高超王霞李立紅周秀彥

PNPLA3基因多態(tài)性與原發(fā)性肝癌遺傳易感性的相關性研究*

高超①王霞①李立紅①周秀彥②

目的：評估PNPLA3 I148M基因多態(tài)性與原發(fā)性肝細胞癌（HCC）相關性，并探討其機制。方法：本研究納入HCC患者67例和健康對照組69例，對照組無肝癌家族史及肝病病史。通過聚合酶鏈反應（PCR）及基因測序法檢測PNPLA3 rs738409基因表型，通過Hardy-weinbeurg遺傳平衡定律分析HCC組與對照組各基因型是否具有群體代表。通過 χ2檢驗分析HCC組rs738409各基因型的頻率分布有無差異。結果：對HCC組及對照組經(jīng)吻合度檢驗，各組基因多態(tài)性分布均符合Hardy-Weinberg（H-W）平衡法則（P＞0.05）。HCC組與對照組148 GG、148 CG、148 CC基因型頻率分布差異均有統(tǒng)計學意義（ χ2=6.30，P＜0.05）。結論：rs738409基因表型與原發(fā)性肝癌發(fā)病風險具有相關性。

PNPLA3； 基因測序； 原發(fā)性肝癌

肝細胞癌（HCC）是最常見的肝臟惡性疾病，與乙肝和丙肝病毒、酒精、肥胖及罕見的遺傳性肝臟疾病相關。環(huán)境毒素、糖尿病和家族史也是不可忽視的因素，此外國內(nèi)外大量研究證實遺傳變異與肝癌易感性密切相關[1-2]。特別是編碼patatin樣磷脂酶域3 （PNPLA3）148M蛋白的基因rs738409與原發(fā)性肝癌的關系逐漸引起大家的關注。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年5月-2013年10月山西醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科、腫瘤科病房原發(fā)性肝癌（HCC）患者67例為HCC組，其中男62例，女5例，年齡43～78歲，平均（59.1±8.8）歲，有至少兩種影像學確診或經(jīng)病理學確診，符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2011年版）》的診斷標準[3]。對照組為2012 年6月-2013年11月隨機招募的無肝癌家族史及肝病病史的健康志愿者69例，其中男62例，女7例，年齡45～75歲，平均（58.2±7.8）歲。兩組研究對象的年齡、性別比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。1.2 方法 采取靜脈血5 mL，使用DNA提取試劑盒（上海生工SK1261）提取全血DNA，引物序列rs738409-F：5'GAACCAGCCAGTTTACCTTACA 3'；rs738409-R：5'GTTAGTTCCCCGTTCTTTTGA3'。使用DNA Polymerase

高溫聚合酶（上海生工SC0014）、10×PCR Buffer、MgCl2（25 mM）、dNTP（10 mM）、Marker、6×DNA Loading Dye（上海生工）進行目的基因的擴增，使用PCR反應擴增儀（加拿大BBI公司）；擴增片段長度為464 bp。擴增條件：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，72 ℃修復延伸1 min。使用3PRISM3730測序列分析儀（美國ABI公司）檢測PNPLA3 rs738409基因表型。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理，分別統(tǒng)計健康對照組、HCC組rs738409各基因型的頻率，并算出其等位基因的頻率，各數(shù)據(jù)用百分數(shù)表示。通過Hardy-weinbeurg遺傳平衡定律分析HCC組與對照組各基因型是否具有群體代表。兩組rs738409基因型分布采用 χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組基因多態(tài)性分布情況 兩組經(jīng)吻合度檢驗，得出其多態(tài)性分布均符合Hardy-Weinberg（H-W）平衡法則（P＞0.05）。

2.2 PNPLA3基因rs738409 G/C多態(tài)性與原發(fā)性肝癌相關性的分析 經(jīng)PCR擴增后的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測圖像見圖1。測序可得到148CC、148GC、148GG 3種基因型，見圖2。HCC組與對照組148GG、148CG、148CC基因型頻率分布比較差異均有統(tǒng)計學意義（ χ2=6.30，P＜0.05），見表1。

圖1 經(jīng)PCR擴增后的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測圖像

圖2 rs738409分型測序圖

3 討論

HCC是指發(fā)生于肝臟的惡性腫瘤，其死亡率在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中位列第3位。我國每年約有11萬人死于肝癌，已成為嚴重威脅我國居民健康的疾病之一[3-4]。因此HCC的早發(fā)現(xiàn)、早治療已經(jīng)成為臨床研究的熱點。且HCC患者在北美地區(qū)開始出現(xiàn)年輕化趨勢，除了密切關注肥胖、代謝綜合征等高危因素，遺傳易感基因是不容忽視的重要因素[3]。隨著遺傳因素在HCC發(fā)病過程中所起的作用逐漸被大家認可，越來越多的HCC高?；虺蔀檠芯繜狳c，但多數(shù)未經(jīng)大樣本病例對照研究所證實。隨著DNA單核苷酸多態(tài)性（SNP）在復雜疾病中的作用的逐漸被研究發(fā)現(xiàn)，使其成為HCC基因學研究的新熱點。其中PNPLA3 rs738409GG型與HCC發(fā)病的相關性在國外已經(jīng)過大樣本病例對照研究所證實[5-6]。

