于丹，葉賢龍，任桂萍，徐鵬飛，厲書杰，牛澤杉，李德山

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物制藥教研室，黑龍江 哈爾濱 150030

成纖維細(xì)胞生長因子-21(FGF-21)是成纖維細(xì)胞因子家族的新成員[1]，具有不依賴胰島素調(diào)節(jié)糖脂代謝[2]，改善胰島素抵抗，提高靶組織對胰島素敏感性等多種代謝調(diào)控功能，不會導(dǎo)致低血糖、水腫、過敏等毒副作用[3]。FGF-21在糖尿病臨床應(yīng)用方面具有很大的潛力，給糖尿病患者帶來新希望[4]。

大腸桿菌以包涵體形式表達(dá)外源蛋白，具有表達(dá)量及純度高的突出優(yōu)點(diǎn)，而可溶形式表達(dá)目的蛋白不僅產(chǎn)量低，而且上清中含有大量宿主細(xì)胞染色體翻譯表達(dá)的雜質(zhì)蛋白，純化工藝復(fù)雜[5-6]。目前，科研人員卻仍以大腸桿菌表達(dá)可溶形式FGF-21，這是因?yàn)镕GF-21蛋白本身結(jié)構(gòu)與性質(zhì)使其表達(dá)量及復(fù)性率降低[1-7]，復(fù)性后蛋白活性減弱甚至喪失。科研人員曾用多種表達(dá)載體及優(yōu)化各種方法以包涵體形式表達(dá)FGF-21，但均未能解決上述問題。

本實(shí)驗(yàn)采用SUMO表達(dá)載體首次以包涵體形式表達(dá)hFGF-21，突破了傳統(tǒng)包涵體離心洗滌，人工變復(fù)性的復(fù)雜生產(chǎn)工藝，將中空纖維柱膜過濾技術(shù)應(yīng)用于包涵體形式蛋白的整個(gè)生產(chǎn)過程中。最終，90%以上SUMO-hFGF-21形成包涵體，其表達(dá)量約為可溶性表達(dá)的3倍；由于復(fù)性條件溫和及作為分子伴侶的SUMO標(biāo)簽促進(jìn)了蛋白質(zhì)的正確折疊[8]，使hFGF-21復(fù)性率顯著提高，獲得的ihFGF-21生物學(xué)活性較shFGF-21無顯著差異，為hFGF-21由實(shí)驗(yàn)室向中試及產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了更經(jīng)濟(jì)、更高效的策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 工程菌

攜帶pSUMO-hFGF-21質(zhì)粒的工程菌由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生物制藥教研室提供。

1.1.2 試劑

異丙基硫代β-D-半乳糖苷 (IPTG)、溶菌酶、氨芐青霉素 (Amp)購自TaKaRa公司。葡萄糖檢測試劑盒購自北京金豪制藥股份有限公司。Quixstand膜處理系統(tǒng)，750 kDa和10 kDa中空纖維柱，AKTATMpurifier100系統(tǒng)，Ni Sepharose 6 FF及HiPrep 26/10 Desalting均購自GE公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及動物

HepG2細(xì)胞為東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生物制藥教研室提供。db/db小鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，動物質(zhì)量合格證號SCXK(滬)2013-0002。

1.2 方法

1.2.1 人成纖維細(xì)胞生長因子-21融合蛋白(iSUMO-hFGF-21)的包涵體表達(dá)

取保存于–80℃的攜帶pSUMO-hFGF-21質(zhì)粒的工程菌，在含有氨芐青霉素 (100 U/mL)的TB固體培養(yǎng)基上劃線，37℃培養(yǎng)過夜;挑取單菌落，接種于20 mL TB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)10 h后，以1∶100的比例接種于500mL含氨芐青霉素(100 U/mL)TB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)約3.5 h，A600=0.6–0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度為 0.25mmol/L，37℃誘導(dǎo)4 h后，4 000 r/min離心30 min收集菌體，15%SDS-PAGE鑒定表達(dá)量。

