胡江平，蔡克瑞，金花淑，金在順，李凱軍

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以進行性癡呆為主要特征，主要的臨床表現(xiàn)為:進行性記憶力減退、認知功能下降及嚴重的精神障礙。其主要的病理特征是:老年斑(senile plaques，SP)、神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)、海馬錐體細胞顆?？张葑冃院湍憠A能神經(jīng)元缺失。SP 和NFTs 是AD 的兩個標志性病理改變，這兩種損害都是病理性蛋白沉積的結(jié)果:細胞外β 淀粉樣蛋白(Aβ)沉積導致SP 形成;細胞內(nèi)自我聚集的高度磷酸化的tau 蛋白則是形成NFTs 的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［1］。

Tau 蛋白是一種微管相關(guān)蛋白，其與成熟神經(jīng)元結(jié)合，對微管形成和穩(wěn)定微管起重要作用［2，3］。Tau 蛋白磷酸化對tau 與微管的結(jié)合至關(guān)重要。但是，異常磷酸化的tau 蛋白聚合成配對的雙螺旋細絲(paried helical filaments，PHFs)，不利于與微管結(jié)合并導致微管網(wǎng)絡(luò)的不穩(wěn)定和神經(jīng)元的死亡［4］。異常磷酸化使tau 蛋白生物學活性喪失，并且與微管蛋白競爭結(jié)合正常tau 蛋白或從已經(jīng)形成的微管上奪取tau 蛋白，導致正常情況下其穩(wěn)定微管和促進微管蛋白聚合成微管的作用消失，Tau 蛋白的過度磷酸化被認為是關(guān)鍵因素。AD 患者腦中tau 蛋白總量多于正常人，正常tau 蛋白減少而異常過度磷酸化tau 蛋白大量增加，而且數(shù)量與患者的癡呆程度成正相關(guān)，在癡呆發(fā)展過程中起重要作用［5，6］。因此，過度磷酸化的tau 蛋白與AD 的形成和發(fā)展有著密切的聯(lián)系。

岡田酸(Okadaic acid，OA)是一種海洋生物提取物，可選擇性抑制蛋白磷酸酯酶，對PP2A 作用最強，使蛋白高度磷酸化，并可以引起氧化損傷，在離體培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中能夠誘導tau 蛋白過度磷酸化;OA 對于磷酸酶的調(diào)節(jié)作用不僅是通過抑制磷酸酶的活性，同時還可以間接激活絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)等其它酶完成。正常情況下磷酸化tau 蛋白分布在神經(jīng)元突起，而非磷酸化的tau 蛋白分布在胞體，經(jīng)過OA 處理的磷酸化與非磷酸化tau蛋白均趨于胞體內(nèi)，提示過度磷酸化驅(qū)使tau 蛋白在胞體內(nèi)聚集。OA 在體內(nèi)能促進Aβ 沉積，造成神經(jīng)元退化，突觸缺失及記憶障礙，產(chǎn)生類似AD 樣病理特征。Tau 蛋白的過度磷酸化又促進了APP 蛋白的表達，推測在tau 蛋白的過度磷酸化與Aβ 生成之間可能存在一種調(diào)節(jié)機制，使AD 出現(xiàn)Aβ 沉積和tau 蛋白的過度磷酸化、NFTs 之間存在相互促進機制，造成AD 患者臨床癥狀加重。因此選用OA 孵育SH-SY5Y 細胞制備tau 蛋白過度磷酸化的細胞模型。

為了在體外驗證VPA 對tau 蛋白磷酸化的影響，我們選用SH-SY5Y 細胞作為研究對象，觀察VPA 對OA 處理的SH-SY5Y 細胞tau 蛋白磷酸化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人神經(jīng)母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所，DMEM 培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司，胎牛血清購自美國Invitrogen 公司，胰蛋白酶購自美國Invitrogen 公司，岡田酸購自美國santa cruz 公司，小鼠抗p-tau (Thr231)購自美國Invitrogen 公司，小鼠抗GAPDH 抗體購自Kangchen 公司，蛋白marker 購自NEB 公司，PVDF 膜購自美國Millipore 公司，ECL 試劑盒購自美國Pierce 公司，四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自美國Sigma 公司，DMSO 購自美國Sigma 公司，青霉素、鏈霉素及其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 實驗分組 常規(guī)細胞培養(yǎng)后分為3 組。(1)V 組:正常培養(yǎng)細胞，未加其它干預(yù)的SH-SY5Y細胞，加等體積的無血清培養(yǎng)基;(2)C 組:40 nmol/L OA 孵育SH-SY5Y 細胞12 h 后，加入等體積的無血清培養(yǎng)基;(3)T 組:40 nmol/L OA 孵育12 h 后加入10 mmol/L VPA 孵育12 h。

1.3 細胞培養(yǎng) SH-SY5Y 細胞復蘇后，加入適量含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，將其吹打成細胞懸液，均勻接種于培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5%CO2、100%濕度CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

1.4 MTT 測定 細胞用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液配成單細胞懸液，每孔100 μl 接種于96 孔培養(yǎng)板，移入培養(yǎng)箱，待細胞完全貼壁后，每孔加入終濃度分別為20、40、80、160 nmol/L 的含有OA 的培養(yǎng)液，對照組加等體積的培養(yǎng)液。每種濃度6 個復孔，培養(yǎng)12 h 后，每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl，繼續(xù)孵育3 h，棄上清，每孔加150 μl DMSO，在水平搖床上震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，酶標儀測定光密度值(490 nm);VPA 的MTT 測定方法同上，濃度分別為1、10、20、50、70、100 mmol/L。

