李宜鴻，李珊珊，艾國民，王為善，張部昌，楊克遷

1 安徽大學生命科學學院，安徽 合肥 230601

2 中國科學院微生物研究所 微生物資源前期開發(fā)國家重點實驗室，北京 100101

鏈霉菌能夠產(chǎn)生眾多具有生物活性的次級代謝產(chǎn)物，具有重要的研究與應用價值。其模式生物天藍色鏈霉菌Streptomyces coelicolor在2002年就已經(jīng)完成基因組測序，具有清晰的遺傳背景[1]。同時，該菌株能夠產(chǎn)生具有顏色的紅色次級代謝產(chǎn)物十一烷基靈菌紅素 (Undecylprodigiosin，Red) 與藍色次級代謝產(chǎn)物放線紫紅素(Actinhordin，Act)。因此，該菌是研究抗生素生物合成調(diào)控和鏈霉菌代謝工程改造的理想對象。

隨著組學技術(shù)的發(fā)展，系統(tǒng)生物學研究的地位日益顯著。代謝物作為生物信息傳遞的終端層次，在基因功能詮釋和代謝狀態(tài)分析等方面表現(xiàn)出了巨大的潛力。代謝物組學是一種通過定性定量測量生物體代謝產(chǎn)物的種類和濃度變化，分析系列關(guān)聯(lián)代謝物的綜合差異，從而發(fā)現(xiàn)生物系統(tǒng)對基因以及環(huán)境變化響應的研究方法[2-3]。由于代謝物組學能夠從系統(tǒng)生物學的高度集中闡釋生物體代謝所反映的全部信息，因此越來越多地受到科學家們的重視。代謝物組學在工業(yè)微生物領(lǐng)域的應用主要體現(xiàn)在以下幾個方面：快速識別微生物在培養(yǎng)過程中的生理與代謝特征[4]；發(fā)現(xiàn)菌株新的代謝途徑[5]；從系統(tǒng)水平闡述微生物代謝調(diào)控機制[6]；理性指導菌株改造、提高靶標代謝物的產(chǎn)量并指導發(fā)酵過程優(yōu)化[7]等。在工業(yè)微生物領(lǐng)域，代謝物組學的研究工作主要集中于酵母、大腸桿菌和枯草芽胞桿菌等模式微生物[6-9]。近期，也有部分針對鏈霉菌的研究工作[9-10]。由于鏈霉菌可產(chǎn)生豐富的次級代謝產(chǎn)物，而目前根據(jù)基因簇所獲得的化合物信息仍然有限，因此，研究鏈霉菌胞外次級代謝物組，可以發(fā)現(xiàn)新的次級代謝化合物，并促進對次級代謝合成基因簇的認識[10]。此外，代謝物組學也可以用于研究鏈霉菌對環(huán)境壓力的響應機制[11]。這些研究工作表明，對于具有復雜生理代謝的鏈霉菌而言，代謝物組學這一研究手段可以發(fā)揮重要的作用。

代謝物組學研究依賴的技術(shù)平臺主要有核磁共振 (NMR) ，以及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用，包括氣相色譜-質(zhì)譜 (GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜 (LC-MS)和毛細管電泳-質(zhì)譜 (CE-MS)。其中，由于GC-MS具有靈敏度高、分辨率高和可選擇性地分離和檢測大量痕量代謝物和同質(zhì)異構(gòu)體等優(yōu)點，成為微生物代謝物組學研究中應用最廣泛的分析方法[12]。代謝物組學研究方法可分為 3個主要部分：樣品制備、代謝物檢測和數(shù)據(jù)分析 (圖1) 。其中，獲得能夠準確反映細胞瞬時狀態(tài)的代謝物樣品是該方法的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。微生物生長條件和狀態(tài)各異，因此，分離胞內(nèi)外代謝物方法也有所不同。對于研究較多的大腸桿菌 (革蘭氏陰性菌)、枯草芽胞桿菌 (革蘭氏陽性菌) 和酵母菌 (真菌) 而言，已有不少研究者對其代謝物組學樣品制備方法進行了摸索優(yōu)化[13-14]。對于鏈霉菌，目前卻仍無針對性的樣品制備方法優(yōu)化報道。由于獲得能夠準確捕捉代謝物信息的測試樣品對研究鏈霉菌代謝行為及指導抗生素代謝工程具有重要意義，因此有必要對鏈霉菌樣品制備方法進行優(yōu)化。

