王龍，趙宏圖，于嵐，郭美錦，儲(chǔ)炬，張嗣良

華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237

龜裂鏈霉菌Streptomyces rimosus是工業(yè)化生產(chǎn)土霉素 (Oxytetracycline，OTC)的主要生產(chǎn)菌株。自1950年以來(lái)，有大量報(bào)道關(guān)于龜裂鏈霉菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化[1-2]、菌株誘變[3-4]以及基因水平改造[5]等手段以顯著提高其土霉素生產(chǎn)能力。本課題組深入研究了磷酸戊糖途徑 (PPP)中zwf基因[6-8]對(duì)土霉素合成的影響，并發(fā)現(xiàn)當(dāng)增加土霉素合成的初始復(fù)合酶體系MiniPKS的表達(dá)量時(shí)[9]，土霉素產(chǎn)量顯著提高。但對(duì)基因改造后變化的內(nèi)在機(jī)制并未詳細(xì)解釋，主要是由于缺乏龜裂鏈霉菌初級(jí)代謝和次級(jí)代謝途徑之間變化的相關(guān)信息。由于龜裂鏈霉菌代謝網(wǎng)絡(luò)信息的匱乏，且沒(méi)有可用于標(biāo)記實(shí)驗(yàn)的合成培養(yǎng)基等條件限制，目前尚未有關(guān)于龜裂鏈霉菌中代謝通量分析的報(bào)道。

關(guān)于龜裂鏈霉菌合成培養(yǎng)基研究的相關(guān)文獻(xiàn)較少，主要是Zygmunt在20世紀(jì)60年代進(jìn)行了初步探索[10-13]。Zygmunt認(rèn)為有機(jī)氮源的添加是促進(jìn)土霉素合成所必需的，并確定了以葡萄糖和天冬氨酸為碳氮源的S-3合成培養(yǎng)基，其土霉素產(chǎn)量最高達(dá)150 mg/L。由于S-3合成培養(yǎng)基中含有1%的天冬氨酸，在龜裂鏈霉菌中天冬氨酸的代謝途徑尚不清楚，從而降低構(gòu)建的龜裂鏈霉菌代謝網(wǎng)絡(luò)的可信度。同時(shí)天冬氨酸也可作為碳源進(jìn)入中心碳代謝途徑，導(dǎo)致增加標(biāo)記信息分析和代謝通量估計(jì)的復(fù)雜度。

因此本論文通過(guò)采用不同氮源對(duì)天冬氨酸進(jìn)行替換，試圖篩選出合適氮源，隨后應(yīng)用響應(yīng)面方法對(duì)合成培養(yǎng)基各組分進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得適合龜裂鏈霉菌生長(zhǎng)和土霉素合成并不干擾13C示蹤分析中氨基酸標(biāo)記信息的合成培養(yǎng)基。

1 材料與方法

1.1 菌種

龜裂鏈霉菌模式菌株M4018，由英國(guó)Strathclyde大學(xué)Iain S Hunter教授惠贈(zèng)。

1.2 培養(yǎng)基

MS斜面培養(yǎng)基：豆粉2%，甘露醇2%，瓊脂2%。

初始合成培養(yǎng)基：葡萄糖 1%，磷酸氫二銨0.02%，天冬氨酸1%，氯化鈉0.5%，磷酸氫二鉀0.2%，硫酸鎂0.1%，無(wú)水氯化鈣 0.03%，硫酸亞鐵0.002%，硫酸鋅 0.001%，pH 7.1–7.2。

天冬氨酸替換實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)思路：考慮到各個(gè)氨基酸的可溶性和等電點(diǎn)，選取谷氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、精氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、組氨酸、丙氨酸、酪氨酸、賴氨酸和尿素作為有機(jī)氮源，硫酸銨、硝酸銨、氯化銨、甲酸銨、乙酸銨、硝酸鈣、磷酸二氫銨、硝酸鉀和硝酸鈉作為無(wú)機(jī)氮源，初始pH均調(diào)節(jié)至7.1左右，均以1%的含量進(jìn)行添加，其余成分保持不變。