表1 PNPLA3 rs738409基因型頻率的分布

PNPLA3屬于patatin樣磷脂酶家族，其編碼基因位于22號染色體長臂1區(qū)3帶3亞帶1次亞帶（22ql3.31），編碼一個功能未知的非分泌性蛋白，該蛋白由481個氨基酸組成，又稱之為脂肪滋養(yǎng)蛋白，這類蛋白具有非特異的?；饷傅幕钚訹7]。PNPLA3有一段高度保守的水解序列（Gly-Ser-Gly），PNPLA3的活性中心絲氨酸（Ser47）主要位于該段序列中。絲氨酸與天冬氨酸（Aspl66）結合，兩者的結合部位位于由異亮氨酸（nel48）等若干個疏水殘基側鏈形成的底物結合凹槽的邊緣上。該二元體（Ser-Asp）是patatins發(fā)揮催化作用重要部位[8]。

目前有研究發(fā)現(xiàn)，PNPLA3編碼一個在肝細胞膜上顯著表達的跨膜蛋白具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、炎癥介質(zhì)等作用。當其編碼基因rs738409發(fā)生G和C的錯譯時，會導致其編碼的蛋白質(zhì)在148位上出現(xiàn)蛋氨酸代替異亮氨酸。進而導致其功能發(fā)生變化[6，9]。還有研究發(fā)現(xiàn)該基因與肝臟炎癥、肝纖維化進展相關，但具體機制還不清楚。PNPLA3導致肝癌的機制尚不明確，然而，PNPLA3與非酒精性脂肪肝（NAFLD）、酒精性肝?。ˋLD）的發(fā)病及進展關系密切，而酒精和非酒精脂肪肝疾病都有肝臟的脂肪變性，脂肪變性可以通過脂質(zhì)過氧化反應和或細胞因子激活引起肝細胞的炎癥，進而發(fā)生纖維化這一相似的病理特征[10]。這表明它可能通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、炎癥介質(zhì)等直接導致肝細胞癌變[4，11-15]。但是否有其他途徑直接致癌途徑尚不清楚。國外研究已證實該基因多態(tài)性對HCC的影響獨立于其

纖維化的影響[11-13，16-17]，這進一步表明它可能通過其他未知途徑直接導致肝細胞癌變。但其致癌作用是否獨立于肝硬化仍存在爭議[12，14，18]。此外，國外研究發(fā)現(xiàn)PNPLA3與HCC的淋巴轉移、血管侵犯、癌細胞分化程度等他肝細胞癌預后指標相關。rs738409GG型的患者癌細胞分化程度明顯比rs738409CC型更差，更容易出現(xiàn)癌細胞的轉移，因此預后更差[5]。但鑒于HCC預后受多種因素影響，評估具有復雜性，目前尚缺乏多中心的大樣本病例對照研究證實，且具體機制尚不清楚，因此仍需進一步研究以證實。

筆者通過Hardy-Weinberg（H-W）平衡檢測，驗證了兩組PNPLA3 rs738409基因多態(tài)性均具有群體代表性。通過基因測序檢測證實rs738409分為GG、GC、CC三型。通過統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，HCC組的rs738409 GG型分布明顯高于健康對照組，說明PNPLA3 rs738409基因多態(tài)性與HCC發(fā)病有密切相關性。rs738409GG可能是HCC發(fā)病的高危因素之一。該結果與國外的研究結果一致，說明該基因不僅是歐美人群HCC的高?；?，也可能是我國人群中HCC發(fā)病的高危基因。由于本次研樣本量小，抽樣誤差可能較大。因此針對該基因的國內(nèi)多中心大樣本的病例對照研究是必要的。此外PNPLA3在HCC發(fā)病中的作用機制仍不清楚，因此進一步的動物實驗及體外實驗研究是非常重要的。它可能有助于揭示HCC發(fā)病的新機制，發(fā)現(xiàn)HCC新的治療方法。

目前國內(nèi)PNPLA3基因多態(tài)性的研究多停留在與NAFLD、ALD、肝纖維化之間相關性的研究，鮮有該基因多態(tài)性與HCC之間的研究，因此進一步研究與探討PNPAL3基因在HCC中的作用及機制是非常必要的。隨著分子生物學技術的發(fā)展其機制會進一步明確，這將有助于篩選HCC高危人群或易感個體，并為個性化的癌癥治療提供依據(jù)。

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The Correlation Study of PNPLA3 Gene Polymorphism and Genetic Susceptibility to Hepatocellular Carcinoma

/GAO Chao，WANG Xia，LI Li-hong，et al.//Medical Innovation of China，2014，11（18）：012-014

Objective：To explore the relationship between PNPLA3 I148M gene polymorphism and hepatocellular carcinoma （HCC）， and discuss its pathogenesis.Method：67 patients with HCC and 69 cases of healthy control were selected as the subjects. The healthy control subjects had no family history of liver cancer and liver disease history. The sequence fragments of PNPLA3 rs738409 gene polymorphism in all cases were detected by utilizing the polymerase chain reaction （PCR） and gene sequencing orderly. Whether each genotype of the HCC group and the control group had group representation or not was based on Hardy-weinbeurg genetic equilibrium analysis. The genotype frequencies in cases and controls were compared by Chi-square test.Result：The HCC group and the control group were conformed with Hardy-Weinberg （H-W） balance （P＞0.05）. The 148 GG， 148 CG， 148 CC genotype frequency distribution had differences between the HCC group and the control group （ χ2=6.30，P＜0.05）.Conclusion：The rs738409 genetic phenotypes is obviously associated with primary liver cancer risk.

PNPLA3； Gene sequencing technology； Hepatocellular carcinoma

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.18.004

2014-03-31） （本文編輯：蔡元元）

山西省衛(wèi)生廳資助項目（200969）

①山西醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)學院 山西 太原 030002

②山西醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院

周秀彥

First-author’s address：The Second Clinical Medical College of Shanxi Medical University，Taiyuan 030002，China