劉長姣，郭鑭，袁述，孟憲梅，余平

(1. 吉林工商學院 糧油食品深加工吉林省高校重點實驗室 吉林 長春 130062；2. 吉林工商學院 食品工程分院，吉林 長春 130062)

牛奶及其制品營養(yǎng)豐富，已經(jīng)成為人們?nèi)粘Ｉ钪械闹饕澄镏弧Ｔ谀膛ｏ曫B(yǎng)過程中，為促進奶牛生長、提高牛奶產(chǎn)量，人們會違規(guī)使用激素類藥物，進而導致牛奶中激素殘留問題日益嚴重。根據(jù)實驗室研究和流行病學調(diào)查結(jié)果，激素類藥物殘留可通過食物鏈(動物體內(nèi)殘留)和環(huán)境(飲用水及排泄物)對人體健康和動物健康、社會和生態(tài)環(huán)境造成直接和潛在的危害[1-4]。2004目前世界上許多國家和地區(qū)已經(jīng)禁用了相關(guān)激素類物質(zhì)或?qū)ζ渥龀隽藝栏褚?guī)定。例如歐盟、日本和中國對牛奶中皮質(zhì)激素中的倍他米松的最大殘留限量為 0.3μg/kg，食品法典委員會（CAC）規(guī)定最大殘留限量為0.05μg/kg，對雌激素中的己烯雌酚中國和日本均要求不得檢出。在檢測牛奶中獸用激素類藥物殘留的過程中，因為激素類藥物結(jié)構(gòu)相似、理化性質(zhì)與許多內(nèi)源性成分相近，其殘留濃度可能接近或稍高于生理水平，所以對結(jié)果評判的準確性要求較高，并且需要有效的樣品前處理和高靈敏度的分析設(shè)備來保證理想的分析靈敏度、選擇性、專屬性和準確性。由此可見利用有效的檢測技術(shù)來準確的測定和監(jiān)控牛奶中激素類藥物的殘留是檢測領(lǐng)域的熱點和難點[5]。

檢測技術(shù)的進步是解決此問題的關(guān)鍵。隨著色譜技術(shù)和色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的進步，液相色譜、氣相色譜及其與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在牛奶中激素殘留檢測過程中發(fā)揮了重要作用。本文綜述了色譜和色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在檢測牛奶中五類激素的研究進展。

1 牛奶中激素類藥物殘留的原因及危害

牛奶中殘留的激素來源主要來自兩方面，一是奶牛自然生長過程中產(chǎn)生的激素，二是人為添加激素。在奶牛喂養(yǎng)過程中，人為添加激素有助于提高牛奶的產(chǎn)量、飼料轉(zhuǎn)化率和藥理作用人工化，如人為的抑制動物發(fā)情、增強食欲等，從而提高經(jīng)濟效益。無論是在允許或禁止使用激素類物質(zhì)作為促生長劑的國家和地區(qū)，經(jīng)濟利益的驅(qū)動通常會導致激素類藥物的濫用[5]。研究結(jié)果顯示，牛奶中殘留的性激素對人體的生殖系統(tǒng)和生殖功能造成嚴重影響，食用殘留性激素的牛奶或其制品，顯著增加患前列腺癌或更年期乳腺癌的幾率[5-6]。青春期前兒童體內(nèi)產(chǎn)生雌激素少，暴露于外源性激素，可能使其生長加速或出現(xiàn)乳房發(fā)育。

