黃燕婷勞均平

沉默VEGF基因?qū)ο贅幽倚园┘?xì)胞侵襲的影響*

黃燕婷①勞均平①

目的：利用RNAi技術(shù)沉默腺樣囊性癌細(xì)胞株ACC-2中VEGF的表達(dá)，探討其對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲能力的影響。方法：利用RNAi技術(shù)沉默VEGF表達(dá)，用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞體外侵襲能力的變化。結(jié)果：與對(duì)照組比較，VEGF的siRNA能有效地抑制實(shí)驗(yàn)組ACC-2細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)論：沉默VEGF減弱腺樣囊性癌的侵襲能力。

涎腺腺樣囊性癌； 血管內(nèi)皮生長因子； RNA干擾； 侵襲

涎腺腺樣囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma， SACC）是口腔頜面部常見的惡性腫瘤之一，約占口腔惡性腫瘤的六分之一。腺樣囊性癌具有嗜神經(jīng)侵襲以及跳躍性轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)。手術(shù)預(yù)后差，侵襲以及轉(zhuǎn)移是患者的主要病因之一[1-2]。

血管內(nèi)皮生長因子（vasculare endothelial growth factor，VEGF）是一種強(qiáng)烈誘導(dǎo)血管生成的細(xì)胞因子，在腎癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、胃癌、膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌以及胚胎組織性腫瘤中多有報(bào)道。腫瘤組織中VEGF表達(dá)水平與惡性程度成正相關(guān)，并明顯高于非腫瘤組織[3-4]。這表明VEGF可能通過促進(jìn)血管形成等方式促進(jìn)腫瘤的生長，尤其在高度血管化的腫瘤中。VEGF及其受體是血管生成的關(guān)鍵因子，其過度表達(dá)與腫瘤生長、侵襲及轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[5]。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 腺樣囊性癌細(xì)胞系低轉(zhuǎn)移株（ACC-2）由中山大學(xué)附屬孫逸仙醫(yī)院李勁松教授饋贈(zèng)。兩株細(xì)胞培養(yǎng)于10%的FBS、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃，5%（v/v）CO2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 siRNA的設(shè)計(jì)和轉(zhuǎn)染 VEGF特異性干擾片段參照之前文獻(xiàn)設(shè)計(jì)。片段序列為：GGCGTCGCACTGAAACTTT，由吉瑪生物合成。

1.3 mRNA的提取和檢測 細(xì)胞株的mRNA的提取和cDNA的合成。TRIzol法提取細(xì)胞株中總的RNA，cDNA的合成采用M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega）。VEGF引物的設(shè)計(jì)如下：VEGF基因：上游引物：5’-GATCCTGCCCTGTCTCTCTG-3’；下游引物：5’-GACTCGCCCTCATCCTCTT-3’。內(nèi)參GAPDH基因：上游引物：5’-GCCTCAAGATCATCAGCAATGC-3’；下游引物：5’-CATGGACTGTGGTCATGAGTCTT-3’。

1.4 Western Blot檢測VEGF蛋白的表達(dá) 分別收集轉(zhuǎn)染48 h后的ACC-2細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌，加入蛋白裂解液，提取總蛋白。分別取50 μg蛋白，97 ℃變性后，經(jīng)10% SDS-PAGE分離，將凝膠置于轉(zhuǎn)移平衡緩沖液中，再以200 V行電泳跑膠，時(shí)間1 h。再以25 V電壓1.5 h將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；5%脫脂牛奶（TBST溶解）封閉1 h；10%FBS/TBST加一抗4 ℃孵育過夜；漂洗TBST 3次，10 min/次；10%FBS/TBST加二抗室溫下孵育1 h，漂洗TBST 3次，10 min/次。取等量的ECL發(fā)光試劑A、B液，混勻后，孵育硝酸纖維素膜，曝光，以GAPDH為內(nèi)參。

1.5 Transwell實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，以無血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，“饑餓”12 h。消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1～2遍，用無血清DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至5×105個(gè)/mL單細(xì)胞懸液。取細(xì)胞懸液100 μL加入Transwell小室，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。24孔板下室加入450 μL含10%FBS的細(xì)胞培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)48 h，用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞。采用0.1%結(jié)晶紫染色。選擇相同位置的3個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用 χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 檢測結(jié)果 ACC-2胞中VEGF基因的qPCR以及蛋白產(chǎn)物在轉(zhuǎn)染后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 VEGF的表達(dá)變化

2.2 VEGF表達(dá)下調(diào)能夠有效抑制腺樣囊性癌細(xì)胞的侵襲能力 利用VEGF的siRNA對(duì)ACC-2細(xì)胞中VEGF的表達(dá)進(jìn)行抑制，利用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測ACC-2細(xì)胞的侵襲能力的變化。結(jié)果顯示：在ACC-2細(xì)胞的侵襲能力明顯受到抑制，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 細(xì)胞侵襲能力的變化