本工作以天藍色鏈霉菌為研究對象，對其代謝物組樣品制備方法進行了系統(tǒng)優(yōu)化，并利用GC-MS分析平臺分析了該菌株的主要代謝特征。此外，本工作還利用優(yōu)化的樣品制備方法比較了天藍色鏈霉菌 M145在不同生長階段各個代謝途徑的相對強度，找出了這些代謝途徑和次級代謝生物合成的相關(guān)性，可以為其他鏈霉菌的代謝物組分析工作提供參考。

圖1 代謝物組學分析流程Fig. 1 Flowchart for a standard protocol of metabolome analysis.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

本實驗使用的菌株為天藍色鏈霉菌M145。

1.1.2 試劑

衍生化試劑甲氧氨鹽酸鹽、N-甲基-N- (三甲基硅基) 三氟乙酰胺 (MSTFA)，以及內(nèi)標物琥珀酸-2,2,3,3-d4均購自Sigma公司。甲醇、吡啶和正已烷試劑均為色譜級別。其他試劑均為分析純級別。

1.1.3 主要儀器

Agilent GC-MS (Agilent 7896A/5975C GC/MS)、高速冷凍離心機 (Eppendorf 5415R)、超低溫冰箱 (DW-86L626)、真空冷凍干燥機(FD-1A-50)、真空泵 (GM-0.33a)、酶標儀(Synergy H4 Hybrid Reader)、HPLC (Prominence LC-20AT)。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

1.2.1 培養(yǎng)基

孢子培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基 (g/L)：黃豆粉20，甘露醇20，Agar 20，121 ℃滅菌20 min。發(fā)酵培養(yǎng)基為R2YE培養(yǎng)基 (g/L)：蔗糖103，K2SO40.25，MgCl210.12，葡萄糖10，酸水解酪素0.1，酵母提取物 5，微量元素 (ZnCl20.04，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.2，CuCl2·2H2O 0.01，MnCl2·4H2O 0.01，Na2B4O7·10H2O 0.01，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.01) 2 mL，蒸餾水800 mL，滅菌后加入KH2PO41 mL, CaCl2·2H2O 8 mL，L-proline 10 mL，NaOH 0.5 mL，115 ℃滅菌30 min。

1.2.2 培養(yǎng)條件

將凍存于–80 ℃的孢子劃線接種于MS培養(yǎng)基，于28 ℃培養(yǎng)4 d，收集新鮮孢子接種于R2YE培養(yǎng)基中，接種濃度為4×108個孢子/100 mL培養(yǎng)基，28 ℃、250 r/min培養(yǎng)6 d。

1.3 樣品制備方法

取樣后，將 1 mL菌液迅速離心 (4 ℃、13 000×g) 10 min，保留上清，用于測定放線紫紅素的產(chǎn)量，收集的菌體用于測定十一烷基靈菌紅素的產(chǎn)量。其余樣品迅速低溫淬滅后，用于制備胞內(nèi)代謝物樣品。

1.3.1 細胞淬滅

將細胞培養(yǎng)物按1：4的比例迅速加入60%(V/V) 甲醇/水溶液中 (–40 ℃預冷 24 h)，搖勻后于–40 ℃靜置 (按需要分別靜置 2、4、6、8和 10 min)。