1.3 搖瓶發(fā)酵

將–20℃保存的甘油孢子液劃線于MS培養(yǎng)基中，分離純化單菌落后接種于MS培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)5–7 d，獲得成熟的孢子。收集孢子，過(guò)濾，并稀釋至合適倍數(shù)進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。然后以1×106個(gè)孢子/mL接種量，接種至合成培養(yǎng)基中，30℃、220 r/min搖瓶發(fā)酵5 d。過(guò)程中定時(shí)取樣，每個(gè)樣品做3個(gè)平行。

1.4 細(xì)胞干重的測(cè)定

取一定體積發(fā)酵液，12 000 r/min離心5 min，棄上清液，菌體沉淀放置于85℃烘箱中，烘干至恒重，稱重。

1.5 土霉素含量的測(cè)定

取1 mL發(fā)酵液，添加9 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至1.5–1.7，放置5 min，過(guò)濾后采用高效液相色譜法(HPLC) 分析[9]。

1.6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

首先設(shè)計(jì)Plackett-Burman試驗(yàn)，考察合成培養(yǎng)基中各組分對(duì)土霉素效價(jià)影響的顯著性；隨后設(shè)計(jì)影響最顯著因素的最陡爬坡實(shí)驗(yàn)，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)的因素和水平，以確定顯著性因素的最佳值。

1.7 菌體蛋白氨基酸標(biāo)記信息

菌體蛋白處理和測(cè)前衍生參照文獻(xiàn)[14]，衍生后的樣品過(guò)濾后進(jìn)行GC-MS測(cè)定。

GC-MS測(cè)定：GC采用HP5MX柱，起始柱溫160℃，保持1 min，以20℃/min升溫至310℃，保持0.5 min；進(jìn)樣口溫度280℃；載氣為高純氦氣，恒流，載氣流速1.5 mL/min，分流比1∶10；進(jìn)樣量1 μL；MS條件為：EI電離方式，離子源溫度230℃，全掃描模式，掃描質(zhì)量范圍180?550。

1.8 氨基酸特征碎片總同位素標(biāo)記豐度 (SFL)的計(jì)算

其中n是氨基酸的碳原子數(shù)，mi是氨基酸含有i個(gè)標(biāo)記原子的質(zhì)量同位素豐度。

2 結(jié)果與分析

2.1 合適氮源的篩選

龜裂鏈霉菌M4018在12種有機(jī)氮源和9種無(wú)機(jī)氮源合成培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)以及土霉素合成如圖1所示。從圖中可知M4018在含有天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、丙氨酸和脯氨酸等有機(jī)氮源的培養(yǎng)基中都能生長(zhǎng)并產(chǎn)素；在含有蘇氨酸或者酪氨酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)緩慢，基本不產(chǎn)素；在含有硝酸鉀、硝酸鈉、硝酸鈣和磷酸二氫銨的培養(yǎng)基中均能良好的生長(zhǎng)，并產(chǎn)生一定量的土霉素 (50?80 mg/L之間)；而在含有硫酸銨、硝酸銨、氯化銨、甲酸銨和乙酸銨等常規(guī)無(wú)機(jī)氮源的培養(yǎng)基中均無(wú)法生長(zhǎng)。

圖1 不同氮源對(duì)M4018生長(zhǎng)和產(chǎn)素的影響Fig.1 Effect of different nitrogen sources on OTC production and cell growth of S.rimosus M4018.1:HCOONH4;2:CH3COONH4;3:NH4Cl;4:(NH4)2SO4;5:NH4NO3;6:Ca(NO3)2;7:NH4H2PO4;8:NaNO3;9:KNO3;10:tyrosine;11:threonine;12:histidine;13:arginine;14:asparagine;15:urea;16:proline;17:alanine;18:lysine;19:glycine;20:glutamate;21:aspartate.

