，2，3**

（1河北農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，河北省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程技術研究中心，國家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術研究中心，河北保定 071001；2河北北方學院，河北張家口 075000；3河北省邢臺市農(nóng)業(yè)局，河北邢臺 054001）

玫瑰黃鏈霉菌對根結線蟲的防效及對土壤微生物區(qū)系的影響

喬丹娜1張艷杰1李華義1沈鳳英1，2李珍珍1，3劉大群1*李亞寧1*

（1河北農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，河北省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程技術研究中心，國家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術研究中心，河北保定 071001；2河北北方學院，河北張家口 075000；3河北省邢臺市農(nóng)業(yè)局，河北邢臺 054001）

利用玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63菌株的固、液體發(fā)酵物防治設施番茄和黃瓜根結線蟲，研究其對根結線蟲的防效以及施用生防菌對土壤微生物區(qū)系的影響。結果表明：Men-myco-93-63菌株固體發(fā)酵物1 V∶200 V對黃瓜和番茄根結線蟲病的防效分別達到了65.62%和57.69%；施用生防菌使得植株根際土壤中細菌數(shù)量增加了19.57%，放線菌數(shù)量增加了316.67%，真菌數(shù)量降低了28.57%，以上3種可培養(yǎng)微生物總量由7.4×106cfu·g-1增加到16.75×106cfu·g-1，增加了126.35%。

玫瑰黃鏈霉菌；Men-myco-93-63菌株；根結線蟲；防效；土壤微生物

根結線蟲近年來在設施蔬菜生產(chǎn)中普遍發(fā)生，尤其是設施番茄和設施黃瓜，于植株根部產(chǎn)生根結，嚴重影響植株生長并導致產(chǎn)量損失，甚至絕產(chǎn)。另外，根結線蟲的侵入，同時也改變了土壤微生物區(qū)系的結構，一般會使土壤中細菌和放線菌數(shù)量降低，真菌數(shù)量升高（許華 等，2010）。蔬菜上以南方根結線蟲（Meloidogyne incognita）、北方根結線蟲（M. hapla）、花生根結線蟲（M. arenaria）和爪哇根結線蟲（M. javanica）為主，其中最主要的是南方根結線蟲（李洪濤 等，2006）。目前生產(chǎn)上多使用噻唑膦等化學藥劑進行防治，雖然能有效降低病情，但也產(chǎn)生了破壞土壤生態(tài)環(huán)境、藥效殘留等問題。因此，生物防治已經(jīng)越來越受到人們的重視。成飛雪等（2012）在田間施用對線蟲有毒殺作用的光合細菌PSB-1菌株和芽孢桿菌YC-10菌株，降低了黃瓜根際根結線蟲J2蟲口密度，減少根結的形成，促進了植株生長。溫丹等（2011）通過盆栽試驗研究了松杉樹皮、玉米秸稈堆肥對番茄根結線蟲發(fā)病情況及土壤微生物的影響，發(fā)現(xiàn)松杉樹皮、玉米秸稈堆肥對番茄根結線蟲病具有一定的防治效果，同時增加了番茄的生物量及土壤微生物數(shù)量。

玫瑰黃鏈霉菌（Streptomyces roseoflavus）Men-myco-93-63菌株是從馬鈴薯瘡痂病自然衰退土壤中分離到的對多種病原菌具有抑制作用的拮抗菌。在室內(nèi)及田間試驗中，該菌株及其發(fā)酵液對棉花黃萎病菌（Verticillium dahliae）（劉大群 等，1999）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）（魏艷敏等，2000）、馬鈴薯瘡痂病菌（Streptomyces scabies）（Liu et al.，2000）、黃瓜白粉病菌（Sphaerotheca fuliginea）（郭敬華，2007）等多種重要植物病原菌表現(xiàn)出強烈的抑制作用。魏學軍（2004）證實該菌株發(fā)酵液對蔬菜根結線蟲具有抑制作用；武志樸（2005）研究表明該菌株發(fā)酵液能很好的防治甘薯莖線蟲。