1.3.2 菌體分離

采用離心與快速過濾兩種方法分離菌體。1) 離心法：將細胞淬滅物進行冷凍離心，(–9 ℃，2 000×g，3 min)，棄上清并用 0 ℃預冷的去離子水洗滌菌體，重復 3次，最后一次離心條件為–9 ℃，8 000×g，5 min。2) 快速過濾法：利用真空泵對細胞淬滅物進行快速過濾并用0 ℃預冷的去離子水洗滌菌體 (1 min內(nèi)完成所有步驟)。將兩種方法得到的菌體凍存于–80 ℃。

1.3.3 代謝物提取與濃縮

將收集的菌體利用液氮研磨，收集300 mg粉末于2 mL離心管中，加入1 mL 50% (V/V) 甲醇/水溶液 (–40 ℃預冷24 h)，劇烈振蕩后迅速投入液氮中速凍，設(shè)置速凍時間分別為 45 s、3 min和5 min，之后于冰上融化，重復3次。然后將混合物低溫離心 (–9 ℃，13 000×g，5 min)，取800 μL上清至15 mL離心管中。再向2 mL離心管中加入500 μL預冷的50% (V/V)甲醇/水溶液，劇烈振蕩后以相同的條件離心，再將500 μL上清轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，并加入20 μL 0.2 mg/mL D4-琥珀酸作為內(nèi)標。將抽提的代謝物溶液于–80 ℃過夜冷凍后，凍干24 h。

1.3.4 代謝物衍生化

將凍干樣品加入 50 μL甲氧胺鹽吡啶溶液(20 mg/mL)，于水浴中加熱 90 min (37 ℃或40 ℃)；之后加入 80 μL MSTFA 繼續(xù)加熱90 min (37 ℃[15]或 40 ℃[16])，得到 GC-MS 分析樣品。

1.4 GC-MS代謝物檢測方法

色譜條件為：氣相色譜分析儀Agilent 7890A，色譜柱 DB-5MS (30 m×0.25 mm，0.25 μm，Agilent)；柱溫箱升溫程序70 ℃保持2 min，然后以5 /min℃升溫至290 ℃并保持3 min；進樣口及檢測器溫度均保持為250 ℃；GC-MS接口溫度為280 ℃；載氣為He氣，流速1.0 mL/min；樣品進樣量為1 μL，分流比為20：1。質(zhì)譜條件：質(zhì)譜儀 Aglient 5975C MSD System；電子轟擊電離 (EI+源)，EI+源溫度 250 ℃，轟擊能量eV，離子電流40 μA；掃描分子量范圍25–650；掃描速度2 scan/second。

1.5 其他分析方法

1.5.1 采用二苯胺法[17]確定生物量

收集1 mL發(fā)酵液，離心去上清后用SET 緩沖液洗1次，離心去上清；將菌體重懸于2 mL二苯胺試劑中，60 ℃水浴1 h，之后離心取上清測定OD595。每個樣品設(shè)置3個生物學重復。

1.5.2 放線紫紅素產(chǎn)量測定方法

收集1 mL發(fā)酵液，4 ℃、10 000×g離心取上清，加入終濃度1 mol/L的KOH，離心取上清，利用酶標儀測定OD640。根據(jù)該波長下的摩爾吸光系數(shù) (ε640=25 320) 計算 Act產(chǎn)量[18]。每個樣品設(shè)置3個生物學重復。

1.5.3 十一烷基靈菌紅素產(chǎn)量測定

收集1 mL發(fā)酵液，4 ℃、10 000×g離心收集菌體，1 mol/L HCl洗滌菌體2次，1 mL甲醇萃取，離心取上清，利用酶標儀測定OD530，根據(jù)該波長下的摩爾吸光系數(shù) (ε530=100 500) 計算Red產(chǎn)量[19]。每個樣品設(shè)置3個生物學重復。