1.2.2 iSUMO-hFGF-21包涵體的提取、洗滌、變性及復(fù)性

將收集的菌體按1 g/10 mL的比例懸浮于平衡緩沖液 (40 mmol/L咪唑，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Na3PO4，pH 7.4)中，加入終濃度為1 mg/mL的溶菌酶，冰上放置1 h，超聲波破碎菌體細(xì)胞 (工作 1 s，間隔 1 s，4 min/次，共 3 次)。

用750 kDa中空纖維柱超濾膜富集包涵體，棄去滲透端流出液體。當(dāng)總體積約為50 mL時(shí)，加入 200 mL洗滌液 (20 mmol/L Na3PO4，2 mol/L尿素，150 mmol/L NaCl，pH 8.0)洗滌包涵體，當(dāng)溶液體積為50 mL，再向其中加入洗滌液至200 mL。重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)4次。

在750 kDa的中空纖維柱超濾膜中，關(guān)閉滲透端，向洗滌后的包涵體中加入200 mL的變性液 (20 mmol/L Na3PO4，8 mol/L Urea，150 mmol/L NaCl，pH 8.0)，循環(huán)變性2 h。完全變性后，打開滲透端，滲透端收集液即為iSUMO-hFGF-21變性液。用10 kDa中空纖維柱對變性后的iSUMO-hFGF-21進(jìn)行復(fù)性：將盛有復(fù)性液的三角瓶 (20 mmol/L Na3PO4，150 mmol/L NaCl，pH 8.0)用膠皮管與中空纖維柱的儲液器連接。向儲液器中加入變性液后，打開透過端，由于儲存器中產(chǎn)生負(fù)壓，使復(fù)性液以一定的速度滴加至變性液中，緩慢復(fù)性。當(dāng)加入復(fù)性液總體積為變性液體積20倍時(shí)，8 000 r/min、4℃離心20 min，收集上清，即完成iSUMO-hFGF-21的復(fù)性。

1.2.3 ihFGF-21的純化

用平衡緩沖液(40 mmol/L咪唑，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Na3PO4，pH 7.4)平衡 Ni Sepharose 6 FF親和層析柱5個(gè)柱體積后，上樣。再用平衡緩沖液洗去非特異性吸附的雜質(zhì)蛋白，洗脫液 (500 mmol/L咪唑，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Na3PO4，pH 7.4)洗脫融合蛋白iSUMO-hFGF-21，收集洗脫峰。經(jīng)Sephadex G-25脫鹽柱將iSUMO-hFGF-21置換到磷酸鹽緩沖溶液 (50 mmol/L Na3PO4，150 mmol/L NaCl，pH 7.0)中，加入SUMO 蛋白酶I至終濃度為2 mmol/L，4℃酶切過夜[9]。再經(jīng)Ni Sepharose 6 FF親和層析，收集流穿液，15%SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白ihFGF-21的產(chǎn)量及純度。

1.2.4 shFGF-21的表達(dá)與純化

將攜帶重組質(zhì)粒 pSUMO-hFGF-21的工程菌，劃線培養(yǎng)；單菌落接種至20 mL含氨芐青霉素 (100 U/mL)LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)10 h，按1%的比例接種于500 mL/瓶含氨芐青霉素(100 U/mL)LB培養(yǎng)基三角瓶中，37℃培養(yǎng)2.5 h，A600=0.3–0.4時(shí)，加入IPTG至濃度為0.25 mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)，4 h后4 000 r/min、4℃離心30 min，以1 g/10 mL的比例重懸菌體，放置–20℃保存；待收集上述菌體20 L后，超聲波破碎；破碎完全后4 000 r/min、4℃離心30 min。shFGF-21純化策略，產(chǎn)量和純度檢驗(yàn)方法與上述ihFGF-21相同。

1.2.5 免疫印跡法檢測ihFGF-21

以shFGF-21作為陽性對照，BSA作為陰性對照，將純化的產(chǎn)物進(jìn)行15%SDS-PAGE電泳然后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)膜完成后，經(jīng)5%脫脂奶粉-PBS-0.05%Tween 20室溫封閉2 h，與兔抗人FGF-21單抗反應(yīng)12 h，PBS洗滌5次，每次5 min。再與HRP偶聯(lián)的羊抗兔二抗室溫反應(yīng)2 h，洗滌后加入發(fā)光底物DAB避光顯影。