本試驗利用Men-myco-93-63菌株的固、液體發(fā)酵物防治設施番茄和黃瓜根結線蟲，研究生防菌的施用對根際土壤微生物區(qū)系的影響，尋找其中的變化規(guī)律，探討利用玫瑰黃鏈霉菌生防菌防治根結線蟲的作用機理。

1 材料與方法

1.1 材料

供試Men-myco-93-63菌株由河北農(nóng)業(yè)大學生物防治實驗室保存。供試黃瓜品種為津優(yōu)1號，番茄品種為金鵬10號。

1.2 Men-myco-93-63菌株固、液體發(fā)酵物的制備

參照張艷杰等（2013）的方法制備Men-myco-93-63菌株的固、液發(fā)酵物，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 田間試驗設計

田間藥效試驗于2013年3～12月在河北省定州市西南合村根結線蟲發(fā)生嚴重的同一個蔬菜大棚的兩茬作物上進行，第一茬種植黃瓜，第二茬種植番茄，兩茬作物處理方法相同且各處理地塊位置不變，均采用完全隨機區(qū)組設計。黃瓜于3月19日定植，番茄于8月17日定植。定植前半個月施用農(nóng)家肥作底肥，定植前起壟。各處理如下。

處理Ⅰ：清水灌根；處理Ⅱ：Menmyco-93-63菌株發(fā)酵液5倍稀釋液灌根；處理Ⅲ：Men-myco-93-63菌株發(fā)酵液10倍稀釋液灌根；處理Ⅳ：Men-myco-93-63菌株發(fā)酵液20倍稀釋液灌根；處理Ⅴ：Men-myco-93-63菌株固體發(fā)酵物∶病土=1 V∶200 V；處理Ⅵ：Men-myco-93-63菌株固體發(fā)酵物∶病土=1 V∶400 V；處理Ⅶ：10%噻唑膦農(nóng)藥處理。

其中，處理Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ每隔15 d施用1次，共3次，每次施用量為100 mL·株-1；處理Ⅴ、Ⅵ于定植前撒施并旋耕，共施用1次；處理Ⅶ于定植前撒施并旋耕，共施用1次，施用量為1.5 kg·（667 m2）-1。

1.4 田間調(diào)查項目

前茬黃瓜于3月19日定植，7月6日清棚，定植施藥前取1次土樣；定植后土樣采集時間分別為4月8日、4月25日、5月16日、6月13日和7月6日。7月6日清棚后，高溫悶棚1個多月。后茬番茄于8月17日定植，定植施藥前取土樣1次；定植后土樣采集時間分別為8月30日、9月13日、9月24日、10月10日和11月28日。采用5點取樣法，對各處理植株根際0～25 cm深的土樣進行采集，裝入無菌密封袋，室內(nèi)檢測根結線蟲和可培養(yǎng)細菌、真菌及放線菌的數(shù)量。

施藥后3個月分別調(diào)查黃瓜和番茄的株高、莖粗、第1節(jié)間長，以及番茄產(chǎn)量等指標。

在作物收獲期末，調(diào)查根結線蟲病害等級。根據(jù)根結的多少，病情分級標準為：0級，無根結；1級，根結占根系的25%以下；2級，根結占根系的26%～50%；3級，根結占根系的51%～75%；4級，根結占根系的75%以上。

1.5 土壤中根結線蟲的分離

在預備試驗中，隨機挑取利用過篩法從土壤樣本中分離的具有口針的線蟲，經(jīng)鑒定為根結線蟲，因此土壤中根結線蟲的計數(shù)是觀察具有口針的線蟲。

植株根際土壤樣品中的根結線蟲，采用過篩法進行分離（劉維志，2004）：稱取土樣100 g，放入5 L的量杯中，加水充分攪拌，靜止3 min后倒入上層為180目下層為500目的套篩，沖洗量杯的水仍通過套篩過濾，充分過濾后，收集500目篩上的線蟲，定容至150 mL，顯微鏡下計數(shù)具有口針的線蟲數(shù)量，即為根結線蟲的數(shù)量。