1.5.4 數(shù)據(jù)處理方法

代謝物數(shù)據(jù)的相對定量是根據(jù)總離子流峰進行的。代謝物組分的獲得方法是將由 Agilent 7890/5975C MSD System采集的原始數(shù)據(jù)導入解卷積軟件AMDIS中分析得到。將解卷積后的數(shù)據(jù)與NIST 8.0庫、Fiehn代謝物數(shù)據(jù)庫進行比對搜索得到相應的代謝物 (檢索匹配度要求高于 80)。進一步結(jié)合 METLIN數(shù)據(jù)庫和 KEGG數(shù)據(jù)庫對代謝物所屬途徑進行分類。將質(zhì)譜峰面積分別對各樣品的生物量和內(nèi)標物的峰面積進行歸一化，獲得胞內(nèi)代謝物的相對濃度。每個樣品設(shè)置 3個生物學重復。分別選擇對數(shù)期和穩(wěn)定期的胞內(nèi)代謝物樣品中檢測到的部分代謝物，以及胞外Act產(chǎn)量為例，利用t-test檢驗樣品間的差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 樣品數(shù)據(jù)的重復性檢測

為了獲得精確的數(shù)據(jù)，實驗初始首先對GC-MS儀器檢測的重復性進行了考察。以內(nèi)標物D4-琥珀酸為例，分別進樣3次，其出峰時間分別為16.160、16.162和16.171 min，這個結(jié)果表明儀器的重復性很好。

為了檢驗不同生物學樣品的重復性，本實驗取24 h和72 h的3個樣品所采集到的數(shù)據(jù)進行了比較。將胞內(nèi)代謝物數(shù)據(jù)進行歸一化后，隨機抽取不同胞代謝物的總離子流質(zhì)譜峰面積，以及胞外代謝產(chǎn)物 Act的濃度。如表 1所示，3個生物學樣品的P-value均大于0.1，表明樣本間的差異不顯著，所取的 3個生物學樣品的重復性良好，可用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

2.2 不同樣品處理條件對代謝物提取的影響

2.2.1 細胞淬滅時間優(yōu)化

細胞淬滅能夠及時終止胞內(nèi)的代謝活動，是獲得能夠準確反映細胞瞬時生理狀態(tài)的代謝物樣品的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究以冷甲醇水為淬滅溶劑，著重研究了淬滅時間對代謝物提取的影響。迅速從同一培養(yǎng)瓶中取5份天藍色鏈霉菌M145的對數(shù)中期培養(yǎng)物 (30 h)，并同時分別與–40 ℃預冷的 60% (V/V) 甲醇水按 1：4體積混合，置于–40 ℃分別靜置 2、4、6、8和10 min，然后提取代謝物后進行GC-MS分析。結(jié)果如圖2所示，淬滅時間為2 min時，提取到的代謝物組分數(shù)為 (272±13)，當淬滅時間延長至4 min時，提取到的代謝物組分數(shù)目最多，達到356個。然而繼續(xù)延長淬滅時間代謝物組分數(shù)則會顯著下降，10 min時僅有 (110±8) 個，較4 min時降低69.1%。此外，如圖2所示，將總離子流 (TIC) 峰面積設(shè)置為105時，淬滅4 min時所獲得的代謝物TIC峰面積大于該值的代謝物數(shù)目分別較其他 4個時間點多 46%(2 min)、29% (6 min)、68% (8 min) 和 89%(10 min)。這些數(shù)據(jù)表明4 min是天藍色鏈霉菌淬滅效果最好的時間段。

2.2.2 細胞分離條件優(yōu)化

快速干凈地分離菌體與淬滅液和胞外代謝物的混合物，能夠減少胞內(nèi)代謝物損失和外界雜質(zhì)干擾。對比低溫離心與快速抽濾兩種方法，結(jié)果顯示針對同一天藍色鏈霉菌M145樣品，快速抽濾可得到 (373±9) 個組分峰，較低溫離心法提取的組分峰數(shù)目 (312±12) 高 19.6%。此外，抽濾法得到的TIC峰面積大于105的代謝物數(shù)目較低溫離心法高65%。

表1 樣品生物學重復檢驗Table 1 Significance test of different biological samples

圖2 不同淬滅時間對代謝物提取的影響Fig. 2 Impact of quenching times on the extration of metabolites. QT: quenching time; CN: number of metabolite components; TIC: total ion chromatogram.