1.2.6 ihFGF-21與shFGF-21細(xì)胞水平上生物學(xué)活性的比較

利用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法(GOD-POD)[10]檢測hFGF-21促進(jìn)細(xì)胞糖吸收的生物學(xué)作用。HepG2細(xì)胞饑餓12 h后，分別用10、100及 1 000 nmol/L的ihmFGF21蛋白和shFGF21蛋白刺激細(xì)胞 24 h；在24 h時(shí)，分別取培養(yǎng)上清液2 μL，加入到200 μL葡萄糖檢測液中，37℃反應(yīng)5–10 min，在490 nm波長下檢測其OD值。每孔重復(fù)3次，按公式計(jì)算細(xì)胞對葡萄糖的消耗率并運(yùn)用SPSS軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)。

計(jì)算培養(yǎng)液中殘留的葡萄糖的濃度，公式為：

葡萄糖濃度 (mmol/L)=OD樣品/OD標(biāo)準(zhǔn)×5.55 mmol/L。

計(jì)算細(xì)胞對葡萄糖的消耗率，公式為：

細(xì)胞葡萄糖消耗率 (%)=[(C空白葡萄糖–C給藥葡萄糖)/C空白葡萄糖]×100%。

1.2.7 ihFGF-21與shFGF-21調(diào)節(jié)2型糖尿病模型db/db鼠短期與長期生物學(xué)活性的比較

將成模的db/db小鼠隨機(jī)分為 3組，每組5只。通過皮下注射的方式，給予各實(shí)驗(yàn)組相應(yīng)的蛋白1次，劑量0.5 mg/kg，模型對照組注射相同體積的生理鹽水，給藥3 h后，尾靜脈取血檢測血糖濃度，比較兩種蛋白調(diào)節(jié)模型小鼠血糖的短期降糖效果。每天早上8點(diǎn)給藥，連續(xù)注射16 d，每兩天檢測各處理組小鼠的血糖1次，停藥后繼續(xù)觀察小鼠血糖3 d，觀察兩種蛋白的長期降糖活性的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 iSUMO-hFGF-21與sSUMO-hFGF-21的表達(dá)量分析

取3 mL菌液，離心、破碎完全后，15%SDS-PAGE電泳比較iSUMO-hFGF-21與sSUMO-hFGF-21的表達(dá)量，根據(jù)凝膠成像灰度分析軟件分析表明，iSUMO-hFGF-21的表達(dá)量約是sSUMO-hFGF-21的3倍，結(jié)果如圖1所示。

2.2 iSUMO-hFGF-21包涵體的提取、洗滌、變性及復(fù)性

菌體破碎完全后，應(yīng)用中空纖維柱對包涵體進(jìn)行洗滌，除去部分雜質(zhì)蛋白、脂質(zhì)、核酸等。重復(fù)洗滌3次后，溶解包涵體，當(dāng)溶液呈棕黃色、透明狀態(tài)時(shí)，打開滲透端，收集滲透端流出液即為完全變性的iSUMO-hFGF-21。用10 kDa中空纖維柱對融合蛋白iSUMO-hFGF-21進(jìn)行復(fù)性后，8 000 r/min、4℃離心20 min，收集上清。經(jīng)SDS-PAGE分析可知，洗滌及復(fù)性過程中iSUMO-hFGF-21幾乎無損失，且洗滌后iSUMO-hFGF-21包涵體的純度為73%，說明應(yīng)用中空纖維柱膜過濾技術(shù)，不僅提高了蛋白的收率，而且提高目的蛋白的純度，結(jié)果如圖2所示。

2.3 ihFGF-21的純化

圖2 SDS-PAGE分析iSUMO-hFGF-21的純度Fig.2 Purity analysis of the iSUMO-hFGF-21 protein by SDS-PAGE.M:the relative molecular mass of standard proteins;1:iSUMO-hFGF-21 before washing(20 μL);2：iSUMO-hFGF-21before washing(10 μL);3:iSUMO-hFGF-21 afterwashing;4:supernatantof iSUMO-hFGF-21 after denaturing;5:supernatant of iSUMO-hFGF-21 after refolding.

