連梓敏曹定睿王泓源馬曉燕

丙泊酚對Wistar大鼠肝癌模型中Bax與Bcl-2表達的影響

連梓敏①曹定睿①王泓源①馬曉燕①

目的：探討不同濃度丙泊酚對Wistar大鼠肝癌模型中凋亡促進基因Bax和凋亡抑制基因Bcl-2表達的影響。方法：將50只雄性Wistar大鼠按隨機數(shù)字表法分為五組，每組10只，分別為正常對照組（A組），肝癌模型組（B組），低劑量丙泊酚（3 mg/kg）組（C1組），中等劑量丙泊酚（6 mg/kg）組（C2組），高劑量丙泊酚（12 mg/kg）組（C3組）。給藥結(jié)束后24 h處死大鼠，取肝臟標本觀察肝臟特征，并做組織切片行蘇木精-伊紅（HE）染色及S-P免疫組化檢測Bcl-2及Bax的表達，TUNEL法檢測肝細胞凋亡指數(shù)（AI）。結(jié)果：（1）大體標本檢查及HE染色：與A組比較，B組大鼠肝臟表面粗糙，部分肝葉表面出現(xiàn)黃色斑點，肝細胞脂肪變性，點狀壞死及炎細胞浸潤，少量膠原纖維增生；與B組比較，C1、C2、C3組肝細胞變性壞死以及膠原纖維增生程度有所減輕；（2）TUNEL檢測結(jié)果：隨丙泊酚劑量增加，肝癌細胞中凋亡細胞逐漸增多，AI逐漸遞增，具有顯著差異性（P＜0.05）；（3）與A組比較，B組肝臟細胞Bcl-2表達上調(diào)，Bax表達下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與B組比較，C組（C1、C2、C3）肝臟細胞Bcl-2表達均下降，且隨著丙泊酚劑量的增加而呈遞減趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；Bax表達均上調(diào)，且隨著丙泊酚劑量的增加而呈遞增趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：丙泊酚可導(dǎo)致Wistar大鼠肝癌細胞中Bcl-2/Bax表達比例降低，促進肝癌細胞的凋亡，進而抑制肝癌細胞的增殖能力。

丙泊酚； 肝癌； 細胞凋亡； Bcl-2； Bax

研究顯示，腫瘤不僅是表現(xiàn)出增殖與分化異常的疾病，同樣也是表現(xiàn)出細胞凋亡異常的疾病。原發(fā)性肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC 簡稱肝癌）作為常見的原發(fā)性肝腫瘤，其發(fā)病率居全球惡性腫瘤的第5位，病死率居第3位，其中東亞及非洲的發(fā)展中國家是肝癌的高發(fā)病區(qū)[1]。丙泊酚是一種起效快，蘇醒迅速，術(shù)后惡心嘔吐發(fā)生率低，對機體功能影響小的麻醉劑，廣泛應(yīng)用于各種外科手術(shù)時全身麻醉的誘導(dǎo)、維持[2-5]。除高效安全的麻醉作用，近年來，丙泊酚抗腫瘤的作用也成為了目前的研究熱點，但目前其對腫瘤細胞的影響尚存在爭議[6-10]。本研究旨在探討丙泊酚對Wistar大鼠肝癌模型中Bax與Bcl-2的影響，評價丙泊酚對Wistar大鼠肝癌的抑制效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康的成年Wistar大鼠50只，體重約200～250 g，購于山西醫(yī)科大學(xué)生理動物實驗室。

1.2 主要試劑 W256細胞株[購于通派（上海）生物有限公司]，Bax兔抗鼠多克隆抗體、Bcl-2兔抗鼠多克隆抗體（均購于武漢博士德生物工程有限公司），DAB顯色試劑盒、非生物素檢測試劑盒、原位細胞凋亡檢測（TUNEL）（均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.3 主要藥物 丙泊酚注射劑。

1.4 實驗分組 將50只Wistar大鼠隨機選取10只作為正常對照組（A組），將隨機剩余40只Wistar大鼠制作肝癌模型后，以每組10只隨機分為四組，分別為肝癌模型組（B組），低劑量丙泊酚組（3 mg/kg）（C1組），中劑量丙泊酚組（6 mg/kg）（C2組），高劑量丙泊酚組（12 mg/kg）（C3組）。

1.5 肝癌模型制備 W256細胞生長至濃度達到107/L時，經(jīng)腹腔注射于2只剛斷奶的健康雄性Wistar大鼠，6～8 d后大鼠腹水形成明顯；抽取腹水10 mL，離心，棄上清液，接種至40只健康雄性Wistar大鼠肝臟。