圖3 不同菌體分離方式對代謝物提取的影響Fig. 3 Impact of different cell separation methods on metabolite extraction after quenching. TIC: total ion chromatogram.

2.2.3 代謝物提取條件的優(yōu)化

實驗進一步優(yōu)化了天藍色鏈霉菌代謝物提取條件。為了使代謝物充分釋放，采用液氮研磨的方式對細胞壁進行破壞，利用–40 ℃預冷的50% (V/V) 甲醇水多次抽提及液氮-冰水反復凍融提取代謝物。實驗比較了不同的液氮速凍時間(45 s、3 min和5 min) 對代謝物提取的影響，結(jié)果表明45 s的速凍時間能夠檢測到 (464±17) 種代謝物組分，而延長速凍時間至3 min和5 min則會導致代謝物組分分別較45 s減少24.8%和28.7%。此外，45 s液氮速凍時間獲得的代謝物中，TIC峰面積大于105的數(shù)目較其他兩個時間點分別高27%和59%。這些結(jié)果表明在液氮中速凍45 s而后在冰上融化是反復凍融的較好條件。

2.2.4 代謝物衍生化條件的優(yōu)化

提取獲得胞內(nèi)代謝物后，衍生化過程能夠增加代謝物的穩(wěn)定性并降低其沸點，有利于GC-MS檢測胞內(nèi)代謝物。本工作比較了37 ℃和40 ℃兩個溫度條件下衍生化試劑的衍生效率，結(jié)果顯示，37 ℃處理代謝物分別與甲氧胺鹽和MSTFA反應90 min，仍有13.7%的代謝物僅被部分衍生化。而在40 ℃處理下，試劑的衍生化效率可達到96.7%。

2.3 GC-MS可檢測代謝物在天藍色鏈霉菌代謝網(wǎng)絡中的覆蓋度

圖4 不同液氮速凍時間對代謝提取的影響Fig. 4 Impact of the different freeze-thaw times in liquid nitrogen on metabolite extration. TIC: total ion chromatogram.

表2 GC-MS檢測到的胞內(nèi)代謝物Table 2 Intracellular metabolites identified by GC-MS

續(xù)表2

本工作對利用上述優(yōu)化條件制備的代謝物樣品進行了 GC-MS檢測，結(jié)果如表 2所示。在能夠檢測到的400多個組分峰中，通過與 NIST、METLIN、Fiehn代謝物譜庫以及分析，能夠精確匹配糖酵解、戊糖磷酸途徑、檸檬酸循環(huán)、氨基酸、脂肪酸及脂類、肌醇代謝、核酸代謝、糖苷類代謝、輔因子、甾醇、激素和萜類等代謝途徑中的103個代謝物。

在大腸桿菌、枯草芽胞桿菌和酵母菌的代謝物組學研究中，一般能夠檢測到覆蓋以上代謝途徑的80–100個代謝物即能滿足比較代謝物組學分析的要求[6-20]。因此我們認為利用我們建立的研究方法以及現(xiàn)有的質(zhì)譜平臺，也能夠滿足鏈霉菌代謝物組學相關(guān)研究。

