蔣 文

( 重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，重慶401331)

0 引言

人絨毛膜促性腺激素 (human chorionic gonadotropin,HCG) 是由胎盤組織的滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌的一種重要糖蛋白，其生理功能是維持妊娠黃體及影響類固醇的產(chǎn)生，因此，HCG 的測定是早期妊娠(包括早孕、流產(chǎn)和異位妊娠等)和滋養(yǎng)細(xì)胞疾病(如葡萄胎、絨癌及滋養(yǎng)層腫瘤、前列腺癌和生殖細(xì)胞腫瘤等)診斷的重要指標(biāo)[1～4]。目前檢測HCG 的方法有放射免疫檢測法、酶聯(lián)免疫法、金標(biāo)試紙卡片檢測法、熒光標(biāo)記免疫檢測法、酶標(biāo)電泳法和電化學(xué)免疫分析法等。其中，電化學(xué)免疫傳感器因其檢測速度快、成本低、操作簡單、攜帶方便等優(yōu)點而越來越受人們的關(guān)注。

近年來，納米材料基于大的比表面積、好的生物相容性以及高的表面反應(yīng)活性等優(yōu)點而廣泛應(yīng)用于生物傳感器的構(gòu)建，并極大地提高了傳感器的靈敏度和穩(wěn)定性[5～7]。

該文采用超聲溶劑置換方法合成球形二茂鐵甲酸納米粒子，以Nafion 分散的多壁碳納米管與球形二茂鐵甲酸形成納米復(fù)合物，并將其固定在玻碳電極（GCE）表面，用EDC/NHS 將二茂鐵甲酸與L-半胱氨酸（L-Cys）交聯(lián)，形成帶有巰基官能團(tuán)的復(fù)合膜，再鍵合沉積的納米金 （nano-Au），并通過納米金吸附人絨毛膜促性腺激素抗體（anti-HCG），最后用牛血清蛋白（BSA）封閉電極上的非特異性吸附位點，從而制得了高靈敏的人絨毛膜促性腺激素免疫傳感器。Nafion-MWCNT-FcCOOH 復(fù)合膜具有良好的電化學(xué)氧化還原活性；電沉積納米金能阻止電活性探針從電極表面脫落，并為免疫反應(yīng)提供良好的生物相容性微環(huán)境，使免疫分子能保持較高的免疫活性；多壁碳納米管的引入，提高了電子傳遞速率，增強了傳感器的靈敏度、增大了檢測范圍和降低了檢測限。該實驗方法具有電極制作簡單，操作簡便，靈敏度高，重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和選擇性好等特點。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI660E型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)；AB204-S 電子天平(瑞士Mettler&Toledo 公司)；pHS-3C型酸度計 （上海大眾儀器公司）；KQ218 超聲波清洗器（江蘇昆山超聲儀器公司）；透射電子顯微鏡（H-7500,日本Hitachi Instrument公司）。

人絨毛膜促性腺激素抗原（HCG）和人絨毛膜促性腺激素抗體（anti-HCG）（鄭州博賽生物試劑公司）；多壁碳納米管（MWCNT，中科院成都有機(jī)所）；氯金酸、牛血清白蛋白（BSA）、Nafion（Sigma，美國)；0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS)做測試底液。其它試劑均為分析純試劑，實驗用水為二次去離子水。

1.2 球形二茂鐵甲酸納米粒子的制備

取0.1 g 二茂鐵甲酸溶于25 mL 的無水乙醇中，在超聲條件下以30 mL/min 速度加入125 mL去離子水，繼續(xù)超聲25 min，最后用去離子水洗滌、干燥，儲存?zhèn)溆肹8]。圖1為球形二茂鐵甲酸(FcCOOH)納米粒子的透射電鏡圖譜。

圖1 球形二茂鐵甲酸納米粒子的透射電鏡圖譜Fig.1 TEM image of spherical ferrocenecarboxylic acid nanoparticles

1.3 Nafion-MWCNT-FcCOOH 納米復(fù)合物的制備

將1 mg MWCNT 和5 mg 球形FcCOOH 納米粒子加入至5 mL Nafion （0.25%） 的無水乙醇中,超聲震蕩分散2 h，得到分散均勻的Nafion-MWCNT-FcCOOH 納米復(fù)合物。

1.4 免疫傳感器的制備

裸玻碳電極 （GCE，φ=4 mm ） 依次經(jīng)過1.0 μm、0.3 μm 和0.05 μm 的三氧化二鋁糊拋光后，再分別用去離子水、丙酮、乙醇、去離子水超聲洗滌、晾干備用。取10 μL Nafion-MWCNT-FcCOOH納米復(fù)合物懸濁液滴涂于GCE 表面并置于室溫晾干，然后置于EDC/NHS 活化液中活化2 h，再滴加10 μL L-半胱氨酸并過夜；將洗滌后的修飾電極浸入1%的氯金酸溶液中，在-0.2 V 恒定電位下沉積15 s；將修飾電極置于人絨毛膜促性腺激素HCG 抗體（anti-HCG）溶液中過夜（4℃），再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的牛血清白蛋白(BSA)封閉電極表面非特異性吸附位點，從而制得所需的電化學(xué)免疫傳感器。圖2為免疫傳感器的制備過程示意圖。

