錢國軍，陳彩平，翟如英，邵蔚藍，梅艷珍

1南京師范大學生命科學學院，江蘇 南京 210046

2江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212000

在酶的6大類型中，30%–35%為氧化還原酶[1]，由于氧化還原酶在催化制備手性醇、氨基酸、羥基酸方面顯示出極大的優(yōu)勢，因此在制藥、食品、精細化工、農(nóng)藥等領(lǐng)域具有重要的用途，它的應用也越來越受到人們的重視[2-6]。大約80%的氧化還原酶需要尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD，NADH)作為輔酶，然而NAD和NADH的價格昂貴，通常比酶促反應所得產(chǎn)物要貴得多。因此，從技術(shù)經(jīng)濟性的角度來看，對輔酶進行再生并循環(huán)使用很有必要[7-9]。輔酶因子再生手段主要有化學法、酶法、電化學法、光化學法和基因工程法。酶法是被研究和應用最多的再生手段，通過偶聯(lián)的氧化還原反應對輔酶進行再生并循環(huán)使用是一個重要策略[10-16]。

乳酸脫氫酶 (LDH)是以NADH為輔酶，將丙酮酸經(jīng)過生化反應生成乳酸，同時將NADH氧化成NAD[17]。由于乳酸脫氫酶和其反應底物丙酮酸市場價格相對較便宜，性質(zhì)穩(wěn)定，因此很早之前Wong和Whitesides就提出用乳酸脫氫酶進行輔酶NAD的再生[18]。作為輔酶再生的工業(yè)用酶，人們期望所用的酶具有價格低廉、性質(zhì)穩(wěn)定、活性高等特點，極耐熱性酶在制備和應用中易于滿足這些要求。雖然已經(jīng)在許多微生物中發(fā)現(xiàn)有乳酸脫氫酶，并且有些已經(jīng)對它的酶學性質(zhì)進行了研究[19-20]，但是目前已報道的熱穩(wěn)定性乳酸脫氫酶并不多。海棲熱袍菌Thermotoga maritima是一種生長在55–90℃的海底火山口附近、嚴格厭氧的細菌[21]。海棲熱袍菌產(chǎn)生的乳酸脫氫酶具有熱穩(wěn)定性好、活性高等特點，但是海棲熱袍菌生長條件苛刻，且乳酸脫氫酶 (Tm-LDH)的產(chǎn)生量很低[22]，工業(yè)用酶需要通過基因重組表達制備。Tm-LDH基因在T7載體中未能實現(xiàn)高效表達，并且重組酶的酶學性質(zhì)也未曾報道過[23]。因此，研究Tm-LDH基因高效表達的基因工程技術(shù)及其重組酶酶學性質(zhì)對于極耐熱性LDH的開發(fā)利用具有重要意義。本研究采用受σ32調(diào)控的pHsh熱激表達載體[24]，對海棲熱袍菌的乳酸脫氫酶進行高效表達，并對其酶學性質(zhì)進行了研究，為輔酶再生系統(tǒng)的建立和乳酸的酶法生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

海棲熱袍桿菌Thermotoga maritima MSB8購自美國菌種保存中心，編號為ATCC43589；大腸桿菌Escherichia coli JM109購于Promega(Wisconsin，USA)；質(zhì)粒pHsh由仙奕生物科技 (南京)南京有限公司 (Shine E Biotech,Nanjing,China) 提供[24]。

1.1.2 主要試劑

限制酶T4 DNA連接酶和DNA聚合酶購自寶生物工程公司；質(zhì)粒抽提試劑盒，割膠回收試劑盒購自Qiagen公司；丙酮酸鈉，NADH均購自南京丁貝生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

E.coli培養(yǎng)在LB培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)化子的選擇用含有氨芐青霉素 (10 μg/mL)的LB培養(yǎng)基，重組酶最高產(chǎn)量測定用含有氨芐青霉素(10 μg/mL)的TB培養(yǎng)基，配方見文獻[25]。電轉(zhuǎn)化用SOC培養(yǎng)基。T.maritima培養(yǎng)基的制備及T.maritima的接種與培養(yǎng)參考文獻[26]。

1.2.2 基因操作

T.maritima基因組DNA提取，DNA的內(nèi)切酶水解和連接，DNA片段的分離，感受態(tài)細胞的制備以及基因的高效電轉(zhuǎn)化均參考文獻[25]。質(zhì)粒的制備，從瓊脂糖凝膠回收DNA等操作按照Qiagen試劑盒使用指南進行。