1.6 土壤微生物檢測

取250 mL三角瓶，加入90 mL蒸餾水及玻璃珠，滅菌后冷卻，加入土樣10 g，即得到土壤的10倍稀釋液，28 ℃、160 r·min-1、恒溫培養(yǎng)24 h，用無菌水分別配置稀釋度為1×10-2、1×10-3、1×10-4的土壤懸浮液。吸取20 μL稀釋度為1×10-3或1×10-4的土壤懸浮液涂平板，檢測可培養(yǎng)微生物的數(shù)量。

采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基檢測細菌數(shù)量，涂平板1 d后計數(shù)細菌菌落數(shù)；采用馬丁-孟加拉紅培養(yǎng)基篩選真菌，涂平板5 d后計數(shù)真菌菌落數(shù)；采用高氏1號合成培養(yǎng)基（臨用時，每300 mL培養(yǎng)基加1 mL 3%重鉻酸鉀）篩選放線菌（趙斌和何紹江，2002），涂平板5 d后計數(shù)放線菌菌落數(shù)。

2 結果與分析

2.1 Men-myco-93-63菌株發(fā)酵物對黃瓜生長的影響及對根結線蟲的防效

Men-myco-93-63菌株發(fā)酵物各處理的黃瓜株高和莖粗都較農(nóng)藥處理和清水對照高，其中，發(fā)酵液5倍稀釋液處理與對照差異顯著。而除固體發(fā)酵物1 V∶200 V處理之處，Men-myco-93-63菌株發(fā)酵物各處理的第一節(jié)間長與對照處理無明顯差異，但比農(nóng)藥處理高，且差異顯著，說明Menmyco-93-63菌株發(fā)酵物對黃瓜具有一定促生作用（表1）。在黃瓜生長末期，對照根部出現(xiàn)明顯的根結，且成串生長（圖1），發(fā)病程度0～4級不等，且3、4級居多，病情指數(shù)達72.72。施用10%噻唑膦農(nóng)藥具有明顯的防治效果，根結很少，病情指數(shù)為6.67，防效達90.82%。Men-myco-93-63菌株發(fā)酵物各處理的病情指數(shù)顯著低于對照，說明玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63對根結線蟲具有明顯的防治作用，但由于環(huán)境等因素對生防菌的影響，其藥效低于農(nóng)藥處理，其中固體發(fā)酵物1 V∶200 V的防效最好，達65.62%，根結發(fā)生較輕（圖1）。發(fā)酵液5倍稀釋液、10倍稀釋液、固體發(fā)酵物1 V∶400 V的防效也都在40%以上，而發(fā)酵液20倍稀釋液的相對防效只有26.66%（表1），說明玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63菌株固體發(fā)酵物具有較好的防效，可以進行田間應用。

表1 玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63菌株發(fā)酵物對黃瓜生長的影響及對根結線蟲的防效

圖1 玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63菌株發(fā)酵物1 V∶200 V對黃瓜根結線蟲病的防效

2.2 Men-myco-93-63菌株發(fā)酵物對番茄生長的影響及對根結線蟲的防效

從表2可以看出，Men-myco-93-63菌株發(fā)酵物和農(nóng)藥處理的番茄株高和莖粗均顯著高于對照，第1節(jié)間長顯著低于對照；Men-myco-93-63菌株發(fā)酵物處理的番茄產(chǎn)量都較高，其中以固體發(fā)酵物1 V∶200 V處理的番茄產(chǎn)量最高，為6 151.22 kg·（667 m2）-1，顯著高于對照〔3 705.56 kg·（667 m2）-1〕，說明玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63菌株發(fā)酵物對番茄具有明顯的促生增產(chǎn)效果。

表2 玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63菌株發(fā)酵物對番茄生長及根結線蟲病的防效