結(jié)果證實(shí)了與無(wú)機(jī)氮源相比有機(jī)氮源的添加確實(shí)有利于龜裂鏈霉菌的生長(zhǎng)以及土霉素的合成，但首次發(fā)現(xiàn)有機(jī)氮源的添加并非是促進(jìn)土霉素合成所必需的。因此考慮通過(guò)對(duì)篩選得到的硝酸鉀、硝酸鈉、硝酸鈣和磷酸二氫銨這4種無(wú)機(jī)氮源做進(jìn)一步優(yōu)化以獲得合適的培養(yǎng)基。

2.2 無(wú)機(jī)氮源的進(jìn)一步確定

對(duì)上述4種無(wú)機(jī)氮源進(jìn)行重復(fù)搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證，培養(yǎng)過(guò)程中每隔24 h取樣1次，觀察菌體生長(zhǎng)和土霉素合成變化規(guī)律。結(jié)果表明龜裂鏈霉菌M4018在以磷酸二氫銨為氮源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較好，而在以硝酸鉀和硝酸鈉為氮源的培養(yǎng)基中土霉素產(chǎn)量較高，分別為75.18 mg/L和68.57 mg/L，此時(shí)二者土霉素的相對(duì)效價(jià)分別為10.83 mg/g DCW和11.68 mg/g DCW。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，硝酸鈉和硝酸鉀是適合龜裂鏈霉菌生長(zhǎng)和產(chǎn)素，由于培養(yǎng)基中同時(shí)含有大量的氯化鈉，因此選擇硝酸鉀為合成培養(yǎng)基中的主要氮源。并添加3-嗎啉丙磺酸(3-Morpholinopropanesulfonic acid，MOPS)和磷酸二氫鉀作為緩沖體系。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化無(wú)機(jī)氮源合成培養(yǎng)基

2.3.1 Plaekett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)選取培養(yǎng)基中的8種成分作為考察因素，以土霉素效價(jià)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用Design-Expert軟件進(jìn)行n=12的Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)。表1顯示培養(yǎng)基中對(duì)土霉素效價(jià)影響顯著 (可信度＞95%)的3個(gè)因素為：葡萄糖、硝酸鉀和氯化鈉。

2.3.2 中心組合試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化

篩選獲得影響土霉素合成的顯著因素：葡萄糖、硝酸鉀和氯化鈉后，通過(guò)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)獲得中心組合設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。隨后設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，以土霉素效價(jià)為響應(yīng)值，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因子水平及效價(jià)評(píng)價(jià)Table 1 Factor levels and efficiency evaluation in Plackett-Burman design

運(yùn)用SAS和Design-Expert軟件對(duì)中心組合試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到葡萄糖 (A)、硝酸鉀 (B)、氯化鈉 (C)與土霉素效價(jià) (Y)的關(guān)系，其多元二次回歸方程：Y=142.75+0.69A+5.46B–2.58C+3.98AB+2.08AC+3.97BC–10.31A2–12.00B2–4.16C2。由表 3 的方差分析結(jié)果表明：該模型是極顯著 (P＜0.000 1)；失擬項(xiàng)不顯著 (P=0.135 1)；方程的決定系數(shù)R2為98.9%，AdjR2為97.8%，因此可以認(rèn)為該擬合方法和建立的模型對(duì)于效價(jià)的統(tǒng)計(jì)分析是有效的。通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化得到最優(yōu)值為葡萄糖24.2 g/L，硝酸鉀3.7 g/L，氯化鈉2.0 g/L。

表2 中心組合設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)表及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Design and result of Central Composite Design experiment

表3 回歸模型的方差分析Table 3 ANOVAof quadratic polynomial model

通過(guò)Design-Expert軟件對(duì)中心組合試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，葡萄糖、硝酸鉀和氯化鈉顯著因素相互之間交互作用強(qiáng)，最優(yōu)值均落在實(shí)驗(yàn)考察的區(qū)間內(nèi)。

2.3.3 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

按照優(yōu)化后的最佳合成培養(yǎng)基配方 (命名為S-4)，分5批進(jìn)行搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證，所得的土霉素效價(jià)平均值為145.60 mg/L，與最高預(yù)測(cè)理論值143.58 mg/L非常接近，說(shuō)明所設(shè)模型與真實(shí)情況相符，回歸模型可靠。此時(shí)菌體干重平均值為6.32 g/L，相比于最初的5.87 g/L，菌體干重也輕微提高7.7%。