1.6 標本采集 于給藥結(jié)束24 h后斷頸處死各組大鼠，剪取大鼠整個肝臟組織，10%中性甲醛溶液中進行固定，肉眼大體觀察腫瘤組織生長情況，內(nèi)部結(jié)構(gòu)特點及與周圍正常肝組織的關(guān)系，石蠟包埋肝臟組織，制成5 μm的病理切片備用。

1.7 觀察指標及檢測方法

1.7.1 蘇木素-伊紅染色 進行蘇木素-伊紅（hematoxylinand eosin，HE）染色，光鏡下觀察腫瘤組織的病理學(xué)特點。

1.7.2 原位細胞凋亡檢測 組織經(jīng)常規(guī)脫蠟、沖洗、高壓氧修復(fù)后，用甲醛阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。每片滴加5 μL 的TUNEL反應(yīng)混合溶液且標本片加POD轉(zhuǎn)化劑50 μL/片，置標本片于濕盒中，37 ℃孵育30 min，PBS浸洗5 min×3次。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片后置于光鏡下觀察結(jié)果。

1.7.3 Bax與Bcl-2表達檢測 經(jīng)脫蠟、水化、微波加熱修復(fù)抗原、甲醇溶液消除內(nèi)源性過氧化氫酶活性，加生物素標記二抗工作液，蘇木素染色，光鏡下觀察。細胞漿中有棕黃色顆粒者為Bcl-2、Bax蛋白陽性表達細胞。每張切片在光學(xué)顯微鏡200倍視野下分別隨機選擇10個區(qū)域，每個區(qū)域計數(shù)100個細胞，計算Bcl-2及Bax蛋白陽性表達細胞百分比。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料以（±s）表示，比較采用單因素方差分析LSD法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大體標本檢查及HE染色結(jié)果 與A組比較，B組大鼠肝臟表面粗糙，部分肝葉表面出現(xiàn)黃色斑點，于光鏡下觀察各組大鼠肝臟切片，可見肝細胞脂肪變性，點狀壞死及炎細胞浸潤，少量膠原纖維增生；與B組比較，C組（C1、C2、C3組）肝細胞變性壞死以及膠原纖維增生程度有所減輕。

2.2 促進凋亡基因Bax和抑制基因Bcl-2的表達 與A組比較，B組中Bcl-2的表達增高，Bax的表達下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與B組比較，C組（C1、C2、C3組）肝臟細胞Bcl-2表達下降，且其隨著丙泊酚劑量的增加而遞減，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與B組比較，C組（C1、C2、C3組）肝臟細胞Bax表達上調(diào)，并隨著丙泊酚劑量的增加而呈遞增趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與B組比較，C組（C1、C2、C3組）的Bcl-2/Bax比均減小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.3 肝細胞凋亡指數(shù)（AI）的變化 隨丙泊酚劑量增加，肝癌凋亡細胞的陽染顆粒逐漸增多；與B組比較，C組（C1、C2、C3組）肝臟細胞AI上調(diào)，并隨著丙泊酚劑量的增加而遞增，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組的Bcl-2、Bax蛋白及AI值的比較（±s）

表1 各組的Bcl-2、Bax蛋白及AI值的比較（±s）

*與A組比較，P＜0.05；△與B組比較，P＜0.05；#與C1組比較，P＜0.05；▲與C2組比較，P＜0.05

組別 Bcl-2 Bax AI值A(chǔ)組（n=10） 0.1379±0.0251 0.2905±0.0271 -B組（n=10） 0.3026±0.0172* 0.1640±0.1933* 12.97±0.12 C1組（n=10） 0.2610±0.0270△ 0.1894±0.0274△ 18.63±0.39△C2組（n=10） 0.2225±0.0281△# 0.2330±0.0243△# 23.06±0.27△#C3組（n=10） 0.1674±0.0245△#▲ 0.2573±0.0278△#▲ 29.46±0.28△#▲

3 討論

Bcl-2和Bax作為細胞凋亡過程中重要的調(diào)節(jié)因子，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，起著關(guān)鍵性的作用。國內(nèi)外多項研究結(jié)果表明，在多種惡性腫瘤細胞中，均發(fā)現(xiàn)了Bcl-2的高表達。Bcl-2表達減少或缺失，或者Bax表達增高，均可導(dǎo)致對細胞的抑制作用減弱，促進細胞程序性死亡，在惡性腫瘤當中，表現(xiàn)為增殖減弱，預(yù)后趨好。反之，則會導(dǎo)致本來應(yīng)停止增殖或凋亡的細胞進入細胞周期，造成惡性增生[11]。