1.5 檢測方法

利用循環(huán)伏安法（CV）對電極的制備過程進(jìn)行表征，檢測過程中被修飾的GCE為工作電極。以0.1 mol/L 的PBS（pH7.0）溶液作為測試底液，循環(huán)伏安法電位區(qū)間為0.0～0.5 V，掃描速率為50 mV/s。

圖2 免疫傳感器的修飾過程示意圖Fig.2 The modified process of the immunosensor

利用示差脈沖伏安法（DPV）來記錄修飾電極免疫反應(yīng)前后的電流值，其變化值即為對應(yīng)抗原HCG 濃度的響應(yīng)信號，根據(jù)響應(yīng)信號與抗原濃度的線性關(guān)系進(jìn)行HCG 定量測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同修飾電極的電化學(xué)表征

修飾電極在0.1 mol/L PBS（pH7.0）中的循環(huán)伏安（CV）掃描圖譜如圖3所示，裸的GCE 無氧化還原峰峰產(chǎn)生（圖3曲線a，插圖為其放大圖），圖3曲線b 是電極表面滴涂Nafion-MWCNTFcCOOH 納米復(fù)合物后的循環(huán)伏安圖，有一對明顯的二茂鐵甲酸的氧化還原峰，表明該電活性納米復(fù)合物成功修飾到電極表面。當(dāng)修飾L-半胱氨酸后，峰電流明顯減弱（圖3曲線c），這是因為L-半胱氨酸阻礙了電子傳遞；當(dāng)沉積納米金后，由于納米金有利于電子傳輸，氧化還原峰電流又明顯增強（圖3曲線d）；當(dāng)修飾HCG 抗體和BSA封閉后，由于蛋白分子對電子傳輸?shù)淖璧K作用，氧化還原峰峰值均降低（圖3曲線e 和曲線f）。

圖3 電極制備過程的循環(huán)伏安表征圖(a) 裸的GCE；(b)在GCE 表面滴涂Nafion-MWCNT-FcCOOH 復(fù)合物；(c) 組裝L-半胱氨酸層；(d) 沉積納米金；(e) 固定一層抗體膜；(f) 用BSA 封閉Fig.3 The diagram of the CVs of the stepwise

將BSA/anti-HCG/nano-Au/L-Cys/Nafion-MWCNT-FcCOOH 復(fù)合膜修飾的GCE 與BSA/anti-HCG/nano-Au/L-Cys/Nafion-FcCOOH 復(fù)合膜修飾的玻碳電極進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，有碳納米管修飾的電極峰電流（圖4曲線a）明顯高于無碳納米管修飾的電極峰電流 （圖4曲線b），表明MWCNT 的加入有助于增強傳感器的響應(yīng)電流，從而提高其靈敏度。

圖4 兩種修飾電極的循環(huán)伏安比較圖譜Fig.4 The comparison cyclic voltammetrys of two modified electrodes.(a)BSA/anti-HCG/nano-Au/L-Cys/Nafion-MWCNT-FcCOOH/GCE,(b)BSA/anti-HCG/nano-Au/LCys/Nafion-FcCOOH/GCE

2.2 免疫傳感器在不同掃速下的循環(huán)伏安圖

圖5是該免疫傳感器在不同掃速下的循環(huán)伏安圖。隨著掃速從50 mV/s 逐漸增加到500 mV/s，氧化峰和還原峰電流均不斷增大，且峰電流與掃速的平方根成正比（圖5插圖），表明該傳感器在緩沖液中的電化學(xué)過程受擴(kuò)散控制。

圖5 免疫傳感器在不同掃速下的循環(huán)伏安圖Fig.5 Cyclic voltammetrys of the immunosensor at different scan rates

2.3 實驗條件優(yōu)化

2.3.1 沉積納米金的時間優(yōu)化

當(dāng)電沉積納米金的時間從5 s到15 s 逐漸增加時，修飾電極的峰電流也逐漸增大，當(dāng)沉積時間超過15 s時，電極的峰形和可逆性越來越差，因此選擇15 s為電沉積納米金的最優(yōu)時間。

2.3.2 測試液pH值的選擇

在pH值從5.0到9.0 范圍內(nèi)0.1mol/L PBS中該免疫傳感器的DPV 電流響應(yīng)變化情況 （如圖6）。當(dāng)pH值從5.0 增加到7.0時,峰電流逐漸增加；pH 從7.0到9.0 增加時，峰電流下降。實驗結(jié)果表明，在pH為7.0時，響應(yīng)電流最大。因此該實驗選擇pH7.0 的PBS溶液作為測試底液。