1.5 Western blot 檢測 收集細胞后進行蛋白提取及濃度的測定，經(jīng)灌膠、每管50 μg 加樣、電泳(濃縮膠內(nèi)電泳時的電壓為90 V，其進入分離膠后將電壓調(diào)整為110 V)、50 V 室溫轉(zhuǎn)膜2 h、5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h、一抗及二抗孵育后，應(yīng)用HRP-ECL 發(fā)光法檢測蛋白，用BIO-RAD 凝膠電泳圖像分析儀進行圖像采集，Image J 軟件進行圖像分析。

1.6 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS 16.0 軟件，結(jié)果以均值±標準差()表示，經(jīng)方差齊性檢驗后，對數(shù)據(jù)進行t 檢驗，P ＜0.01 被認為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 OA 對SH-SY5Y 細胞活力的影響 SHSY5Y 細胞經(jīng)不同濃度OA 處理12 h 后，測定OD值，以正常對照組細胞活力為100%，其余各組OD值與之相比得到各自的細胞活力，結(jié)果顯示:當OA濃度大于40 nmol/L 時，細胞活力受到明顯的抑制，且隨著OA 濃度的增加而增強，而低于此濃度的OA對細胞活力沒有明顯的影響(見圖1)。我們選擇細胞活力在80%以上的藥物濃度處理細胞。

2.2 VPA 對SH-SY5Y 細胞活力的影響 SHSY5Y 細胞經(jīng)不同濃度VPA 作用12 h 后，測定OD值，以正常對照組細胞活力為100%，其余各組OD值與之相比得到各自的細胞活力。當VPA 濃度小于20 mmol/L 時，細胞活力維持在80%以上(見圖2)。我們選擇10nmol/LVPA 作為實驗濃度。

2.3 VPA 對OA 處理的SH-SY5Y 細胞tau 蛋白磷酸化的影響 SH-SY5Y 細胞經(jīng)OA 處理(40 mmol/L，12 h)后，加入VPA(10 mmol/L，12 h)提取細胞蛋白，檢測p-tau 和總tau 在Thr231 位點的表達水平。Western blot 結(jié)果顯示，T 組的tau 蛋白磷酸化水平與C 組相比降低了37.1%，與V 組水平相近。光密度值以GAPDH 作為內(nèi)參校正。數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差()表示，與對照組相比＊＊P ＜0.01(見圖3)。

圖1 OA 對SH-SY5Y 細胞活力的影響

圖2 VPA 對SH-SY5Y 細胞活力的影響

圖3 VPA 對OA 處理的SH-SY5Y 細胞tau 蛋白磷酸化的影響

3 討論

AD 的重要病理變化之一是神經(jīng)細胞內(nèi)的NFTs形成，其主要成分就是過度磷酸化的tau 蛋白［7］，Tau 是一種微管相關(guān)蛋白，與成熟神經(jīng)元結(jié)合，對促進微管形成、穩(wěn)定微管系統(tǒng)起著重要作用。Tau 蛋白磷酸化對tau 與微管的結(jié)合至關(guān)重要，異常磷酸化的tau 蛋白聚合成PHFs，不利于與微管結(jié)合并導致微管網(wǎng)絡(luò)的不穩(wěn)定和神經(jīng)元死亡。NFTs 的形成與tau 蛋白過度磷酸化密切相關(guān)，在AD 患者腦中，過度磷酸化的tau 蛋白明顯增加，且NFTs 的數(shù)量與癡呆患者的程度呈正相關(guān)［8］。在AD 腦組織中，異常過度磷酸化的tau 蛋白含量顯著增高，并聚集成雙螺旋細絲，Tau 磷酸化程度的增加使tau 結(jié)合微管的能力下降，從而喪失了促進微管組裝的生物活性，導致細胞骨架的結(jié)構(gòu)異常和神經(jīng)細胞死亡。AD 患者有21個異常磷酸化位點，其中研究較多的有Ser199、Thr205、Thr212、Thr231、Ser396 和Ser404 等多個磷酸化位點［9］，本實驗選取常用的Thr231 位點進行檢測。

OA 能夠阻止tau 蛋白的去磷酸化，導致tau 蛋白的異常過度磷酸化，產(chǎn)生AD 樣的病理過程［10］，適合用來制備AD 時tau 蛋白過度磷酸化的細胞模型。MTT 實驗表明，OA 濃度大于40 nmol/L 時，細胞活力受到明顯的抑制，因此我們選擇40 nmol/L OA 處理12 h 作為制備AD 時tau 蛋白過度磷酸化的細胞模型。在制備tau 蛋白磷酸化的細胞模型后，進一步觀察VPA 對tau 蛋白磷酸化的影響。采用40 nmol/L OA 作用于SH-SY5Y 細胞，建立tau 蛋白磷酸化的細胞模型，然后給予VPA 處理，觀察其對tau 蛋白磷酸化水平的影響，當VPA 濃度小于20 mmol/L 時，細胞活力維持在80%以上，我們選擇10 mmol/L VPA 作為實驗濃度，Western blot 檢測顯示，VPA 可以降低OA 處理的細胞模型在Thr231 位點的tau 蛋白磷酸化水平。

本實驗結(jié)果表明，對于OA 誘導的SH-SY5Y 細胞給予VPA 處理，Tau 蛋白磷酸化水平明顯降低，與正常細胞tau 蛋白磷酸化水平相當，表明VPA 對tau 蛋白磷酸化具有明顯的抑制作用，說明VPA 對AD 的治療具有積極的作用，其機制很可能是通過減少tau 蛋白磷酸化水平而發(fā)揮作用的。

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