張立海王嬌陳福軍鐘敏金松王桂梅王亞洲張雅軍江清林

bFGF聯(lián)合骨髓干細(xì)胞動員劑促進(jìn)大鼠缺血后肢血管新生的分析*

張立海①王嬌①陳福軍①鐘敏①金松①王桂梅①王亞洲①張雅軍①江清林①

目的：了解bFGF聯(lián)合骨髓干細(xì)胞動員劑促進(jìn)大鼠缺血后肢血管新生的作用。方法：將48只大鼠的左側(cè)股動脈與其分支切斷，構(gòu)建大鼠后肢缺血模型，并按隨機(jī)數(shù)字表法分成四組，每組12只，其中A組將重組人bFGF蛋白注入大鼠缺血后肢肌內(nèi)；B組將重組人粒細(xì)胞集落刺激因子（rhG-CSF）注入大鼠皮下；C組大鼠予以bFGF聯(lián)合rhG-CSF；D組予以均等的生理鹽水。治療持續(xù)4周后予以每組大鼠腹主動脈造影，進(jìn)而觀察大鼠側(cè)支血管的具體形成狀況，予以內(nèi)收肌以及腓腸肌肌組織病理切片檢查，借助圖像分析系統(tǒng)，統(tǒng)計各組大鼠血管密度。行免疫組化檢測，分析大鼠血管內(nèi)皮生長因子陽性表述血管數(shù)。結(jié)果：在大鼠側(cè)支循環(huán)血管條數(shù)、血管內(nèi)皮生長因子陽性表述血管數(shù)以及血管密度上，C組＞A組＞B組＞D組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：對于促大鼠缺血后肢血管新生而言，bFGF蛋白與骨髓干細(xì)胞動員劑療效顯著，均可改善大鼠肢體的缺血狀態(tài)，但骨髓干細(xì)胞動員劑聯(lián)合bFGF蛋白改善大鼠缺血肢體更為明顯。

bFGF蛋白； rhG-CSF； 骨髓干細(xì)胞動員劑； 大鼠； 血管新生

本文主要通過將重組人粒細(xì)胞集落刺激因子（rhGCSF）注入大鼠缺血后肢肌內(nèi)，并將重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）注入大鼠皮下，動員大鼠骨髓干細(xì)胞，進(jìn)而觀察bFGF聯(lián)合骨髓干細(xì)胞動員劑對于促進(jìn)大鼠缺血后肢血管新生情況的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及材料 選擇48只大鼠作為研究對象，體重2.4～3.0 kg，平均（2.7±0.2）kg，不局限于雌雄，均為某省動物實(shí)驗(yàn)中心供予。制劑重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）與重組人粒細(xì)胞集落刺激因子（rhG-CSF）均購自百恩維生物科技有限公司，復(fù)

方泛影葡胺（購自西安力邦制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20034058）；兔抗兔血管內(nèi)皮生長因子多克隆抗體與檢測試劑盒購自上海工碩生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 造模及分組 按照大鼠體重，每千克予以大鼠肌內(nèi)注射50 mg氯胺酮，進(jìn)行麻醉后，準(zhǔn)備消毒與鋪巾，在大鼠左側(cè)腹股溝韌帶中點(diǎn)處作約1.5 cm左右的一條縱形切口，使其股動脈暴露后予以分離，用1號絲線將股動脈起始處結(jié)扎，同時將其切斷，完成大鼠后肢缺血模型后，按隨機(jī)數(shù)字表法將其分為A、B、C、D四組，每組12只。

1.2.2 治療方法 A組在股動脈結(jié)扎處予以2000 U bFGF，第3、5、7天分別給藥1次；B組按照大鼠體重，每千克于皮下注射10 L rhG-CSF，持續(xù)5 d，每天分別給藥1次；C組大鼠予以bFGF聯(lián)合rhG-CSF，給藥方法同A、B組；D組予以等量生理鹽水。觀察大鼠生命體征、切口愈合情況、飲食及左后肢運(yùn)動等情況。B、C組術(shù)后2～8 d進(jìn)行一次血常規(guī)檢測，A、D組于術(shù)后2、4、6、8 d各進(jìn)行一次。治療持續(xù)4周后予以每組大鼠腹主動脈造影，進(jìn)而觀察大鼠側(cè)支血管的具體形成狀況，予以內(nèi)收肌以及腓腸肌肌組織病理切片檢查，借助圖像分析系統(tǒng)，統(tǒng)計各組大鼠血管密度。行免疫組化檢測，分析大鼠血管內(nèi)皮生長因子陽性表述血管數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料以（±s）表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 總體觀察分析 術(shù)后，A組1只腸梗阻死亡，B 組1只突然死亡，C組1只大鼠麻醉意外死亡，D組1只腹瀉死亡，四組大鼠均未出現(xiàn)后肢缺血性壞死現(xiàn)象。術(shù)后四組大鼠手術(shù)切口均愈合較好，大鼠左后肢均出現(xiàn)毛發(fā)脫落。但D組3只跛行，1只下肢足背部潰瘍，其余三組愈合較好。