2.4 100%的1-13C葡萄糖標(biāo)記實(shí)驗(yàn)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證獲得的S-4合成培養(yǎng)基可以用于13C示蹤分析，將S-4合成培養(yǎng)基中的葡萄糖用100%的1-13C葡萄糖替換，接種龜裂鏈霉菌M4018孢子后發(fā)酵培養(yǎng)，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期取樣分析。

如圖2所示，在以100%的1-13C葡萄糖為唯一碳源的合成培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，若葡萄糖僅通過(guò)糖酵解途徑 (EMP)利用，會(huì)產(chǎn)生50%的3-13C丙酮酸；若葡萄糖僅通過(guò)ED途徑利用，則會(huì)產(chǎn)生50%的1-13C丙酮酸；若葡萄糖僅通過(guò)PPP途徑，一位標(biāo)記的碳原子以13CO2形式釋放，無(wú)標(biāo)記丙酮酸產(chǎn)生。因此通過(guò)比較丙酮酸各碳原子 (Pyr1、Pyr2和Pyr3)的SFL[15-16]即可定性比較葡萄糖3大代謝途徑通量的相對(duì)大小。

圖2 1-13C葡萄糖在EMP、PPP和ED途徑中碳原子的代謝轉(zhuǎn)移Fig.2 Metabolism of the carbon atoms of 1-13C glucose via the EMP,PPP and ED pathways.

丙氨酸和纈氨酸的所有碳骨架都是來(lái)自于丙酮酸，因此丙酮酸的SFL值可從丙氨酸和纈氨酸的SEL值相應(yīng)得到，Pyr1=Pyr1-2-3?Pyr2-3。從表4中計(jì)算得到Pyr1的SFL值為1.23%，與丙酮酸的天然同位素豐度1.1%非常接近，即可認(rèn)為丙酮酸的一位碳并未攜帶標(biāo)記。即通過(guò)標(biāo)記實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在龜裂鏈霉菌M4018中不存在ED途徑。

表4 丙酮酸族氨基酸的SFL值Table4 Summed fractionallabellings(SFLs)of pyruvate-derived amino acid fragments

3 討論

通過(guò)比較龜裂鏈霉菌在不同有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源的生長(zhǎng)和產(chǎn)素情況，首次發(fā)現(xiàn)龜裂鏈霉菌也能在以硝酸鉀為主要氮源的合成培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，在此基礎(chǔ)上對(duì)初始無(wú)機(jī)氮源合成培養(yǎng)基進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，得到最優(yōu)的合成培養(yǎng)基S-4配方 (g/L)：葡萄糖24.2，硝酸鉀 3.7，氯化鈉 2.0，磷酸氫二鉀 4.0，硫酸鎂 0.5，氯化鈣 0.1，磷酸氫二銨 0.4，MOPS 7，硫酸亞鐵 0.02，硫酸鋅 0.01。在此培養(yǎng)基上菌體干重最高達(dá)6.32 g/L，土霉素效價(jià)由起始的75.2 mg/L提高到145.6 mg/L，提高193.6%，土霉素產(chǎn)量基本接近有機(jī)氮源的發(fā)酵水平，并成功排除在13C示蹤實(shí)驗(yàn)中額外碳源的干擾，為后續(xù)龜裂鏈霉菌各突變株中碳代謝途徑通量的分析提供良好的理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

采用100%的1-13C葡萄糖標(biāo)記試驗(yàn)，結(jié)果表明龜裂鏈霉菌M4018中葡萄糖是通過(guò)EMP途徑和PPP途徑進(jìn)行代謝，而不存在ED途徑。這與已經(jīng)報(bào)道的天藍(lán)色鏈霉菌[17]的代謝網(wǎng)絡(luò)模型一致。即首次從代謝流組學(xué)水平證實(shí)在龜裂鏈霉菌中ED途徑不存在。龜裂鏈霉菌M4018的基因組測(cè)序已經(jīng)由本課題組和英國(guó)Strathclyde大學(xué)Hunter教授課題組共同完成 (尚未公開(kāi))，基因比對(duì)的結(jié)果表明，龜裂鏈霉菌只存有ED途徑的第2步基因eda，從基因組水平上證實(shí)了該結(jié)果的可靠性。

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