圖3 iSUMO-hFGF-21親和層析純化結(jié)果Fig. 3 Affinity chromatography result of iSUMO-hFGF-21.

結(jié)果顯示，經(jīng)過Ni Sepharose FF親和層析(圖3)，Sephadex G-25脫鹽，酶切以及再次應(yīng)用親和層析 (圖4)后，收集流穿液即為成熟的ihFGF-21，15%SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白hFGF-21的濃度及純度。根據(jù)凝膠成像分析軟件灰度分析表明，ihFGF-21的純度約為95%以上，最終收率約為20 mg/L(圖5)。

2.4 shFGF-21的表達(dá)與純化

結(jié)果顯示，經(jīng)過Ni Sepharose FF親和層析(圖6)，Sephadex G-25脫鹽，酶切以及再次親和層析后，收集流穿液即為成熟的ihFGF-21，15%SDS-PAGE電泳檢測hFGF-21的濃度及純度。根據(jù)凝膠成像分析軟件灰度分析表明，shFGF-21純度為90%，總的表達(dá)量為6 mg/L(圖7)。

圖4 ihFGF-21親和層析純化結(jié)果Fig.4 Affinity chromatography result of ihFGF-21.

圖5 iSUMO-hFGF-21和ihFGF-21純化后蛋白表達(dá)量與純度分析Fig.5 Yield and purity analysis of the ihFGF-21 protein after purification.M:the relative molecular mass of standard proteins;1:iSUMO-hFGF-21 protein;2,3:mature ihFGF-21 after enzyme digestion and purification.

2.5 ihFGF-21與shFGF-21免疫印跡比較理化性質(zhì)的差異

圖7 SDS-PAGE分析純化后shFGF-21的收率及純度Fig.7 Yield and purity analysis of the shFGF-21 protein after purification.M:the relative molecular mass of standard proteins;1:mature shFGF-21.

經(jīng)Anti-ihFGF-21單抗的免疫印跡實(shí)驗(yàn)(其中BSA為陰性對照，shFGF-21為陽性對照)，硝酸纖維素膜上，陰性對照BSA泳道為空白，陽性對照shFGF-21與實(shí)驗(yàn)組ihFGF-21均出現(xiàn)單一條帶 (圖8)，證明純化的目的蛋白為成纖維細(xì)胞生長因子-21。

2.6 ihFGF-21與shFGF-21細(xì)胞水平上生物學(xué)活性的比較

結(jié)果如圖9所示，經(jīng)過10、100、1000 nmol/L shFGF-21與ihFGF-21分別刺激后的細(xì)胞，采用GOD-POD法檢測其葡萄糖吸收率；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對照組相比，兩者均能顯著增加細(xì)胞葡萄糖吸收率，且呈劑量依賴性；不同濃度的shFGF-21與ihFGF-21促進(jìn)細(xì)胞糖吸收的生物學(xué)活性無顯著差異 (P=0.563>0.05)，說明ihFGF-21與shFGF-21細(xì)胞水平上促進(jìn)HepG2細(xì)胞糖吸收的生物學(xué)活性并沒有顯著差異，證明了采用中空纖維柱提取包涵體形式表達(dá)的FGF-21時(shí)，并沒有降低蛋白的生物學(xué)活性，此種提取工藝可行。

2.7 ihFGF-21與shFGF-21對db/db糖尿病模型鼠的短期降糖生物學(xué)活性的比較

注射前后，注射生理鹽水的模型對照組血糖沒有變化；注射3 h后，模型對照組的血糖由(16.02±4.29)mmol/L 升至(16.18±1.79)mmol/L，shFGF-21組血糖由(15.92±4.301)mmol/L降至(10.02±3.43)mmol/L，ihFGF-21 組 血 糖 由(16.15±3.67)mmol/L 降至(10.00±1.59)mmol/L。與模型對照組相比，無論作用效果還是作用時(shí)間，兩種途徑獲得的成熟蛋白都表現(xiàn)出了良好的降糖效果，血糖在注射1 h開始下降，注射3 h降糖效果較模型對照組相比差異極顯著，shFGF-21組與ihFGF-21組差異不顯著，結(jié)果如圖10所示。