2.4 天藍色鏈霉菌細胞代謝的時序分析

建立了鏈霉菌代謝物組學研究方法后，為了解析鏈霉菌初級代謝和次級代謝的關(guān)聯(lián)，我們對天藍色鏈霉菌不同生長階段部分代謝途徑的相對強度進行了分析。首先，在R2YE液體培養(yǎng)基中測定了天藍色鏈霉菌的生長曲線和次級代謝產(chǎn)物十一烷基靈菌紅素和放線紫紅素的產(chǎn)生曲線 (圖 5)?？梢钥闯?，當菌體生長進入穩(wěn)定期后，次級代謝產(chǎn)物十一烷基靈菌紅素才開始產(chǎn)生 (約48 h)，而放線紫紅素的產(chǎn)生時間更滯后 (約72 h)。于是，根據(jù)前面建立的分析方法，選取對數(shù)前期 (18 h) 、對數(shù)期 (30 h)、穩(wěn)定前期 (48 h) 和穩(wěn)定后期 (72 h) 4個時間點分析該菌株的代謝時序差異。結(jié)果如圖6所示，可以發(fā)現(xiàn)糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑 (PPP)和三羧酸循環(huán) (TCA) 在對數(shù)期有相對較高的代謝強度，而在次級代謝生物合成的穩(wěn)定期(72 h)，這些途徑急劇減弱，可檢測到的代謝物相對濃度僅有對數(shù)期 (30 h) 的 1%–16%；而可檢測到的一些氨基酸相對于糖酵解途徑和 TCA循環(huán)下降趨勢較緩；與以上途徑的相對強度趨勢顯著不同，相對于對數(shù)期和穩(wěn)定后期，一些脂肪酸不僅在穩(wěn)定前期濃度相對較高，而且在穩(wěn)定后期的下降也相對緩慢，72 h代謝物濃度仍可達到30 h的63%–77%。這些結(jié)果表明，在鏈霉菌中部分氨基酸途徑和脂肪酸途徑可能充當了初級代謝和次級代謝轉(zhuǎn)換的橋梁。

圖5 天藍色鏈霉菌M145生長曲線、放線紫紅素和十一烷基靈菌紅素合成曲線Fig. 5 Growth curve (■) , and production curves of undecylprodigiosin (▲), actinhordin (●) of S. coelicolor M145.

圖6 天藍色鏈霉菌M145主要胞內(nèi)代謝物的時序變化特征Fig. 6 Temporal profiles of different metabolites in S. coelicolor M145.

3 討論

鏈霉菌作為抗生素的重要工業(yè)產(chǎn)生菌，其代謝工程改造提高抗生素產(chǎn)量具有重要意義。在工程菌改造過程中，代謝物組學作為一種系統(tǒng)的研究手段，在目的產(chǎn)物相關(guān)代謝物的發(fā)現(xiàn)中具有無與倫比的優(yōu)勢。為了方便代謝物組學在鏈霉菌研究中的應用，本文對天藍色鏈霉菌代謝物組學樣品制備方法進行了一些摸索。由于鏈霉菌與其他細菌生長狀態(tài)不同，會在液體培養(yǎng)基中形成菌絲團。這要求我們在制備準確反映細胞瞬時生理狀態(tài)的代謝物時，不能采取和大腸桿菌、枯草芽胞桿菌等相同的方法，所以本文主要對鏈霉菌代謝物樣品制備步驟進行了系統(tǒng)優(yōu)化。

