后，用牙托水泥和小螺絲將管道的外露部分固定于顱骨表面。本實驗自行制作設(shè)計的裝置既能夠?qū)⑺幬镒⑸淙胩囟ǖ哪康膮^(qū)域，從而圓滿完成試驗任務(wù)，又能夠降低所花費的費用。埋管5～10 d后手術(shù)應(yīng)激已消失，血腦屏障已修復(fù)。此時在動物清醒狀態(tài)下將內(nèi)芯抽出，將一連接有微量給藥泵的內(nèi)針即給藥針插入管道到達目的部位注射給藥后將內(nèi)針抽出，再插入內(nèi)芯封閉管道以再次給藥[11-13]。此法基本避免了應(yīng)激及其他因素的干擾，從而使得結(jié)果更加可信。

術(shù)后大鼠對埋置導(dǎo)管的耐受好，行為無異常。術(shù)后7 d拔出堵絲仍可見腦脊液流出[14]。取材時未見管道移位和周圍出血的現(xiàn)象。需要注意的有以下幾個方面。（1）預(yù)試驗階段曾腹腔注射10%的水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉動物，但實驗動物腹脹率高，死亡率高。解決辦法是使用另一種麻醉劑即戊巴比妥鈉溶液腹腔注射。術(shù)前要禁食8 h，麻藥劑量要進行精確地計算，在本實驗中實驗者使用1%戊巴比妥鈉0.45 mL/100g。（2）動物買來后一定要在在實驗室適應(yīng)3～5 d后再手進行手術(shù)，保持其正常的生命活動狀態(tài)。（3）在實驗過程中出現(xiàn)1～2只行為極其癲狂的大鼠，在把實驗大鼠斷頭處理后，觀察ACC區(qū)域，偶爾可見膿液存在，說明出現(xiàn)了顱內(nèi)感染，解決辦法是術(shù)前術(shù)中用的器械必須要嚴格地進行消毒，術(shù)后腹腔注射青霉素20萬單位/（次·只）進行抗炎或用青霉素粉末敷于顱腦表面亦可達到相同效果。（4）在室溫低于20 ℃的情況下，若是大鼠進行手術(shù)，在進行手術(shù)過程中大鼠呼吸抑制狀態(tài)不佳，甚至死亡；解決辦法是手術(shù)過程中及術(shù)后至大鼠蘇醒一定要將溫度保持在37 ℃左右，可借助電暖寶，鼠被等手段。（5）手術(shù)過程中腦立體定位儀的準(zhǔn)確性很重要，因為管道相對于大鼠的側(cè)腦室仍很粗，埋管位置與預(yù)定位置若有偏差可能會傷及腦內(nèi)組織或是其他核團。以上實驗過程的埋管數(shù)據(jù)是根據(jù)Paxinos和watson圖譜決定的，適用于250～270 g左右體重的SD大鼠[11]。埋管旁開的位置為0.6 mm。（6）在手術(shù)過程中，術(shù)中用牙科鉆將標(biāo)記點鉆開至硬腦膜，這個過程一定要輕慢，用針尖刺破硬腦膜至看到澄清腦脊液流出。用力不能過大，過大會損傷顱腦組織影響動物的判斷力進一步影響實驗效果。（7）在見到稱其腦脊液流出之后下管之前要滴石蠟油封閉，因為石蠟油有兩個作用，一是石蠟油可防止水分蒸發(fā)，對腦細胞有保護作用，二是石蠟油有潤滑作用，有利于下管。（8）牙托粉將2顆螺絲和導(dǎo)管包裹固定在一起固定[11-14]。（9）因為核團區(qū)域小，藥物吸收慢，所以在給藥過程中，給藥速度一定要慢，一般控制在1 μL/5 min，注藥結(jié)束后要停留5～10 min再將注射內(nèi)芯移除，這樣有利于藥物被充分吸收[10]。（10）術(shù)后顱腦頂部裝有套管裝置的大鼠要單籠飼養(yǎng)[10]。（11）大鼠術(shù)后恢復(fù)過程中始終要給套管插上堵絲，防止腦脊液返流堵塞套管，而且還要經(jīng)常拔出堵絲保持管道通暢，便于筆者反復(fù)多次給藥。

綜上所述，本實驗室成功的自行設(shè)計制作了雙側(cè)間距固定為1.6 mm的套管系統(tǒng)，恰好能夠精準(zhǔn)插入筆者試驗的目標(biāo)腦區(qū)即前扣帶皮層，進而注射給藥。此設(shè)計成本低，簡單易操作，通過本方法，筆者可以根據(jù)實驗的具體需求調(diào)節(jié)雙管套管之間的距離以及套管的長度，以滿足不同實驗特定腦區(qū)的給藥需求。

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The Cannulation and Administration Techniques with Home-made Double Cannula in the Anterior Cingulate Cortex in Rats

/FENG Xiao-pu， LAN K un，ZHANG Xiao-yi，et al.//Medical Innovation of China，2014，11（18）：042-045

Objective：To catheter and administrate in bilateral anterior cingulate cortex （ACC） with homemade double cannula in rats in our experiment.Method：Firstly the double cannulas were made by ourselves， then under the guidance of the stereotaxic instrument， a double cannula was implanted in ACC region on the top of rats’skull， and was fixed with denture base resins and bolts. When the body weight of rats returned to normal after surgery， the needle connecting with the micro-injector was inserted into cannula， then the reagent was slowly pushed into ACC region by syringe pump. After the administration was finished， behavioral test could be started. Used this technique， local application of reagent in brain region might be repeated for many times. Result：The reagent was injected accurately into the bilateral ACC region. And during the experiment， the behavioral responses of rats were as desired. Conclusion：Home-made double cannula get a good effect in the experiment. The making process is simple， economic and reliable.

Anterior cingulate cortex ； Double cannula； Implanted tube； Rats

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.18.014

2014-04-21） （本文編輯：蔡元元）

國家自然科學(xué)基金資助項目（81371254）

①山西醫(yī)科大學(xué) 山西 太原 030001

張宇

First-author’s address：Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China