2.8 ihFGF-21與shFGF-21對db/db糖尿病模型鼠的長期降糖生物學(xué)活性的比較

連續(xù)注射16 d后，檢測血糖。在長期調(diào)節(jié)2型糖尿病模型db/db鼠血糖的生物學(xué)功能上，與模型對照組相比，ihFGF-21與shFGF-21均表現(xiàn)出了顯著的差異，但兩者之間無顯著差異；兩者均能長期持續(xù)的調(diào)節(jié)2型糖尿病模型db/db鼠的血糖，停止注射3 d后，均恢復(fù)至與模型對照組相同的血糖水平 (圖11)。說明此法可以保證獲得的ihFGF-21的生物學(xué)活性，是提取hFGF-21的有效方法。

圖8 ihFGF-21與shFGF-21免疫印跡比較理化性質(zhì)差異的分析Fig.8 Physical properties analysis of the difference between the ihFGF-21 and shFGF-21 proteins.1:mature ihFGF-21;2:mature shFGF-21;3:BSA;M:the relative molecular mass of standard proteins.

圖10 ihFGF-21與shFGF-2對db/db糖尿病模型鼠的短期降糖效果的比較Fig.10 Comparation of ihFGF-21and shFGF-21 on short-term hypoglycemic effect.The db/db mice were treated with 0.5 mg/kg shFGF-21 or ihFGF-21.The blood glucose level of the model mice were examined at 0 h and 3 h.The valuesshown are the average of 6 independent measurements.**P<0.01 vs control.

圖11 ihFGF-21與shFGF-21對db/db糖尿病模型鼠的長期降糖生物學(xué)活性的比較Fig.11 Comparation of ihFGF-21 and shFGF-21 on long-term hypoglycemic effect.The db/db mice were administrated once a day with saline (control),0.5 mg/kg shFGF-21 or ihFGF-21 for 16 d.The blood glucose level of db/db mice were examined before injection each day at 8 am.The valuesshown are the average of 6 independent measurements.

3 討論

近年來，隨著人們對成纖維細(xì)胞生長因子-21(FGF-21)結(jié)構(gòu)和功能的深入研究， FGF-21安全、可靠，不依賴胰島素單獨(dú)調(diào)節(jié)糖脂代謝，改善胰島素抵抗，無副作用的報(bào)道，使其成為治療糖尿病、肥胖、脂肪肝等代謝疾病的潛力藥[11-12]。目前，F(xiàn)GF-21的生產(chǎn)已經(jīng)逐漸由實(shí)驗(yàn)室向中試規(guī)模轉(zhuǎn)變，開發(fā)高效、高純度的FGF-21的生產(chǎn)工藝，成為科研人員共同關(guān)注的焦點(diǎn)。

盡管大腸桿菌在表達(dá)外源基因方面有眾多的優(yōu)點(diǎn)，但是外源基因的高效表達(dá)[13]，除受到其本身性質(zhì)影響外，還與表達(dá)系統(tǒng)的特性及其他因素密切相關(guān)。本研究通過優(yōu)化本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的攜帶pSUMO-hFGF-21質(zhì)粒工程菌的培養(yǎng)條件，采用TB培養(yǎng)基，150 r/min搖瓶培養(yǎng)，當(dāng)菌體生長至A600=0.6–0.8時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)，37℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h，90%以上的SUMO-hFGF-21以包涵體形式表達(dá)，其表達(dá)量為可溶性表達(dá)表達(dá)量的3倍。這是由于采用包涵體形式表達(dá)FGF-21時(shí)，誘導(dǎo)溫度及轉(zhuǎn)速的升高提高了細(xì)胞內(nèi)相關(guān)酶的活性，增加了溶氧；菌體濃度的增加，提高了蛋白的表達(dá)量；蛋白表達(dá)過快，無法快速正確折疊，從而形成包涵體[14]。包涵體形式表達(dá)FGF-21，提高了蛋白表達(dá)量，降低了生產(chǎn)成本，有利于規(guī)?；a(chǎn)。