2 色譜及其與質(zhì)譜聯(lián)用在激素殘留檢測中的優(yōu)勢

現(xiàn)代色譜技術(shù)主要包括氣相色譜(GC)、高效液相色譜(HPLC)、各種薄層色譜(TLC)以及超臨界流體色譜(SFC)等各種色譜和色譜聯(lián)用技術(shù)。在牛奶及奶制品毒害物質(zhì)殘留檢測方面，氣相色譜與液相色譜及它們與質(zhì)譜(MS)聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用最多[7-8]，各檢測技術(shù)的優(yōu)缺點見表1。高效液相色譜法和氣相色譜法具有選擇性高、分離效率高、靈敏度高等特點，但包括它們在內(nèi)的色譜技術(shù)的主要缺點是定性能力較差。而質(zhì)譜的多種掃描方式和質(zhì)量分析技術(shù)，可以有選擇的只檢測所需要的目標化合物的特征離子，而不檢測不需要的質(zhì)量離子，如此專一的選擇性，不僅能排除基質(zhì)和雜質(zhì)峰的干擾，還極大地提高了檢測靈敏度。色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法是將高分離能力的色譜技術(shù)與高靈敏、高專屬性的質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)接起來，成為一種多用途、高靈敏的定性、定量分析方法。色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的優(yōu)勢體現(xiàn)在可獲得質(zhì)量、保留時間、強度三維信息，所以已越來越多地被應(yīng)用于牛奶及奶制品激素類藥物殘留的檢測。在方法的選擇上使用最多的是液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜、氣相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜、氣相色譜-高分辨質(zhì)譜等[9-14]。

表1 不同色譜檢測技術(shù)的優(yōu)缺點Table 1 The advantages and disadvantages of different chromatography detection methods

GC/MS 分離效能高、選擇性強、靈敏度高、定性和定量能力強樣品需要氣化，應(yīng)用范圍有限制、樣品前處理要求高、設(shè)備昂貴。[12]

3 牛奶中激素殘留色譜檢測方法的研究現(xiàn)狀

目前有殘留限量的激素類藥物種類，按照其種類可分為皮質(zhì)激素、孕激素、雄激素、雌激素和β－受體激動劑。而牛奶中五類激素殘留濃度極低，所以牛奶中激素類藥物殘留的檢測屬復雜基質(zhì)中痕量組分的分析。牛奶中激素類藥物殘留的檢測方法主要分為免疫分析法和色譜質(zhì)譜分析法。免疫分析法是單一測定方法僅能測定幾種特定的激素類藥物[15]，色譜法可以進行多組分分析。所以近年來，色譜法已被廣泛應(yīng)用，逐步取代了單一的測定方法[16]。近幾年國內(nèi)外學者應(yīng)用液相色譜、液質(zhì)聯(lián)用、氣相色譜和氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對牛奶中這五類激素類藥物的檢測進行了深入研究，檢測技術(shù)不斷得到發(fā)展和進步。

3.1 皮質(zhì)激素

皮質(zhì)激素臨床主要用于升高血糖降低血酮以刺激奶牛的食欲，誘導分娩和抗炎；常用藥物有倍他米松、地塞米松、氫化可的松、潑尼松龍、甲基潑尼松龍等。崔曉亮等采用超高效液相色譜——串聯(lián)電噴霧四極桿質(zhì)譜在多反應(yīng)監(jiān)測模式下測定了牛奶中12種糖皮質(zhì)激素的殘留。樣品經(jīng)提取、濃縮和凈化處理得測試樣品，以Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18為色譜柱，以甲醇和含 0.1%甲酸的水為流動相進行梯度洗脫。方法的檢出限為0.02～0.38μg/kg，最低定量限為0.07～1.27μg/kg；添加水平為2μg/kg和0.4μg/kg時，12種糖皮質(zhì)激素的加標回收率為69.3%～94.3%，相對標準偏差為3.5%～16.7%[17]。馬育松等采用液相色譜—質(zhì)譜/質(zhì)譜法測定牛奶和奶粉中地塞米松殘留量。樣品用乙腈提取，C18 固相萃取柱凈化，得測試樣品，采用基質(zhì)匹配外標曲線法定量。在 2.0～400ng/mL 濃度范圍內(nèi)呈良好線性，方法的測定低限：牛奶為 0.2μg/kg，奶粉為 1.0μg/kg。牛奶樣品在添加濃度為0.2～10μg/kg的范圍內(nèi)，回收率為 70.0%～110.0%；奶粉樣品在添加濃度為1.0-10μg/kg的范圍內(nèi)，回收率為 65.0%～100.0%，相對標準偏差在 8.65%～12.8%之間[18]。

