劉浩凱，胡樹恒 ，董雷鳴，張 輝，曾燕如，喻衛(wèi)武，戴文圣

（1.浙江農林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安 311300；2.浙江省臨安市森林資源保護管理總站，浙江 臨安 311300）

榧樹Torreya grandisFort. ex Lindl.隸屬于紅豆杉科Taxaceae榧屬Torreya，雌雄異株，為第三紀孑遺植物，分布于江蘇南部、浙江、福建北部、江西北部、安徽南部，南至湖南西南部及貴州松桃等[1]中亞熱帶和北亞熱帶地區(qū)[2]。香榧T.grandis‘Merrilli’是榧樹的一個優(yōu)良自然變異類型經無性繁殖培育而成的栽培類型，也是迄今為止榧樹這個種乃至榧屬中唯一一個商品化生產的栽培類型，其生產上的授粉樹是雄性榧樹。

由于香榧具有很高的經濟價值，相關的研究報道較多。隨著對榧樹資源認識的加深及分子標記技術的發(fā)展，研究人員先后采用AFLP（擴增片段長度多態(tài)）[3-5]、ISSR（簡單重復序列區(qū)間擴增）[5-7]、RAPD（隨機擴增多態(tài)DNA）[8-9]標記對包括香榧在內的榧樹開展了研究，但所有這些標記均為顯性標記，至今尚無適用于榧樹群體遺傳研究的共顯性標記的報道。沈登鋒率先建立了適用于榧樹的SRAP（序列相關擴增多態(tài)性）標記分析體系，并利用該標記對榧樹的種質資源及生長快速的野生榧樹種質開展了研究[7]。在這些標記中，相比AFLP操作的復雜性，RAPD、ISSR、SRAP標記的操作要簡單得多，但SRAP不同于RAPD、ISSR標記，可顯示大量的共顯性[10-11]。

香榧的存在已有千年，在長期無性繁殖過程中不可避免地出現了分化。因此，品種改良和創(chuàng)新勢在必行，而品種改良和創(chuàng)新均必須以豐富的種質資源為基礎。此外，實生榧樹種內性狀變異極其復雜，豐富的基因資源是創(chuàng)新品種的遺傳基礎。因此，在分子水平上研究雌性榧樹的遺傳多樣性具有重要的選育種價值?；赟RAP標記的雌性榧樹遺傳多樣性研究尚未見報道。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗材料為榧樹的嫩葉，采自榧樹主要分布區(qū)安徽省黃山市小榮村（29個樣品）和樵山村（24個樣品），浙江省淳安縣臨岐鎮(zhèn)朱塔村（22個樣品），臨安市太湖源村（11個樣品）的天然榧樹群體（見圖1），樣株之間彼此至少相距100 m，共86個雌株樣品。榧樹嫩葉采集后放入帶有硅膠的自封袋中，帶回實驗室后置于－40 ℃冰箱貯存，用于后續(xù)基因組DNA的提取。

圖1 4個雌性榧樹居群的地理位置Fig. 1 Geographic distribution of 4 populations of T. grandis

1.2 方 法

1.2.1 DNA提取

在DNA提取過程中，樣品的研磨采用冷凍混合球磨儀（MM400，德國Retsch），震動頻率設置為30 Hz，震動研磨時間設置為40 s。樣品研磨后參照沈登鋒的改良CTAB法提取榧樹嫩葉DNA[7]，提取的DNA用分光光度計（NanoDrop，ND-100） 測 定 DNA濃 度、OD260值、OD280值及其比值，并用1%瓊脂糖凝膠150 V電泳，電泳結果在AlphaImager成像系統(tǒng)（Alpha Innotech Corporation, USA）中拍照貯存。