如何對包涵體蛋白質(zhì)進(jìn)行體外高效復(fù)性是基因工程技術(shù)面臨的一個(gè)重要難題。傳統(tǒng)方法提取包涵體蛋白，不僅工藝復(fù)雜，生產(chǎn)周期長，而且復(fù)性率低，蛋白損失嚴(yán)重，復(fù)性后蛋白活性降低甚至無活性。而應(yīng)用中空纖維柱膜過濾技術(shù)提取包涵體途徑純化表達(dá)的hFGF-21，顯著提高了蛋白的復(fù)性率。這可能是因?yàn)橹锌绽w維柱復(fù)性過程中，將復(fù)性液緩慢加入變性液中，以緩慢的速度除去變性劑；變性劑除了能溶解包涵體使其去折疊外，在復(fù)性過程中還可以有效地抑制復(fù)性中間體相互聚集，從而增加復(fù)性率[15]。

本實(shí)驗(yàn)從包涵體富集到復(fù)性，都采用中空纖維柱膜過濾技術(shù)，充分發(fā)揮了其處理量大、處理能力持久的優(yōu)勢。與傳統(tǒng)的離心方法相比，應(yīng)用中空纖維柱對包涵體進(jìn)行洗滌使生產(chǎn)周期縮短了1/3，且有效降低蛋白損失；大部分雜蛋白、脂類等雜質(zhì)可透過膜孔，使包涵體洗滌更加徹底；循環(huán)變性2 h后，直接對變性液進(jìn)行澄清，然后利用密閉儲藏器內(nèi)產(chǎn)生的負(fù)壓緩慢加入復(fù)性液，緩慢進(jìn)行稀釋復(fù)性，保證了溫和的復(fù)性條件，有利于提高FGF-21的正確折疊效率，最后通過離心獲得初級純化后的蛋白溶液。整個(gè)過程都在4℃展示柜中進(jìn)行，低溫環(huán)境，有利于FGF-21的正確折疊[16]。經(jīng)SDS-PAGE分析結(jié)果表明，iSUMO-hFGF-21的純度顯著高于sSUMO-hFGF-21，此法除去了多數(shù)非特異性吸附在層析介質(zhì)上的雜質(zhì)蛋白，簡化了純化工藝。

除此之外，本法獲得的成熟FGF-21的活性與可溶性表達(dá)獲得的FGF-21無顯著差別。通過免疫印跡法，證明所獲得的是hFGF-21。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，兩者均可促進(jìn)葡萄糖的吸收，且與空白對照組相比，差異顯著；在動物實(shí)驗(yàn)中，兩種途徑獲得的FGF-21在短期藥效實(shí)驗(yàn)中，均在注射1 h起作用，注射3 h血糖明顯降低；長期藥效實(shí)驗(yàn)中，連續(xù)注射均可使模型動物的血糖降至正常水平，且降糖效果無明顯差異，說明以包涵體途徑可保證FGF-21的生物學(xué)活性。分析原因可能有以下兩點(diǎn)：第一，作為分子伴侶的SUMO標(biāo)簽可以增強(qiáng)外源蛋白質(zhì)抗蛋白酶水解，顯著增加重組蛋白表達(dá)量[17]，促進(jìn)靶蛋白正確折疊，提高可溶性[18-19]等功能[20-23]；SUMO標(biāo)簽的存在能使靶蛋白維持在具有折疊能力的狀態(tài)并使它們進(jìn)行正確重折疊，同時(shí)能有效地保留靶蛋白質(zhì)聚集體中天然結(jié)構(gòu)；其機(jī)理可能是由于SUMO標(biāo)簽作為一個(gè)高度疏水的核心為目的蛋白的折疊提供成核位點(diǎn)，減少了蛋白之間的相互作用，使其正確折疊，最終增加了融合蛋白的可溶性[24]；第二，采用中空纖維柱操作，條件溫和，有利于蛋白質(zhì)的正確折疊，操作簡單，耗時(shí)短，避免了因長期暴露室溫導(dǎo)致蛋白活性下降。