3.2 孕激素

孕激素臨床主要用于先兆流產(chǎn)和習慣性流產(chǎn)、功能性子宮出血、子宮內(nèi)膜異位癥、避孕等[19]。常用藥物包括黃體酮、甲羥孕酮、甲地孕酮等。陳曉紅等建立牛奶中21а-羥基孕酮、17а-羥基孕酮、炔孕酮、甲羥孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲羥孕酮和孕酮8種孕激素殘留的超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。樣品經(jīng)提取、凈化，在 Shim-pack XR-ODSⅡ快速柱上，以內(nèi)含0.1% (V/V)甲酸和5mmol/L乙酸銨的乙腈/水溶液進行梯度洗脫分離，采用正離子模式多反應(yīng)監(jiān)測模式測定。各待測物在0.5～50.0μg/kg范圍內(nèi)具有良好的線性，回收率為 73.0% - 97.5%，相對標準偏差在 3.8%～8.6%之間，最低定量檢出限為0.1μg/kg～ 0.5μg/kg。方法簡便、快速、干擾少、特異性強，適合于牛奶中痕量孕激素殘留的檢測[20]。

3.3 雄激素

雄激素臨床主要用于睪丸功能不全、功能性子宮出血、子宮肌瘤、卵巢癌、再生障礙性貧血及老畜骨質(zhì)疏松癥等[19]。常用藥物包括睪酮、甲基睪酮、和同化雄激素苯丙酸諾龍等。呂惠卿等采用固相萃取——液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，建立了牛奶中睪酮、孕酮、諾龍、甲基睪酮、勃地龍、群勃龍、美雄酮、康力龍 8 種同化激素殘留量的快速測定方法。樣品采用叔丁基甲醚提取，通過 C18固相萃取柱凈化，氮吹至干，殘留物用甲醇—水(10:90，V/V)溶解后測定。采用 MRM 模式進行定性定量分析。該方法的檢出限為 0.2～0.5μg/L，定量限為 0.5～1.0μg/L；在 2.0～200.0μg/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；在 1.0 ～5.0μ g/L 的添加水平上，8 種激素的平均回收率在 59.1%～97.7% 之間，相對標準偏差為 3.2%～11.9%[21]。

3.4 雌激素

雌激素臨床主要用于卵巢功能不全和促進發(fā)情、功能性子宮出血、退乳及乳房腫痛及老畜的骨質(zhì)疏松癥的治療等[22]。常用藥物包括β－雌二醇、雌三醇、己烯雌酚、己烷雌酚等。薛敏等以β-雌二醇和炔雌醇的分子印跡聚合物為填料制備固相萃取小柱，對牛奶中雌激素進行富集，應(yīng)用高效液相色譜法，建立了基于分子印跡固相萃取技術(shù)檢測牛奶中雌激素的新方法，檢出限低于 0.1mg/L，回收率高于 80%[23]。周建科等建立了牛奶中5種雌性激素( 雌三醇、雌二醇、炔諾酮、雌酮、己烯雌酚) 同時測定的高效液相色譜法。樣品經(jīng)脫蛋白和濃縮后得測定樣品，采用反相高效液相色譜法，以乙腈- 水(1︰1，V/V) 為流動相，5種雌性激素分離效果良好，平均回收率范圍為67.0 %～95.5 %，方法檢出限為1.0-2.0μ g/L[24]。劉敏等建立了中空纖維液相微萃取-高效液相色譜聯(lián)用(HP-LPME-HPLC)檢測牛奶中的雌二醇的含量。采用自制的中空纖維萃取裝置，用100μL正辛醇作為萃取溶劑，在600r/min攪拌速度下萃取1h，雌二醇的富集倍數(shù)可達200倍，最低檢出限0. 571 ng/ml[25]。劉勇軍等通過液液萃取和固相萃取提取、凈化牛奶中添加的雌三醇，衍生化后，經(jīng)氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用對衍生物檢測分析，檢出限為0.5μg/L， 衍生物的峰面積與樣品質(zhì)量濃度在1～1000μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，不同雌三醇的加標回收率在78.2%～86.7%之間[26]。