番茄生長中后期，可以觀察到對照地塊出現(xiàn)明顯的衰老死亡，而Men-myco-93-63菌株發(fā)酵物處理的各地塊番茄生長仍較好，如圖2固體發(fā)酵物1 V∶200 V處理。番茄生長季末，對照許多植株都有根結，發(fā)病程度0～4級不等，以1、2級居多，病情指數(shù)為26；施用10%噻唑膦具有明顯的防治效果，根結很少，病情指數(shù)為4，防效達84.62%；玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63發(fā)酵物各處理的植株病情指數(shù)均顯著低于對照，對根結線蟲具有顯著的防治作用，以高濃度的防效最好，發(fā)酵液5倍稀釋液處理的防效可達到61.54%，固體發(fā)酵物1 V∶200 V處理的防效也達到57.69%，發(fā)酵液10倍稀釋液、固體發(fā)酵物1 V∶400 V的防效都在50%以上，而發(fā)酵液20倍稀釋液的相對防效只有19.23%（表2）；本試驗中發(fā)酵液施用3次，但是固體發(fā)酵物只在植株定植時施用1次，而固體發(fā)酵物1 V∶200V的防效與發(fā)酵液5倍稀釋液相近，因此，固體發(fā)酵物更具有推廣應用潛力。

圖2 玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63菌株發(fā)酵物1 V∶200 V對番茄根結線蟲病的防效

2.3 Men-myco-93-63菌株發(fā)酵物對根際土壤微生物區(qū)系和根結線蟲密度的影響

2.3.1 對根際土壤中細菌數(shù)量的影響 第1茬黃瓜定植前取土樣進行微生物含量檢測，根際土壤中的細菌數(shù)量為2.30×106cfu·g-1左右。在黃瓜生長季，施用Men-myco-93-63菌株固體發(fā)酵物1 V∶200 V處理的細菌數(shù)量變化趨勢與10%噻唑膦處理和清水對照相似，細菌數(shù)量均維持在較高水平；但是在番茄生長季，10%噻唑膦處理和對照中的細菌數(shù)量均明顯下降，而施用固體發(fā)酵物1 V∶200 V處理的細菌數(shù)量仍維持在相對較高的水平，且在黃瓜和番茄定植后15 d左右細菌數(shù)量都有較大程度的提高。7個月后，Men-myco-93-63菌株固體發(fā)酵物1 V∶200 V處理的根際土壤中細菌數(shù)量最高，達2.75×106cfu·g-1，比黃瓜定植前增加了19.57%，而10%噻唑膦處理中細菌數(shù)量為1.00×106cfu·g-1，清水對照則為0.75×106cfu·g-1（圖3）。

圖3 玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63菌株固體發(fā)酵物1 V∶200 V處理后土壤中細菌數(shù)量的動態(tài)變化

2.3.2 對根際土壤中真菌數(shù)量的影響 第1茬黃瓜定植前檢測土壤中真菌數(shù)量為2.10×106cfu·g-1左右。在黃瓜生長季，根際土壤中真菌數(shù)量呈先降低再升高的趨勢，7月6日黃瓜清棚時，Menmyco-93-63菌株固體發(fā)酵物1 V∶200 V處理的真菌數(shù)量為1.00×106cfu·g-1，比定植前略有下降，而10%噻唑膦處理和對照處理的真菌數(shù)量都較高，分別達到3.60×106cfu·g-1和3.20×106cfu·g-1；在番茄生長季，Men-myco-93-63菌株固體發(fā)酵物1 V∶200 V處理的真菌數(shù)量呈先升高后下降的趨勢，11月末其數(shù)量為1.50×106cfu·g-1，比黃瓜定植前下降了28.57%（圖4）。

子曰：“溫故而知新，可以為師矣”說明復習不僅可以幫我們鞏固之前所學的內(nèi)容，更是可以幫助我們在原有知識的基礎上，理解出更多新的知識點。舉一反三就是這樣的效果。連孔子都主張：“學而時習之”，我們學習過來的知識如果不加以利用，不加以溫習，那也就達不到真正的學習目的。復習常常伴隨著練習同時進行。化學學習以多記，多練，多學，多問為主要手段，況且復習加聯(lián)系也是應用所學知識在書面上一種檢測方式。通過練習，能夠發(fā)現(xiàn)自己所學知識的薄弱之處，并且根據(jù)課堂上面的答案講解，加深對某一知識點的鞏固，這也是提高我們化學成績的一種有效手段。