中空纖維柱膜過濾技術(shù)，現(xiàn)已被廣泛用于菌體、細(xì)胞等的富集，菌液的澄清，緩沖液置換、蛋白濃縮等方面[25]。本實(shí)驗(yàn)采用中空纖維柱膜過濾技術(shù)對ihFGF-21進(jìn)行變復(fù)性，與shFGF-21相比較，生物活性上無顯著差異，使其在生命科學(xué)的領(lǐng)域中又有了新的應(yīng)用價(jià)值，為FGF-21的大規(guī)模生產(chǎn)提供了更實(shí)用、更高效的工藝。

[1]Kharitonenkov A,Shiyanova TL,Koester A,et al.FGF-21 as a novel metabolic regulator.J Clin Invest,2005,115(6):1627?1635.

[2]Zhao JZ,Sun GP,Ye XL,et al.The long lasting effect of the marine fibroblast growth factor-21 on blood glucose control of diabetic animals.Acta Pharm Sin,2013,48(3):352?358(in Chinese).趙景壯,孫國鵬,葉賢龍,等.鼠源成纖維細(xì)胞生長因子-21的長效降糖效果.藥學(xué)學(xué)報(bào),2013,48(3):352?358.

[3]Sun GP,Ye XL,Ren GP,et al.The influence of fibroblast growth factor-21 on animal models of type1 diabetesglycogen metabolism and its mechanism.Prog Biochem Biophys,2011,38(10):953?960(in Chinese).孫國鵬,葉賢龍,任桂萍,等.成纖維細(xì)胞生長因子-21對1型糖尿病動物模型的肝糖代謝影響及機(jī)制.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2011,38(10):953?960.

[4]Fan K,Tan KH,Zhang C,et al.The expression and production of soluble recombinant human fibroblast growth factor-21 in E.coli.J Chongqing Univ Technol,2011,25(5):18?22(in Chinese).范開,譚克海,張淳,等.大腸桿菌中可溶性表達(dá)重組人成纖維細(xì)胞生長因子-21及制備.重慶理工大學(xué)學(xué)報(bào),2011,25(5):18?22.

[5]Gao F,Fan QL,Zou WY,et al.Advances in technology of inclusion body protein chromatography refolding. Biotechnol Bull,2006(2):56?71(in Chinese).高飛,范清林,鄒文藝,等.包涵體蛋白的層析復(fù)性技術(shù)研究進(jìn)展.生物技術(shù)通報(bào),2006(2):56?71.

[6]Zhao XH,He XW,Li WM,et al.Development of in-vitro refolding of inclusion body proteins in E.coli.SciTechnol Food Ind,2010,31(6):379?384(in Chinese).趙喜紅,何小維,李文美,等.大腸桿菌表達(dá)包涵體蛋白體外復(fù)性研究進(jìn)展.食品工業(yè)科技,2010,31(6):379?384.

[7]Li J,Liu W,Xiao L,et al.Two strategies for efficient expression of solublerecombinant human FGF-21 protein.J East Chin Norm Univ:Nat Sci Ed,2012(6):114?121(in Chinese).李娟,劉雯,肖磊,等.實(shí)現(xiàn)人源FGF-21高效可溶性表達(dá)的兩種策略.華東師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2012(6):114?121.

[8]Ye XL,Gao HS,Wang WF,et al.Optimization and characterization of a novel FGF21 mutant.Acta Pharm Sin,2012,47(7):897?903(in Chinese).葉賢龍,高華山,王文飛,等.FGF21基因優(yōu)化及其生物活性研究.藥學(xué)學(xué)報(bào),2012,47(7):897?903.