2.3.3 孵育時間的優(yōu)化

將工作電極放入10.0 mIU/mL 的HCG 抗原溶液中孵育不同時間，在0.1 mol/L 的PBS（pH 7.0）中用DPV 測定其響應(yīng)電流的變化，其結(jié)果如圖7所示。從圖中可以看出，隨著時間的進(jìn)行，免疫反應(yīng)逐漸完成。當(dāng)孵育30 min 的時候，峰電流趨于平緩，說明免疫反應(yīng)達(dá)到飽和。因此，該實驗孵育時間選擇30 min為佳。

圖6 測試液pH值對免疫傳感器響應(yīng)的影響Fig.6 The effect of pH on the response of the immunosensor

2.4 免疫傳感器的響應(yīng)特性

在選定實驗條件下，傳感器在不同濃度的HCG 標(biāo)準(zhǔn)溶液中孵育，圖8為免疫傳感器DPV峰電流信號對HCG 濃度對數(shù)的校準(zhǔn)曲線。圖中曲線a 和曲線b 分別為免疫電極BSA/anti-HCG/nano-Au/L-Cys/Nafion-MWCNT-FcCOOH/GCE

圖7 孵育時間對免疫反應(yīng)的影響Fig.7 The effect of incubation time on immunoreaction

（電極a） 和免疫電極BSA/anti-HCG/nano-Au/LCys/Nafion-FcCOOH/GCE（電極b）對HCG 濃度對數(shù)的校準(zhǔn)曲線，插圖為免疫電極a 的DPV 響應(yīng)曲線。免疫電極a 的線性范圍為0.05 mIU/mL～200 mIU/mL，最低檢測限為0.015 mIU/mL；作為對比，免疫電極b 的線性范圍為0.1 mIU/mL～200 mIU/mL，最低檢測限為0.04 mIU/mL。

2.5 免疫傳感器的選擇性

將制備好的免疫電極分別置于不含和含有AFP、CEA、維生素C、L-半胱氨酸、L-賴氨酸和BSA 干擾物質(zhì)的0.1 mIU/mL HCG 抗原的標(biāo)準(zhǔn)溶液中孵育，并用上述方法檢測，其電流響應(yīng)相差2.4%，表明該免疫傳感器具有良好的選擇性。

圖8 免疫傳感器對HCG 的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.8 Calibration plots of the immunosensor for detection of HCG.(a)BSA/anti-HCG/nano-Au/L-Cys/Nafion-MWCNT-FcCOOH modified GCE,(b)BSA/anti-HCG/nano-Au/L-Cys/Nafion-FcCOOH modified GCE

2.6 免疫傳感器的重現(xiàn)性

免疫電極的重現(xiàn)性考查采用5次檢測60.0 mIU/mL 的HCG 抗原，5次電流的響應(yīng)值分別為7.148、7.162、7.179、7.104 和7.212 μA，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.9%，表明該傳感器具有良好的重現(xiàn)性。

2.7 免疫傳感器回收率的測定

分別將標(biāo)準(zhǔn)濃度為0.5、5.0、25.0、50.0、100 mIU/mL 的HCG 加入到HCG 陰性血清中，用該免疫傳感器分別對其進(jìn)行檢測，結(jié)果列于表1中。加標(biāo)回收率在96.8%～104.0%之間，表明該免疫傳感器對HCG 的檢測是準(zhǔn)確的，有望運用到臨床檢測中。

表1 血清加標(biāo)回收率Tab.1 The recovery of the prepared immunosensor in human serum

3 結(jié)論

該文利用Nafion-MWCNT-FcCOOH 復(fù)合納米材料和納米金，成功構(gòu)建了高靈敏的電流型免疫傳感器。通過循環(huán)伏安法和差分脈沖伏安法考察了電極的電化學(xué)特性并對電極的性能進(jìn)行了研究。該免疫傳感器具有如以下優(yōu)點：第一，Nafion-MWCNT-FcCOOH 復(fù)合膜具有良好的電化學(xué)氧化還原活性和電化學(xué)穩(wěn)定性；第二，電沉積的納米金可阻止電活性探針從電極表面的脫落，并為免疫反應(yīng)提供了一個良好的生物相容性的微環(huán)境，從而使免疫分子能保持較高的免疫活性；第三，MWCNT 的引入，增強了傳感器的靈敏度、增大了檢測范圍和降低了檢測限；第四，該免疫傳感器具有制備過程簡單、靈敏度高、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和選擇性好等特點。另外，該方法也可用于其它免疫物質(zhì)的測定，在臨床腫瘤標(biāo)志物的診斷方面有一定的潛在應(yīng)用價值。

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