1.2.2 SRAP-PCR擴增

SRAP-PCR擴增體系及程序在沈登鋒建立的SRAP反應分析體系[7]基礎上進行改進，改進后的反應體系為：模板DNA（10 ng·μL－1）2 μL，MgCl2（25 mmol·L－1）1.76 μL，Taq 酶（5 U·μL－1，上海申能博彩生物科技有限公司）0.2 μL，上下游引物（10 μmol·L－1）各 0.4 μL，dNTPs（10 mmol·L－1，生工生物工程 (上海 )股份有限公司）0.72 μL，10×PCR buffer 2 μL，ddH2O 12.52 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min；共5個循環(huán)，每個循環(huán)94 ℃變性45 s，35 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min；隨后35個循環(huán)，每個循環(huán)94 ℃變性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保持。

在本試驗中，PCR擴增產物的電泳摒棄了原瓊脂糖凝膠電泳的方法，采用8%[Acr（丙烯酰胺）︰Bis（甲叉丙烯酰胺）＝29︰1]非變性聚丙烯酰胺凝膠（PAGE），在180 V恒定電壓下，于DYCZ-30C電泳儀（北京市六一儀器廠）中電泳70 min，然后進行銀染、拍照。參照郭大龍等的方法[12]，電泳膠的銀染僅采用了銀染及顯影步驟，同時銀染液（0.15% AgNO3＋10%乙醇）未采用甲醛，而采用乙醇；顯影液（20% NaOH＋0.4%甲醛）中用強堿（200 g·L－1NaOH）取代了Na2CO3溶液，省去了固定和定影2個步驟。

1.2.3 引物篩選

Li和Quiros[11]報道了SRAP 10對正向引物及10對反向引物共100對引物組合。基于此，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物，并用4個榧樹基因組DNA進行篩選，最后用經過篩選的引物對樣品進行分析。

1.2.4 數據統(tǒng)計與分析

樣品DNA SRAP分析結果中有擴增位點的讀成1，反之讀成0，形成0/1原始矩陣。參考Smith[13]等的方法計算多態(tài)信息含量（PIC）值。應用POPGENE Version 1.31軟件[14]，在假定種群處于哈迪-溫伯格平衡前提下，對標記數據進行遺傳參數分析。應用AMOVA（Analysis of Molecular Variance）1.55[15]進行分子方差分析，計算遺傳變異在居群間和居群內的分布。對居群遺傳距離與地理距離的相關性進行Mantel檢驗[16]。運用NTSYS 2.1軟件，基于Nei’s遺傳一致度，對4個雌性榧樹居群進行UPGMA聚類分析。

2 結果與分析

2.1 DNA的提取

使用冷凍混合球磨儀研磨樣品的效率較高，提取的基因組DNA與手工研磨的效果相當，2個波長的光密度比值OD260/OD280可達到1.8～2.0，且瓊脂糖凝膠檢測結果顯示提取的DNA條帶明亮，可用于后續(xù)的標記分析。

2.2 SRAP-PCR擴增的多態(tài)性

SRAP引物經篩選，有26對引物組合F1R9、F2R1、F2R6、F2R10、F3R1、F3R9、F4R9 、F5R4、F5R5、F5R9、F5R10、F6R2、F6R4、F6R8、F7R2、F7R9、F7R10、F8R1、F9R2、F9R3、F9R4、F9R5、F10R2、F10R4、F10R6、F10R7能夠擴增出清晰、多態(tài)且可重復的條帶，用于研究樣品的SRAP分析。結果共擴增產生了404個位點，其中多態(tài)位點330個，平均每對引物擴增出了12.69個多態(tài)位點，多態(tài)性位點的比率（PPL）為83.79%；擴增位點數最多的引物組合是F10R7，擴增出了20個位點；擴增位點數最少的引物組合是F6R4、F7R10和F10R2，擴增位點數均為8個（見圖2和表1）。26對引物組合的平均多態(tài)信息含量（PIC）值為0.294 3，F7R2具有最高的PIC值（0.410 7），F9R3具有最低的PIC值（0.215 9）。