1.2.3 乳酸脫氫酶表達載體的構(gòu)建

根據(jù)已經(jīng)報道的T.maritima的乳酸脫氫酶基因序列 (TM1867,Accession No.897800)，以及pHsh中的限制性酶切位點設(shè)計并合成一對引物 1和引物 2，引物 1： 5′-catgccatggctaaaata ggtatcgtaggactcg-3′，其中含有NcoⅠ酶切位點和起始密碼子；引物 2：5′-ccgctcgagttaaccgc tggtgttctgg-3′(含XhoⅠ酶切位點)。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。用此引物，以T.maritima菌的基因組DNA為模板，PCR擴增參數(shù)為：95℃ 5 min；98℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 1 min，循環(huán)35次；72℃保溫10 min。PCR擴增結(jié)束后，電泳檢測并將PCR目標條帶割膠回收；用NcoⅠ和XhoⅠ酶切，濃縮，以適當比例與NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切的載體pHsh大片段混合并連接，電轉(zhuǎn)化E.coli JM109，篩選含LDH基因片段的表達質(zhì)粒pHsh-ldh。

1.2.4 LDH基因的表達和重組酶的分離純化

基因轉(zhuǎn)化和誘導表達方法：將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli JM109，挑取單菌落接入含有氨芐青霉素 (Amp)抗性的LB培養(yǎng)液中。30℃培養(yǎng)至OD600為0.6–0.8，后轉(zhuǎn)入42℃水浴搖床，200 r/min熱激誘導8 h，離心，收集菌體細胞。

重組酶的純化：將離心收集的細胞用50 mmol/L的咪唑鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液 (pH 7.0)重懸，經(jīng)高壓細胞破碎儀破碎細胞，13 000×g離心15 min，取上清于80℃熱處理1 h后，13 000×g離心15 min，離心上清液過陰離子柱(離子交換層析)，經(jīng)NaCl離子梯度洗脫，完成粗酶純化，使重組酶達到電泳均一。

1.2.5 酶活性測定

乳酸脫氫酶活性測定采用分光光度法，以丙酮酸鈉和NADH為底物，測定反應體系中NADH的下降量[22]。反應體系為200 μL，內(nèi)含1 mmol/L的丙酮酸鈉，1 mmol/L的NADH，7.3 μg酶，50 mmol/L的咪唑鄰苯二甲酸氫鉀(pH 7.0)?？瞻讓φ罩胁患用?，補加等體積的緩沖液，85℃反應5 min后，冰浴中迅速終止反應，用分光光度計在340 nm處測定其吸收值，計算相對于空白對照的下降值[22]。

乳酸脫氫酶酶活單位定義：每分鐘氧化NADH 1 μmol所需要的酶量定義為一個活性單位[22]。用NADH作標準曲線。蛋白質(zhì)濃度用Brandford法測定。

1.2.6 重組酶的性質(zhì)分析

重組酶的性質(zhì)分析均使用熱處理后，并且進一步用DEAE-Sepharose FF處理之后的純酶。

最適反應溫度的測定：在60–100℃范圍內(nèi)，每隔5℃分別測定酶活 (pH 7.0)。以最高酶活為100%，計算相對酶活。

最適反應pH：在pH 4.5–8.0范圍內(nèi)每隔0.5個pH單位測定酶活，緩沖液是50 mmol/L咪唑鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液。最高活性被設(shè)定為100%，用以計算相對活性的變化。

溫度穩(wěn)定性：在酶活性相對穩(wěn)定的pH 7.0下，緩沖液為咪唑鄰苯二甲酸氫鉀，使酶在某個溫度下保溫不同的時間，再測定相對酶活，以70℃保存的酶樣活性為100%，計算百分比，確定酶的溫度穩(wěn)定性。

pH穩(wěn)定性：酶在pH 5.0–8.0條件下，緩沖液為咪唑鄰苯二甲酸氫鉀，在酶活性相對穩(wěn)定的溫度70℃下保溫1 h后，再分別測定殘留酶活性，與不保溫酶的酶活相比，計算百分比，確定酶的pH穩(wěn)定性。

酶的動力學參數(shù)的測定：以20 mmol/L的丙酮酸鈉為母液，分別以1–20 μL不等的量加入含有2 mmol/L的NADH的終體積為200 μL酶活反應體系中，在最適反應條件下，測定酶活力。采用Eadie-Hofstee作圖法，計算動力學參數(shù)。

以100 mmol/L的NADH為母液，分別以1–20 μL不等的量加入含有2 mmol/L的丙酮酸鈉的終體積為200 μL酶活反應體系中，在最適反應條件下，測定酶活力。采用Eadie-Hofstee作圖法，計算動力學參數(shù)。