圖4 玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63菌株固體發(fā)酵物1 V∶200 V處理后土壤中真菌數(shù)量的動態(tài)變化

2.3.3 對根際土壤中放線菌數(shù)量的影響 第1茬黃瓜定植前檢測根際土壤中放線菌數(shù)量約為0.30×107cfu·g-1，Men-myco-93-63菌株發(fā)酵物和農(nóng)藥處理的放線菌數(shù)量均呈先下降后上升的趨勢，7月6日黃瓜清棚時均比定植前土壤中放線菌數(shù)量低，但在整個黃瓜生長季，Men-myco-93-63菌株固體發(fā)酵物1 V∶200 V處理的放線菌數(shù)量除4月25日比清水對照略低外，其他均比農(nóng)藥處理和對照的高。在番茄生長季，放線菌數(shù)量主要呈上升趨勢，Men-myco-93-63菌株固體發(fā)酵物1 V∶200 V處理的放線菌數(shù)量仍較農(nóng)藥和對照的高，到11月末，放線菌數(shù)量由0.30×107cfu·g-1增加到1.25×107cfu·g-1，增加316.67%（圖5）。

圖5 玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63菌株固體發(fā)酵物1 V∶200 V處理后土壤中放線菌數(shù)量的動態(tài)變化

2.3.4 對根際土壤中根結線蟲密度的影響 第1茬黃瓜定植前，檢測根際土壤中根結線蟲的密度為64 條·g-1。10%噻唑膦和Men-myco-93-63菌株固體發(fā)酵物1 V∶200 V處理的土壤根結線蟲數(shù)量整體呈下降的趨勢。觀察期間，對照根結線蟲數(shù)量呈先增加后下降再增加的趨勢，且在各時期根結線蟲數(shù)量都高于生防菌和10%噻唑膦農(nóng)藥處理，其中4月25日，根結線蟲數(shù)量達到最高，為85.50條·g-1，分析此時為侵染高峰期；各處理中，10%噻唑膦農(nóng)藥的防治效果最好，在各時期線蟲的數(shù)量都最少，最后根結線蟲數(shù)量下降為17.25條·g-1，其次為Men-myco-93-63菌株固體發(fā)酵物1 V∶200 V處理，8月17日番茄定植前根結線蟲密度下降到10.75條·g-1，之后番茄生長季雖有增加，但不明顯，11月末根結線蟲密度為26.25條·g-1，而對照的根結線蟲的密度為49.50條·g-1（圖6）。

圖6 玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63菌株固體發(fā)酵物1 V∶200 V處理后土壤中線蟲密度的動態(tài)變化

3 結論與討論

利用生物防治的方法控制根結線蟲，目前雖仍面臨防效不穩(wěn)定、不便貯運和持效期短等問題，但仍然是設施生產(chǎn)實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展的必然之路。本試驗結果表明，玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63菌株發(fā)酵物對設施蔬菜根結線蟲病具有較好的防治效果，其固體發(fā)酵物1 V∶200 V對黃瓜和番茄根結線蟲的防效分別為65.62%和57.69%，且只需要在定植時施用1次，高濃度菌株發(fā)酵液雖然也具有較高的防效，但是與固體發(fā)酵物的防效差異不明顯，且需要多次施用，因此固體發(fā)酵物更適合在生產(chǎn)上推廣和應用。