近年來，麻醉藥物對惡性腫瘤的影響成為了目前的研究方向之一，而丙泊酚因其起效快，蘇醒迅速，術(shù)后惡心嘔吐發(fā)生率低，對機體功能影響小等特點，在麻醉過程中廣為使用，其對惡性腫瘤的影響亦成為了研究熱點。

劉葉等[12]研究表明丙泊酚抑制人肝癌細胞HepG2中Bcl-2表達，同時Bax表達含量增高，認為丙泊酚可抑制人肝癌細胞的增殖，遷移和侵襲，并促進細胞凋亡。Zhang 等[13]發(fā)現(xiàn)，丙泊酚可通過Micro RNA-199抑制肝癌細胞中MMP-9蛋白的表達，從而降低腫瘤的侵襲能力。李培生等[14]使用明膠酶譜法對肝癌細胞中MMP-2及MMP-9活性的檢測中發(fā)現(xiàn)，丙泊酚能抑制肝癌細胞中MMP-2的活性，且和丙泊酚的濃度呈一定的劑量依賴關(guān)系。

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同劑量丙泊酚均可抑制細胞中Bcl-2蛋白并促進Bax在細胞中的表達，且呈一定的劑量依賴關(guān)系。對大鼠肝癌模型的實驗中發(fā)現(xiàn)，丙泊酚的劑量與肝癌細胞的增殖能力密切相關(guān)。丙泊酚作為手術(shù)麻醉劑，在手術(shù)治療過程中能抑制腫瘤的增殖能力，對腫瘤患者預(yù)后有一定積極意義。本實驗中發(fā)現(xiàn)隨著丙泊酚劑量的增加，凋亡率逐漸增大，可一定程度上抑制肝癌細胞的增殖能力。

綜上所述，丙泊酚可促進大鼠肝癌細胞的凋亡，對其在臨床的應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)意義。

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The Influence of Propofol on Expressions of Bcl-2 and Bax in Wistar Rat Model with Hepatic Carcinoma

LIAN Zi-min，CAO Ding-rui，WANG Hong-yuan，et al.//Medical Innovation of China，2014，11（12）：028-030

Objective：To investigate the influence of propofol with different concentrations on the expression of Bcl-2 and Bax in Wistar rat model of hepatic carcinoma.Method：50 Wistar rats were divided into 5 groups according to random number table method， each group had 10 rats， the normal group （the group A）， the liver cancer model group （the group B），the low dose Propofol group： 3 mg/kg（the group C1）， the moderate dose Propofol group： 6 mg/kg （the group C2）， the high dose Propofol group： 12 mg/kg （the group C3）. The liver tissue were collected in 24 h after the last injection and observedby morphology and hematoxylin and eosin（HE）staining. S-P immunohistochemistry was used to examine the expression of Bcl-2 and Bax in liver tissue of different groups of Wistar rats.Result：（1） Morphology and HE staining： compared with the group A， the group became B ragged and yellow spots appeared on some surfaces. Liver cells appeared steatosis， spotty necrosis and inflammatory cell infiltration by HE staining. Compared with the group B， there were less steatosis and spotty necrosis in the group C （C1， C2， C3）. （2） TUNEL staining showed that increased the dosage of Propofol， apoptosis cells of liver cancer cells increased， the AI was increased gradually， the difference was statistical significance （P＜0.05）. （3）Compared with the group A， the expression of Bcl-2 increased， and the expression of Bax decreased in the group B， the difference was statistically significant（P＜0.05）. Compared with the group B， the Bcl - 2 expression decreased liver cells in the group C （C1， C2 and C3）， and increased with the increase of dosage of Propofol showed a trend of decline， the difference was statistically significant （P＜0.05）； Bax expression was raised， and increased with the increase of Propofol dose increased trend， the difference was statistically significant （P＜0.05）.Conclusion：The rate of Bcl-2 /Bax is decreased by Propofol，which could inhibit the proliferation of HCC cells.

Propofol； Hepatic carcinoma； Apoptosis； Bcl-2； Bax

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.12.010

2014-02-18） （本文編輯：蔡元元）

①山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院 山西 太原 030001

曹定睿

First-author’s address：The First Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China