金屬離子及有機抑制劑對酶活性影響的測定：以7.3 μg酶、1 mmol/L金屬離子或者有機抑制劑、1 mmol/L NADH、1 mmol/L的丙酮酸鈉和50 mmol/L咪唑鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液為200 μL反應體系，在最適反應條件下測定酶活力，以標準反應體系中的酶活力作為100%，計算百分比，確定金屬離子及有機試劑對酶活性的影響。測試的金屬離子分別為 Mg2+、Li+、Sr2+、Ca2+、Zn2+、Co2+、Mn2+、Ni2+和Cu2+，選取的有機抑制劑為SDS、Triton-X100和EDTA。

2 結(jié)果

2.1 原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建

以T.maritima菌的基因組DNA為模板進行乳酸脫氫酶基因片段的PCR擴增,電泳檢測結(jié)果表明,在0.96 kb附近有一條很亮的擴增帶，與報道的乳酸脫氫酶基因序列大小一致，沒有明顯的非特異性條帶，說明所選PCR擴增條件能有效擴增基因片段。將PCR產(chǎn)物克隆至熱激載體pHsh中，構(gòu)建出重組質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶對重組質(zhì)粒進行鑒定，重組質(zhì)粒能被NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切得到兩條分別為0.96 kb和2.3 kb的條帶 (圖1)。因此，初步證明目標基因已插入熱激載體中。

2.2 乳酸脫氫酶基因在E.coli中的表達及純化

用重組質(zhì)粒pHsh-ldh和質(zhì)粒pHsh分別轉(zhuǎn)化E.coli JM109，30℃培養(yǎng)，后轉(zhuǎn)入42℃熱激誘導8 h，收集菌體細胞進行SDS-PAGE(分離膠的濃度為12%)，考馬斯亮藍染色的結(jié)果見圖2。從電泳圖譜上可以看出，含有重組質(zhì)粒的E.coli在分子量33 kDa處有明顯的蛋白表達帶，酶活達到28 112 U/mL，由此可知乳酸脫氫酶基因通過熱激質(zhì)粒pHsh在E.coli中實現(xiàn)了超量表達。

圖1 重組質(zhì)粒pHsh-ldh酶切及PCR擴增片段鑒定Fig.1 PCR amplification of ldh and restriction analysis of recombinant plasmid.M:DNA marker;1:PCR amplification of gene;2:fragments of 2.4 kb and 0.96 kb produced after a double-enzyme digestion of pHsh-ldh;3:a 3.4 kb fragment produced after a single enzyme digestion of pHsh-ldh.

將熱激誘導的菌體細胞通過高壓破碎裂解，80℃熱處理1 h，取上清液SDS-PAGE檢測，結(jié)果表明重組酶經(jīng)熱處理后，酶純度大幅度提高，基本除去大部分的雜蛋白，純化結(jié)果見表1。由表1可知，經(jīng)過熱處理后，重組酶的蛋白量為34.1 mg/mL，比酶活也提高到2 674 U/mg，酶活達到91 183 U/mL。

2.3 重組酶的酶學性質(zhì)

酶學性質(zhì)的研究結(jié)果表明該酶的最適反應溫度為95℃，90℃半衰期為2 h，95℃保溫2 h后能保持約30%的活力。有趣的是該酶適應較寬廣的反應溫度，在65℃的反應條件下，該酶的活性達到50%(圖3)，然而在這種常規(guī)溫度下酶的活性能夠長時間保持穩(wěn)定 (圖4)。

該酶的最適pH為7.0，從5.0–7.0酶活快速升高 (圖5)，但是在pH 5.5–8.0之間酶的活力穩(wěn)定在60%以上 (圖6)。

圖2 乳酸脫氫酶純化過程的SDS-PAGE圖譜Fig.2 SDS-PAGE analysis of Tm-LDH in purification steps.M:protein marker;1:cell-free extract of E.coli JM109/pHsh;2:cell-free extract of E.coli JM109/pHsh-ldh;3:proteins remained after a heat treatment of 1 h;4:the purified recombinant LDH protein.

表1 E.coli中重組乳酸脫氫酶的純化Table 1 Purification of the recombinant lactate dehydrogenase from E.coli

圖3 Tm-LDH的最適反應溫度Fig.3 Optimum temperature for lactate dehydrogenase activity.

圖4 Tm-LDH的溫度穩(wěn)定性Fig.4 Thermal stability of lactate dehydrogenase.The purified enzyme was pre-incubated for various time at 65 ℃ (◆),85 ℃ (■),90 ℃ (▲)and 95 ℃ (×).

圖5 Tm-LDH的最適反應pHFig.5 Optimum pH for lactate dehydrogenase activity.