土壤微生物區(qū)系是引起生防菌室內(nèi)防效與田間防效顯著差異的重要因素之一，土壤微生物種類繁雜，主要是細菌、真菌、放線菌，其中尤以細菌的種類和數(shù)量最多（Kennedy，1999），病原物的入侵會破壞原土壤的微生物結構，生防微生物的施用則可以改善土壤微生物結構（Paulitz ＆Linderman，1989；Marshner ＆ Crowley，1996；Marschner，et al.，2001），使其有利于植物生長，但不同生防菌對土壤微生物區(qū)系的影響不同。張婷等（2013）將枯草芽孢桿菌（B. subtilis）B006與淡紫擬青霉（P. lilacinus）Str.NH-PL-03復合菌劑添加到設施黃瓜連作土壤中，發(fā)現(xiàn)根際土壤中真菌群體總量顯著減少，細菌總量顯著增加，并能促進TRF139等有益菌群增殖，抑制TRF341等有害菌群增殖。尹淑麗等（2012）通過施用生防菌細菌D、放線菌317和木霉菌，研究黃瓜不同生育時期根際土壤中微生物數(shù)量動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)接種細菌D和放線菌317后細菌數(shù)量上升，真菌數(shù)量下降，放線菌數(shù)量的變化不明顯；接種木霉菌則明顯提高了根際土壤中放線菌和真菌的數(shù)量，對細菌的數(shù)量影響不明顯。本試驗中，采用平板稀釋法對根際土壤中的可培養(yǎng)微生物在全年中的數(shù)量變化進行全面檢測，發(fā)現(xiàn)施用玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63菌株發(fā)酵物1 V∶200 V后，根際土壤中細菌數(shù)量增加了19.75%；真菌數(shù)量降低了29.25%；放線菌數(shù)量增加了316.67%，以上3種可培養(yǎng)微生物總量由7.40×106cfu·g-1增加到16.75×106cfu·g-1，增加了126.35%。由此看出，生防菌Men-myco-93-63的施用可以改善根際土壤中的微生物結構。由于利用篩選培養(yǎng)基檢測分離到的微生物只有0.1%～10%（張黎和周青，2008），因此Men-myco-93-63菌株對根結線蟲病土中不可培養(yǎng)微生物的影響如何，還需要利用PCR-DGGE（胡元森 等，2004）等其他分子生物學技術手段作進一步研究。

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Control Efficacy of Streptomyces roseoflavus on Root-knot Nematode and Its Influence on Soil Microbiota

QIAO Dan-na1，ZHANG Yan-jie1，LI Hua-yi1，SHEN Feng-ying1，2，LI Zhen-zhen1，3，LIU Da-qun1*，LI Ya-ning1*

（1College of Plant Protection，Agricultural University of Hebei； Biological Control Center of Plant Diseases and Plant Pests of Hebei Province； National Engineering Research Center for Agriculture in Northern Mountainous Areas，Baoding 071001，Hebei，China；2Hebei North College，Zhangjiakou 075000，Hebei，China；3Agricultural Bureau of Xingtai City，Xingtai 054001，Hebei，China）

Both fermentation broth and solid state fermentation of Streptomyces roseoflavus Menmyco-93-63 isolate were used for controlling tomato and cucumber root-knot nematode. The control efficacy and its effect on soil microbiota were studied. The results showed that the control efficacy of the treatment on cucumber and tomato by 1 V∶200 V solid state fermentation of Men-myco-93-63 were 65.62% and 57.69%，respectively. The application of bio-agents has increased the number of bacteria and actinomyces in soil by 19.57% and 316.67%，respectively，while the number of fungi reduced by 28.57%. The three kinds of the cultivable soil microorganism raised from 7.40×106cfu·g-1to 16.75×106cfu·g-1，amount to 126.35%.

Streptomyces roseoflavus；Isolate Men-myco-93-63；Root-knot nematode；Control effect；Soil microorganism

喬丹娜，女，碩士研究生，專業(yè)方向：植物病害生物防治，E-mail：qiaodanna_2012@163.com

*通訊作者（Corresponding authors）：李亞寧，女，教授，博士生導師，專業(yè)方向：植物病害生物防治，E-mail：yaning22@163.com；劉大群，男，教授，博士生導師，專業(yè)方向：植物病理學，E-mail：ldq@ hebau.edu.cn

2014-01-16；接受日期：2014-02-24

國家自然科學基金項目（31171894），國家高技術研究與發(fā)展計劃（863）項目（2011AA10A205），河北省自然科學基金項目（C2011204114）