表1 SRAP引物組合及擴增結果Table 1 Primer pairs of SRAP and amplification result

圖2 引物對F5R5擴增產物電泳結果Fig. 2 Electrophoresis result of sample DNAs amplified with F5R5 primer pair

2.3 雌性榧樹居群的遺傳多樣性

Popgene 32分析結果表明，雌性榧樹在物種水平上，多態(tài)位點的比率（PPL）為81.68%。觀察的等位基因數（Na）為2，有效等位基因數（Ne）為 1.484 6，Nei’s基因多樣性（H）為 0.294 9，Shannon信息指數（I）高于H，為0.454 5（見表2），物種內多樣性較豐富。由H估算的雌性榧樹總遺傳多樣性（Ht）為0.288 0。

在居群水平上，各居群間PPL存在著較大的差異，其中小榮居群最高，為93.64%，其次是樵山和朱塔居群，分別為92.42%、91.52%，最低的是太湖源居群，為57.58%，平均83.79%，略高于物種水平，而Na、Ne、H、I均略低于物種水平（見表2）。4個雌性榧樹居群總的基因多樣度（Ht）為0.288 0，居群內基因多樣性（Hs）為0.256 6。各居群Nei’s基因多樣性（H）在0.182 0～0.290 8之間；Shannon（I）指數在0.277 3～0.441 8之間，各居群的Shannon信息指數與Nei’s基因多樣性指數變化趨勢基本一致，但也是I高于H。以多樣性指數為評價指標，則樵山居群的遺傳多樣性最高（H＝0.290 8，I＝0.441 8），太湖源居群遺傳多樣性最低（H＝0.182 0，I＝0.277 3）（見表2）。

表2 雌性榧樹物種水平及各居群內的遺傳多樣性Table 2 Genetic diversity in female T. grandis at population and species levels

2.4 雌性榧樹居群的遺傳變異來源

Popgene 32分析結果表明，居群間基因分化系數（Gst）為0.108 9，表明大多數遺傳變異存在于居群內，即變異居群內占89.11%，而居群間僅占10.89%。通過Gst計算出的居群間的基因流Nm[Nm＝0.5(1－Gst)/Gst]為4.090 9，表明居群間每代進行有效基因交流數為4個左右，低于異交、風媒植物基因流的平均水平（Nm＝5.380）[17]。盡管雌性榧樹居群內遺傳多樣性大于居群間，但居群間存在基因流。

AMOVA方差分析結果表明（見表3），雌性榧樹居群總的遺傳變異中，居群間占8.01%，91.99%的遺傳變異發(fā)生在居群內，結果與Popgene 32的分析結果接近，也說明雌性榧樹居群內的變異遠大于居群間，即遺傳變異主要分布在居群內。

表3 雌性榧樹居群SRAP分子標記位點頻率的方差分析（AMOVA）?Table 3 AMOVA of locus frequency expressed by SRAP molecular markers for four populations in female T. grandis

2.5 雌性榧樹居群間的遺傳距離及聚類分析

Popgene 32 分析結果（見表4）表明，4個雌性榧樹居群兩兩間的Nei’s遺傳相似性在0.922 5～0.974 7之間，平均為0.953 7；遺傳距離（D）的變化范圍為0.025 6～0.080 6，平均遺傳距離為0.047 6。用Mantel的方法來檢測遺傳距離與地理距離之間的關系，結果表明基于SRAP的遺傳距離和地理距離之間的相關性不顯著（r＝0.683 7，p＝1.000 0）。

根據Popgene 32分析的雌性榧樹居群間的Nei’s遺傳一致度，對4個雌性榧樹居群進行UPGMA聚類（見圖3）。結果表明小榮和朱塔2個居群的遺傳距離最?。―＝0.025 6），遺傳相似度最高（0.974 7），先聚在一起，然后再與樵山居群聚在一起，最后與太湖源居群聚集在一起?？偟膩碚f，4個居群彼此之間的遺傳距離相差不大。