由表 2可知 Mg2+、Li+、Sr2+、Ca2+、Cu2+對酶的活性沒有顯著影響；SDS、Zn2+對酶活均有顯著的抑制作用。Co2+、Mn2+、Ni2+、Triton-X100和EDTA對酶活有顯著的促進作用。以丙酮酸鈉和NADH為底物時，在85℃、pH 7.0條件下，其丙酮酸鈉的動力學參數(shù)Km值為 1.7 mmol/L，Vmax值為 3.8×104U/mg；其NADH的動力學參數(shù)Km值為7.2 mmol/L，Vmax為 1.1×105U/mg。

表2 金屬離子及抑制劑對Lactate Dehydrogenase活性的影響Table 2 Effect of metal ions and inhibitors on the activity of Lactate Dehydrogenase

3 討論

海棲熱袍菌T.maritima是一個嗜極端高溫的厭氧真細菌，生長在55℃–90℃海底火山口處，是極端耐熱性酶的重要來源。但是海棲熱袍菌生長條件苛刻，細胞密度較低，不適合工業(yè)化生產(chǎn)?；蛑亟M技術(shù)是獲得重組酶高效生產(chǎn)的有效途徑，但是絕大多數(shù)來源于極端高溫菌的自然基因在E.coli中的表達水平很低。因此，構(gòu)建合適的極端菌的外源基因表達系統(tǒng)，高效率地表達一些極端酶，一直是人們研究的熱點。本研究利用pHsh表達載體實現(xiàn)了Tm-LDH的一步超量表達，克服了傳統(tǒng)的海棲熱袍菌中乳酸脫氫酶基因工程菌構(gòu)建困難、乳酸脫氫酶表達量較低等難題。實現(xiàn)超量表達不僅便于獲得大量純酶從而進行酶學性質(zhì)和應用技術(shù)的研究，而且為該酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。pHsh表達載體的另一個特點是可以有效地進行熱激誘導表達，不需要加入IPTG等比較昂貴的化學誘導劑。

酶學性質(zhì)研究表明Tm-LDH具有很強的穩(wěn)定性，90℃酶活半衰期2 h。有趣的是該酶雖然最適反應條件為95℃、pH 7.0，但是它在較寬廣的溫度和pH范圍內(nèi)活性都很高。該酶在低至65℃的反應條件下活性達到最高活性的50%(相當于 1 600 U/mg蛋白)，然而在這種常規(guī)溫度下酶的活性能夠長時間保持穩(wěn)定。脫氫酶的這種性質(zhì)對于酶的應用前景尤為重要。在涉及輔酶的氧化還原反應的生物化工過程中，生產(chǎn)的經(jīng)濟效益和可持續(xù)性都要求氧化型或還原型的輔酶能夠得到再生。例如，如果氧化性輔酶NAD依賴性的2,3-丁二醇脫氫酶與NADH依賴性乳酸脫氫酶聯(lián)用，就可以建立輔酶再生體系，實現(xiàn)手性乙偶姻和乳酸的持續(xù)生產(chǎn)。因此，Tm-LDH適應較寬廣的溫度和pH范圍，有利于它在反應條件方面與不同來源的NAD依賴性脫氫酶的配伍，構(gòu)建成高效、穩(wěn)定性的輔酶循環(huán)體系。

研究表明，利用海棲熱袍菌乳酸脫氫酶的極耐熱性，將重組菌細胞破碎后的上清經(jīng)過80℃的熱處理后，無需經(jīng)過任何色譜層析系統(tǒng)就可獲得較高純度的重組酶，這大大地簡化了重組酶的純化步驟，同時也極大地降低了該酶的下游處理成本，為重組酶的大規(guī)模工業(yè)化提取奠定了基礎(chǔ)。并且發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過熱處理之后的重組酶總酶活大幅度提高，這種實驗現(xiàn)象重復性極高，我們推測可能的原因是由于經(jīng)過熱處理后，某些對酶活有副作用的因子被去除了；或者是由于該酶來源于嗜熱菌而重組表達是在常溫下，熱處理可以通過改變該酶的構(gòu)象而更好地激活該酶。類似Tm-LDH熱處理之后總酶活大幅度提高的實驗現(xiàn)象，在其他極耐熱性重組酶性質(zhì)分析中也有相關(guān)報道，但均未給出合理解釋。對這些現(xiàn)象的研究將有助于我們更進一步了解耐熱酶的分子機制，將有利于微生物極端酶的開發(fā)和利用，更進一步的研究還在進行中。

本研究著重對該重組酶進行了高效表達，并且對該重組酶的酶學性質(zhì)進行了分析和測定，并對該酶在NAD再生的工業(yè)化應用前景進行了探討和展望；但對該酶在NAD再生體系中具體應用還處于探索階段。我們相信，對該酶在NAD再生體系中的更進一步研究，將有利于NAD再生體系的完善及在工業(yè)化條件下的推廣與應用。

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