3 討論

血管內(nèi)皮生長因子（vasculare endothelial growth factor，VEGF）是一種強(qiáng)烈誘導(dǎo)血管生成的細(xì)胞因子，VEGF的表達(dá)廣泛見于腫瘤及非腫瘤的病理過程中，它的表達(dá)與轉(zhuǎn)化生長因子B（TGF-β）、血小板源性生長因子（PDGF）、NO以及一些重金屬離子有關(guān)，還受缺血和缺氧環(huán)境的調(diào)節(jié)[6]。腫瘤組織中VEGF表達(dá)水平與惡性程度成正相關(guān)，并明顯高于非腫瘤組織[7]。這表明VEGF可能通過促進(jìn)血管形成等方式促進(jìn)腫瘤的生長，尤其在高度血管化的腫瘤中[8-10]。VEGF及其受體是血管生成的關(guān)鍵因子，其過度表達(dá)能從多方面影響腫瘤的脈管生成，加速腫瘤轉(zhuǎn)移，與腫瘤生長、侵襲及轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[11-12]。本研究通過沉默VEGF基因從而降低ACC-2的侵襲能力。揭示了VEGF的對(duì)ACC-2侵襲的調(diào)控能力，但針對(duì)ACC-2侵襲的調(diào)控的具體信號(hào)通路還需要做進(jìn)一步的研究。并且需要做動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，希望以后可以為以VEGF為靶點(diǎn)的惡性腫瘤的生物治療提供理論的依據(jù)。

[1] Tian Z， Li L， Wang L， et al. Salivary gland neoplasms in oral and maxillofacial regions： a 23-year retrospective study of 6982 cases in an eastern Chinese population[J]. Int J Oral Maxillofac Surg，2010， 39 （10）：235-242.

[2]勞均平，梁軍，歐陽可雄.RNA干擾iNOS基因?qū)ο贅幽倚园┘?xì)胞增殖活性的影響[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2013，27（273）：6-8.

[3] Kourembanas S， Mcquillan L P， Leung G K， et al. Nitric oxide regulated the expression of vasoconstrictors and growth factor by vascular endothelium under both normoxia and hypoxia[J]. J Clin Invest， 1993， 92（5）：99-104.

[4] Assal O N， Yamanoi A， Soda Y， et al. Clinical significance of microvessle density and vascular endothelial growth factor expretion in hepatocellular carcinoma and surrounding liver： possible involvement of vascular endothelial growth factor in the angiogenesis of cirrhotic liver[J]. Hepatology， 1998， 27（5）：1554-1562.

[5] Lee J C， Chow N H， Wang S T， et a1.Prognostic value of vascular endothelial growth factor expression in eolorectal cancer patients[J].Eur J Cancer，2000，36（6）：748-753.

[6] Jiang B H， Semenza G L， Bauer C， et al. Hypoxia-inducible factor 1 levels vary exponentially over s physiologically relevant range of O2tension[J]. Am J Physiol， 1996， 271（7）： 1172-1182.

[7] Mise M， Arii S， Higashituji H， et al. Clinical significance of vascular endothelial growth factor gene expression in liver tumor[J]. Hepatology，1996， 23（10）： 455-464.

[8] Hatva E， Bohling T， Jaaskelainen J， et al. Vascular growth factors and receptors in capillary hemangioblastomas and hemangiopericytomas[J]. Am J Pathol， 1996， 148（7）： 763-775.

[9] Cornali E， Zietz C， Benelli R， et al. Vascular endothelial growth factor regulate angiogenesis and vascular permeability in Kaposi's sarcoma[J]. Am J Pathol， 1996， 149（8）： 1851-1869.

[10]宋洪生，吳芳.外源性p21waf1基因轉(zhuǎn)染對(duì)人胃癌細(xì)胞系BGC-823增殖的影響[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2013，10（1）：3-5.

[11]史玉嶺.夾心ELISA檢測血清結(jié)締組織生長因子及其初步臨床應(yīng)用[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2011，8（30）：9-11.

[12]羅偉，冀林華，李占全，等.急性白血病患者血漿VEGF測定及其臨床意義[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2013，10（14）：70-71.

The Study of the Influence on Invasiveness Activity of ACC-2 Cells Via RNAi VEGF

HUANG Yan-ting，LAO Jun-ping.//Medical Innovation of China，2014，11（12）：037-038

Objective：To investigate the inhibitory effects of VEGF targeted small interference RNA（siRNA） on invasiveness of salivary adenoid cystic carcinoma（SACC） cell line ACC-2.Method：VEGFsiRNA was transfect into SACC cell line ACC-2 and then examine the changes of invasive ability of ACC-M.Result：The invasive and proliferative abilities of ACC-2 decreased， and the difference between the two groups were statistically significant（P＜0.05）.Conclusion：Si-VEGF can effectively decrease invasiveness of SACC cells.

Salivary adenoid cystic carcinoma； Vasculare endothelial growth factor； RNA interference；Invasiveness

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.12.013

2014-02-17） （本文編輯：黃新珍）

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金（B2011302）

①廣東省佛山市第一人民醫(yī)院 廣東 佛山 528000

勞均平

First-author’s address：The First People’s Hospital of Foshan City，F(xiàn)oshan 528000，China