3.5 β－受體激動劑

β－受體激動劑是一組選擇性β 2－腎上腺素受體激動劑，常用藥物有克倫特羅，沙丁胺醇及其鹽、酯，西馬特羅及其鹽、酯及制劑。該類藥物內(nèi)服或注射均易被吸收，排泄速度快，用藥量5～15倍時會導致動物可食性組織蓄積大量藥物殘留，食用后會引起人體心血管和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒副作用。朱勇等建立了同時測定牛奶中克倫特羅、氯霉素和己烯雌酚殘留量的同位素稀釋超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。牛奶樣品無需蛋白沉淀，直接經(jīng)HLB 小柱凈化及水和正己烷淋洗，由乙酸乙酯洗脫后進行分析。采用 Acquity UPLC BEH C18色譜柱進行分離，以乙酸銨溶液－乙腈作為流動相進行梯度洗脫，MRM 方式測定，同位素稀釋內(nèi)標法定量?？藗愄亓_、氯霉素和己烯雌酚在牛奶樣品中的檢出限分別為 0.009、0.007和 0.04ng/g。牛奶中 3 種藥物在 0. 05～0.10(克倫特羅)、0.30～0.60(氯霉素)、0.50～1.0ng/g(己烯雌酚)加標水平下的回收率為 94%～107%，相對標準偏差均小于 10%[27]。岳秀英等應(yīng)用GC一MS測定牛奶中鹽酸克倫特羅。樣品經(jīng)提取、凈化和衍生化后，牛奶中其3個添加濃度水平(0.005、0.01和0.02μ g/mL)的回收率為70%～170%，相對標準偏差為20%(n=5)，最低檢出限為5ng/mL，滿足殘留分析的要求[28]。

4 展望

牛奶及其制品中激素殘留是涉及人類健康的公共衛(wèi)生問題，準確、快速的檢測方法是控制和解決牛奶中激素殘留問題的根本途徑。色譜技術(shù)因具有分辨率高、靈敏度高、分析速度快、重復性好、檢測限低、選擇性強、定性和定量能力強等優(yōu)點而廣泛的應(yīng)用于牛奶中激素類藥物殘留的檢測。同時檢測技術(shù)從單一激素殘留檢測發(fā)展到多種激素殘留的同時速測定。除了檢測技術(shù)的進一步發(fā)展，檢測樣品的前處理技術(shù)也得到關(guān)注并有一定的進步。因為有效的樣品前處理技術(shù)直接影響檢測結(jié)果的準確性。分子印跡、固相萃取及微分子印跡、固相微萃取等技術(shù)在樣品凈化和濃縮處理方面的應(yīng)用提高了牛奶中激素殘留的檢測準確度，也進一步促進了色質(zhì)譜聯(lián)用法在牛奶中激素及其他危害物質(zhì)檢測中的應(yīng)用。

對牛奶中激素類藥物殘留的檢測應(yīng)本著準確、方便、快速的原則，在現(xiàn)有研究成果的基礎(chǔ)之上可朝以下幾方面發(fā)展 ：提高接口術(shù)的改進和完善、繼續(xù)加強與其他先進的前處理萃取技術(shù)的聯(lián)用研究、小型、微型色譜柱的開發(fā)、MS譜庫識別技術(shù)的發(fā)展、基質(zhì)效應(yīng)的徹底解決，以上都是研究人員值得關(guān)注和發(fā)展的方向。相信隨著色譜技術(shù)的日益成熟，其必會在檢測牛奶中激素殘留方面發(fā)揮重要的作用。

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