細胞淬滅能夠及時終止胞內(nèi)的代謝活動，是獲得能夠準確反映細胞瞬時生理狀態(tài)的代謝物樣品的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。已有研究比較了各種淬滅溶劑對不同菌株代謝物提取的影響，并證明冷甲醇水對多種菌株具有較好的淬滅效果[13-21]。目前有關(guān)鏈霉菌代謝物組學的研究也多采用冷甲醇水為細胞淬滅劑[22-23]。由于淬滅劑會對細胞壁產(chǎn)生嚴重的破壞作用，因此嚴格控制淬滅時間防止導致胞內(nèi)代謝物滲漏非常重要。然而目前并無相關(guān)研究考察以冷甲醇水為淬滅溶劑時，淬滅時間對鏈霉菌代謝物提取的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，冷甲醇水的低溫 (–40 ℃) 淬滅時間維持在 4 min時能夠較好地保證及時終止鏈霉菌胞內(nèi)的代謝活動，獲得較多的代謝物。淬滅時間較短不能充分終止反應，而時間較長時，由于細胞壁受損嚴重導致胞內(nèi)代謝物大量滲漏，致使獲得的代謝物數(shù)目顯著降低 (圖 2)。此外，通過比較不同的菌體分離方法，發(fā)現(xiàn)快速抽濾法提取得到的代謝物質(zhì)量優(yōu)于離心分離法，產(chǎn)生這種結(jié)果的原因可能有以下兩點：一，在離心過程中，細胞與淬滅溶劑接觸時間較長，胞內(nèi)代謝物與溶劑充分交換，導致大量滲漏；二，淬滅后的細胞壁非常脆弱，離心和洗滌過程產(chǎn)生的剪切力引發(fā)菌絲斷裂，造成代謝物滲漏。相對而言，快速過濾時間短暫，可以避免胞內(nèi)代謝物向溶劑大量擴散，此外該方法還可以避免剪切力對細胞損傷，減少代謝物滲漏。液氮反復凍融是提取胞內(nèi)代謝物的主要方法[23-24]，然而，對于具有較厚細胞壁的革蘭氏陽性菌及真菌，反復凍融法通常不能充分提取胞內(nèi)代謝物[8]。為了解決這一問題，我們采取了液氮研磨加反復凍融的提取方法。此外，研究還發(fā)現(xiàn)反復凍融的過程中較長的液氮速凍時間反而不利于代謝物的獲得，這一現(xiàn)象的原因仍不確定。最后研究了溫度對代謝物衍生率的影響，發(fā)現(xiàn)40 ℃條件下衍生化效率較37 ℃高。通過對各樣品制備環(huán)節(jié)進行比較優(yōu)化，最終得到最適合天藍色鏈霉菌代謝物分析樣品的制備方法。

通過我們建立的方法成功得到 400多個天藍色鏈霉菌代謝物組分后，利用已有的NIST、MTEALIN和Fiehn代謝物數(shù)據(jù)庫，參考相關(guān)文獻并與KEGG數(shù)據(jù)庫中該菌株的代謝途徑相匹配，確定出 103個能與代謝途徑精確匹配的代謝物。目前并無針對鏈霉菌胞內(nèi)代謝物樣品制備方法的詳細研究，而利用現(xiàn)有的文獻方法制備的代謝物樣品，組分也主要集中于氨基酸及其衍生物和部分脂肪酸及脂類[23-25]，少于本文方法所獲得的組分種類。此外，其他未確定組分主要可分為兩部分，一部分是與譜庫中匹配度較低，只根據(jù)代謝物的精確質(zhì)量數(shù)并不能定性；另一部分是天藍色鏈霉菌的代謝途徑數(shù)據(jù)庫中并未收集該化合物信息。鏈霉菌不同于其他細菌，除了初級代謝，還存在大量的次級代謝基因簇，例如天藍色鏈霉菌有23個次級代謝基因簇，這些基因簇的編碼產(chǎn)物以及中間代謝物上沒有相關(guān)的精確質(zhì)譜信息，因此在鏈霉菌代謝物組學研究中，代謝物的精確匹配、歸屬仍存在較大挑戰(zhàn)。

利用建立的鏈霉菌代謝物組學樣品制備方法，我們對天藍色鏈霉菌各個代謝途徑在不同生長階段的相對強度進行了分析，在代謝物層面上發(fā)現(xiàn)了鏈霉菌初級代謝相關(guān)途徑 (糖酵解途徑、戊糖磷酸途徑和TCA循環(huán)) 和次級代謝的生物合成存在明顯的時間差。而介于此時間差之間的是一些氨基酸和脂類物質(zhì)的代謝物處于較高水平，所以我們推測可能是一些氨基酸和脂類相關(guān)途徑在鏈霉菌生長周期中承擔了銜接初級代謝和次級代謝的角色。

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