[9]Li JN,Liu MY,Hou YT,et al.Efface of human FGF-21 on glucose metabolism in adipocytes.Chin J Biochem Mol Biol,2009,25(6):556?562(in Chinese).李晉南,劉銘瑤,侯玉婷,等.人源FGF-21在脂肪細(xì)胞糖代謝中的作用.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2009,25(6):556?562.

[10]Jing MY,Sun JY.Regulation of protein folding and the formation of inclusion body.J Zhejiang Univ:Agric& LifeSci,2004,30(6):690?696(in Chinese).井明艷,孫建義.蛋白質(zhì)的折疊調(diào)控與包涵體的形成.浙江大學(xué)學(xué)報(bào):農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版,2004,30(6):690?696.

[11]Kharitonenkov A,Wroblewski VJ,Koester A,et al.The metabolic state ofdiabetic monkeys is regulated by fibroblast growth factor-21.Endocrinology,2007,148(2):774?781.

[12]Coskun T,BinaHA,SchneiderMA,etal.Fibroblast growth factor-21 corrects obesity in mice.Endocrinology,2008,149(12):6018?6027.

[13]Xu CL,Yang M,Xu CB.Factors of E.coli expression system.Chin J Anim Health Insp,2010,27(8):66?68(in Chinese).許崇利,楊梅,許崇波.大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的影響因素.中國動物檢疫,2010,27(8):66?68．

[14]Ren GP,Jiang YY,Liu MY,et al.Research on SUMO integration system for efficient expression of solublemouse FGF-21 and itsactivity.J Northeast Agric Univ,2009,40(5):62?67(in Chinese).任桂萍,姜媛媛,劉銘瑤,等.SUMO融合系統(tǒng)高效表達(dá)可溶性鼠源 FGF-21及其活性的研究.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,40(5):62?67.

[15]Cui ZF,Guan YX,Yao SJ.Integrated applications ofseveralseparation methodsin the protein renaturation.BullSciTechnol,2004,29(2):99?104(in Chinese).崔志芳,關(guān)怡新,姚善涇.分離技術(shù)在蛋白質(zhì)復(fù)性中的集成化應(yīng)用及分析.科技通報(bào),2004,29(2):99?104.

[16]Vera A,González-Montalbán N,Arís A,et al.The conformational quality of insoluble recombinant proteins is enhanced at low growth temperatures.Biotechnol Bioeng,2007,96(6):1101?1106.

[17]Li JF,Zhang J,Zhang Z,et al.Production of bioactive human beta-defensin-4 in Escherichia coli using SUMO fusion partner.Protein J,2010,29(5):314?319.

[18]Satakarni M,Curtis R.Production of recombinant peptides as fusions with SUMO.Protein Expr Purif,2011,78(2):113?119.

[19]Marblestone JG,Edavettal SC,Lim Y,et al.Comparison of SUMO fusion technology with traditional gene fusion systems: enhanced expression and solubility with SUMO.Protein Sci,2006,15(1):182?189.

[20]Lee CD,Sun HC,Hu SM,et al.An improved SUMO fusion protein system for effective production of native proteins.Protein Sci,2008,17(7):1241?1248.

[21]Sun Z,Xia Z,Bi F,et al.Expression and purification of human urodilatin by small ubiquitin-related modifier fusion in Escherichia.Appl Microbiol Biotechnol,2008,78(3):495?502.

[22]Truong L,Hevener KE,Rice AJ,et al.High-level expression,purification,and characterization of Staphylococcus aureus dihydroorotase(PyrC)as a cleavable His-SUMO fusion.Protein Expr Purif,2013,88(1):98?106.

[23]Butt TR,Edavettal SC,Hall JP,et al.SUMO fusion technology for difficult to express proteins.Protein Expr Purif,2005,43(1):1?9.

[24]Wang Z,Li H,Guan W,et al.Human SUMO fusion systems enhance protein expression and solubility. Protein Expr Purif, 2010, 73(2):203?208.

[25]Diban N,Haimi S,Bolhuis-Versteeg L,et al.Hollow fibers of poly(lactide-co-glycolide)and poly(ε-caprolactone)blends for vascular tissue engineering applications.Acta Biomater,2013,9(5):6450?6458.