表4 雌性榧樹4個居群的遺傳相似性和遺傳距離?Table 4 Nei’s genetic identities and genetic distances between four populations in female T. grandis

圖3 雌性榧樹4個居群遺傳關系的UPGMA聚類Fig. 3 UPGMA Phylogenetic clustering of four populations in female T. grandis

3 結論與討論

SRAP標記是基于其它DNA分子標記技術的優(yōu)缺點上發(fā)展起來的新的分子標記技術[18]。它根據基因外顯子里GC堿基含量豐富和內含子、啟動子里AT堿基含量豐富來設計引物進行DNA擴增，其應用前景廣泛，但在應用上的體系優(yōu)化不容忽視[19-21]。本研究中利用SRAP分子標記技術對4個天然雌性榧樹居群的遺傳多樣性和遺傳分化進行了分析，結果顯示，榧樹在物種水平和居群水平上的遺傳多樣性均較高，且雌性榧樹居群的遺傳多樣性主要存在于居群內（91.99%），居群內的遺傳差變異明顯大于居群間，與Hamrick[17]等對異交風媒植物的研究結果類似。

基因流是影響居群內部和居群間遺傳變異程度的重要因素[22]。遺傳結構是通過物種居群內和居群間遺傳分化來體現的，基因流的大小也可以反映居群遺傳結構變異的大小。一般來說，基因流大的物種，居群間遺傳分化小[23]，反之，居群間的遺傳分化大[24]。Wrigh[25]認為，當Nm＞1時，說明居群間存在一定的基因流動。本研究中雌性榧樹Nm＝4.090 9＞1，從一個側面反映了榧樹居群間遺傳分化較小的原因，這與榧樹風媒傳粉的特性相符。4個居群UPGMA聚類的結果也證實了這一點。此外，雌性榧樹地理分布所產生的地理隔離對遺傳分化沒有顯著的影響，不是決定雌性榧樹居群遺傳結構的主要因素，不符合“距離決定隔離”模式[26]。

Shannon信息指數（I）是一個常用的描述多樣性的參數，一般大于0.5時表明多樣性豐富。在本研究中，雌性榧樹物種水平的I值接近0.5，說明種內多樣性豐富，這與該物種雌雄異株異交的特性有關。豐富的多樣性一方面使得該物種對環(huán)境變化的適應能力增強，另一方面，豐富的變異確實使該物種在物種內具有選擇種實性狀接近或優(yōu)于香榧種質的潛力[27]。浙江省已先后從天然榧樹群體中選育了12個新品種，并通過了省級認定。此外，太湖源居群因本身群體不大，因此取樣數較少，但不影響研究的進行。在銀杏Ginkgo biloba[28]、紫苜蓿Medicago sativa[29]、云南沙棘Hippophae rhamnoidessubsp. yunnanensis[30]等物種的群體遺傳研究中有類似的報道，但其4個基因遺傳參數（Na、Ne、H、I）與另3個居群相比較均偏低，是否與雄株有關還有待于結合雄性榧樹群體的遺傳多樣性開展進一步的研究，因為在大力發(fā)展香榧產業(yè)之前，許多地方的老百姓不了解榧樹的生物學特性，因雄性榧樹不結果而砍伐雄性榧樹用作薪碳材，以致于出現每年春天香榧授粉期榧樹花粉短缺的情況。

榧樹的種子目前主要用于香榧砧木苗的繁殖，但實際上其種子的營養(yǎng)成分變異十分豐富[31]，具有開發(fā)功能食品的潛力。隨著對榧樹經濟價值認識的日益增加，對其的利用程度也會有所增加，目前浙江省正在進行向榧樹分布8省推廣香榧種植的工作。在這種情況下，各地更要注重天然榧樹資源及其多樣性的就地保護，并利用優(yōu)良雌雄株資源開展常規(guī)育種工作，豐富榧樹栽培的品種。

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