2.2 血常規(guī)分析 術(shù)后6 d，B組與C組大鼠白細(xì)胞在35.4×109/L左右，于術(shù)后8 d兩組大鼠均恢復(fù)正常。A組與D組大鼠血常規(guī)未見變化，處在7.8×109/L左右。2.3 各組側(cè)支血管數(shù)比較 經(jīng)X線片分析得出，四組大鼠的左側(cè)股動脈均發(fā)生連續(xù)性中斷現(xiàn)象，側(cè)支循環(huán)血管數(shù)量不同。經(jīng)腹主動脈造影后，在X線片上的經(jīng)股骨中點(diǎn)出繪制一條直線，使其與股骨縱軸相垂直，發(fā)現(xiàn)C組側(cè)支血管數(shù)多于A、B組；A組多于B組；A、B、C三組側(cè)支血管數(shù)均多于D組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.4 各組血管密度與血管內(nèi)皮生長因子陽性表述血管數(shù)比較 C組血管密度高于A、B組，A組高于B組，A、B、C三組血管密度均高于D組（P＜0.05）；在血管內(nèi)皮生長因子陽性表述血管數(shù)上，四組依次為：C組＞A組＞B組＞D組（P＜0.05），見表1。

表1 四組各觀察指標(biāo)的比較（±s）

表1 四組各觀察指標(biāo)的比較（±s）

組別 切片數(shù)（個） 側(cè)支血管數(shù)（條） 血管密度（n/mm2） 血管內(nèi)皮生長因子陽性表述血管數(shù)（條）A組（n=12） 16 8.670±0.978 134.120±4.957 16.54±2.61 B組（n=12） 14 7.490±1.310 126.130±5.412 11.45±2.28 C組（n=12） 16 9.900±1.601 140.000±4.897 21.12±2.30 D組（n=12） 16 6.120±1.012 122.210±5.941 9.01±2.01

3 討論

肢體缺血性疾病作為臨床上常見的一種致殘性疾病，其臨床表現(xiàn)主要為3個方面：靜息痛、皮膚潰瘍及壞疽。在現(xiàn)階段，肢體缺血性疾病發(fā)生率、死亡率高與截肢率均較高，嚴(yán)重威脅著患者的生命[1]。隨著血管成形術(shù)與外科搭橋術(shù)的不斷發(fā)展，一種新型的血管新生療法孕育而生。通過運(yùn)用bFGF、VEGF（血管內(nèi)皮生長因子）等來促進(jìn)缺血組織的血管新生，使其形成側(cè)支血管，達(dá)到改善缺血組織目的[2]。FGF依據(jù)等電點(diǎn)的不同一般分為bFGF與aFGF。bFGF生物學(xué)活性較大，作為一種微量蛋白，對血管內(nèi)膜細(xì)胞表達(dá)組織具有誘導(dǎo)作用，使其重建蛋白水解酶與血漿酶原激活劑等，促使在血管內(nèi)皮細(xì)胞長入膠原基質(zhì)中管腔的形成，實(shí)現(xiàn)新生血管的生長[3-4]。而rhG-CSF作為一種骨髓干細(xì)胞動員劑，可促使外周血干細(xì)胞的提高[5-6]。本文研究顯示，運(yùn)用bFGF蛋白可增加側(cè)支血管，A組＞D組（P＜0.05），改善缺血狀態(tài)。同時，加大了VEGF蛋白表達(dá)，C組＞A組＞B組＞D組（P＜0.05），加快了毛細(xì)血管的新生速度。由此表明，將bFGF注射在缺血組織內(nèi)，適時增加局部外源性bFGF蛋白量，大鼠皮下注入rhG-CSF，積極誘導(dǎo)了干細(xì)胞的分化，有助于血管新生，這與相關(guān)研究結(jié)論具有一致性。

綜上所述，bFGF蛋白與骨髓干細(xì)胞動員劑促大鼠缺血后肢血管新生療效顯著，有助于改善大鼠肢體缺血狀態(tài)。

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Analysis of bFGF J oint Bone Marrow Stem Cells Mobilization Agent Promote Ischemic Hind L egs Angiogenesis in Rats

/ZHANG Li-hai，WANG J iao，CHEN Fu-jun，et al.//Medical Innovation of China，2014，11（18）：021-023

Objective：To investigate the bFGF combined with bone marrow stem cells mobilization promote vascular ischemic hind limb of the newborn rats.Method：48 rats of the left femoral artery and its branches were cut off，establishment of rat model of hindlimb ischemia and were randomly divided into four groups， 12 rats in each group， the group A of recombinant human bFGF protein was injected into rat ischemia hind limb muscle； in the group B， recombinant human granulocyte colony stimulating factor （rhG-CSF） was injected into rat subcutaneous； the group C rats was given bFGF combined with rhG-CSF； the group D was given normal saline to be equal. The treatment lasted for 4 weeks and then every rat abdominal aortography， specific situation and then the collateral vessels in rats were observed， treated with internal adductor muscle and gastrocnemius muscle tissue pathological examination， with the help of image analysis system， vascular density statistics rats. The rat vascular endothelial growth factor positive expression the number of blood vessels were analyzed by immunohistochemical detection.Result：In the collateral vessels of rats， the number of positive expression of vascular endothelial growth factor vascular number and vascular density， the group C＞A＞B＞D， there were statistically significant differences （P＜0.05）.Conclusion：The vascular hind limb ischemia in neonatal rats， bFGF protein and bone marrow stem cell mobilization effect significantly， can improve rat limb ischemia， but bone marrow stem cell mobilization agent with bFGF protein in ischemic rat limb is more obvious.

BFGF； RhG-CSF； Bone marrow stem cells mobilization； Rat； Angiogenesis

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.18.007

2014-04-10） （本文編輯：蔡元元）

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目（12521551）

①佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 黑龍江 佳木斯 154003

江清林

First-author’s address：The First Hospital Affiliated to J iamusi University，J iamusi 154003，China