張海松，宋振全，梁國標(biāo)，劉恩智

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病，會嚴(yán)重影響患者勞動能力和生活自理能力，而且其治療時間長，花費也十分巨大，然而功能恢復(fù)卻不理想，一直是醫(yī)學(xué)界研究的難點和重點。傳統(tǒng)觀點認(rèn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，由于內(nèi)在的和外在的各種原因?qū)е率軗p神經(jīng)很難再生。目前，在脊髓損傷的諸多治療方案中，細(xì)胞移植一直是研究的重點之一［1，2］。然而單獨的細(xì)胞移植往往達(dá)不到理想的效果，仍需要藥物進(jìn)行輔助治療與干預(yù)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)具有分化成神經(jīng)細(xì)胞的潛能，是骨髓中的造血結(jié)構(gòu)性和功能性支持細(xì)胞，其用于治療脊髓損傷已取得一定進(jìn)展［3，4］，但對于急性脊髓損傷伴隨的補體系統(tǒng)激活引起的損傷組織的中性粒細(xì)胞浸潤并從而加重繼發(fā)性損傷卻無能為力，導(dǎo)致治療效果欠佳;補體系統(tǒng)抑制劑(complement system inhibitor，CSI)則恰恰可以彌補這方面的缺陷［5，6］，二者的聯(lián)合移植值得關(guān)注。本研究將初步探索補體系統(tǒng)抑制劑與大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合移植對于脊髓損傷模型大鼠的修復(fù)作用，為后續(xù)實驗奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 Wistar 大鼠BMSC 的分離、培養(yǎng)、標(biāo)記取6 w 齡Wistar 大鼠15 只，重約100～150 g，雌雄不限。采用密度梯度離心、貼壁培養(yǎng)和酶消化控制相結(jié)合的方法，分離、培養(yǎng)、純化BMSC，每次傳代后在倒置顯微鏡下作形態(tài)學(xué)觀察與鑒定。傳至第6代，在移植前1 d 加入BrdU(3 mg/L)予以標(biāo)記。移植前細(xì)胞計數(shù)，制成濃度約為4 ×106/ml 胞懸液。

1.2 補體系統(tǒng)抑制劑成分的制備 參考已報道［7］的方法應(yīng)用多步沉淀及薄層層析方法進(jìn)行草麻黃補體抑制成分的提純并進(jìn)行活性鑒定。1 kg 草麻黃加入pH 4.0 的蒸餾水10 L 于室溫過夜，煮沸1 h后過濾除渣，加入1 mol/L NaOH 調(diào)整pH 至9.0，室溫攪拌，孵育1 h 至出現(xiàn)大量沉淀物，4000 r/min離心30 min 后棄上清，以pH9.0 蒸餾水及95%乙醇洗滌沉淀3 次，室溫烘干得到棕褐色粗品共18.5 g。取3 g 粗品溶于pH 4.0 的蒸餾水50 ml中，攪拌1 h 后過夜，煮沸1 h，2000 r/min 離心15 min，棄上清，溶于pH 9.0 的蒸餾水中。上述酸堿沉淀過程共3 次，最后所得沉淀物溶于10 ml 蒸餾水中，調(diào)整pH 值至4.0，進(jìn)行薄層層析，紫外燈(254 nm)下觀察樣品分離情況。三段層析帶分割收集，以pH 4.0 的蒸餾水分別洗脫，洗脫液調(diào)pH 值至9.0，均出現(xiàn)沉淀。離心棄上清，微量法進(jìn)行補體溶血實驗測定，結(jié)果證明最快速移動層析帶具有顯著的抗補體活性，主要作用于補體經(jīng)典途徑及旁路途徑的C2 及C9 點位并進(jìn)而有效抑制補體的聯(lián)級反應(yīng)。重復(fù)以上步驟，共成功提取草麻黃補體抑制成分(ES)3.9 g，密封貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 聯(lián)合移植細(xì)胞懸液組 將上述濃度為4×106/ml 的BMSC 細(xì)胞懸液與1.5 g 補體抑制劑成分以100∶ 1 比例混合制成細(xì)胞懸液，作為聯(lián)合移植細(xì)胞懸液組。

1.4 SCI 動物模型的制作及分組 取雌性Wistar 大鼠100 只，以大鼠的T11 為中心，通過自制Allen 打擊架，制成重物打擊致脊髓全癱Allen 模型。傷后8 d，將制模大鼠隨機分為4 組，每組25 只;其中，A 組為BMSC 治療組、B 組為ES 治療組、C 組為空白手術(shù)組、D 組為BMSC+ES 聯(lián)合移植治療組。

1.5 移植方法 用微量進(jìn)樣器抽取6 μl 細(xì)胞懸液，在立體定位儀下分別于損傷區(qū)中心及遠(yuǎn)、近端各1 mm 處3 點注射，進(jìn)針深度為1 mm，注入細(xì)胞后針頭在脊髓內(nèi)停留1.5 min 后抽出?？瞻讓φ战M:注射同體積的培養(yǎng)基。然后依次縫合肌肉及皮膚。

1.6 術(shù)后護(hù)理 麻醉蘇醒后分籠飼養(yǎng)，術(shù)后3 d應(yīng)用抗生素。每天依次進(jìn)行膀胱按摩擠尿，并翻身防止褥瘡發(fā)生。術(shù)后每隔1 w 稱量體重并進(jìn)行監(jiān)控。

1.7 灌注、固定、取材、染色移植后的1、3、5 w，每組隨機取10 只大鼠，4%多聚甲醛心內(nèi)灌注、固定、取材，石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚5 μm，蘇木素-依紅(HE)染色、觀察［8］。

1.8 各組大鼠雙后肢的運動功能觀察 各組大鼠分別于移植后的7 w 內(nèi)每周放在100 cm ×150 cm 的開放空間，采用BBB 后肢功能評分標(biāo)準(zhǔn)［9］，3人、雙盲獨立觀察大鼠雙后肢的運動功能并記錄。

1.9 BMSC 存活免疫組織化學(xué)觀察及計數(shù)分別取注射后1、3、5 w 各組標(biāo)本切片各10 張，先后加入Ⅰ抗(BrdU 小鼠抗大鼠)和Ⅱ抗(小鼠IgG)，DAB 顯色后觀察。在100 倍放大條件下，用Nikon ECLIPSE E600 計算機圖像分析儀和Image-pro-plus(4.5)圖像分析軟件，按文獻(xiàn)Lee 法［7］計數(shù)每個標(biāo)本各個時間點BrdU 陽性細(xì)胞數(shù)的均值以()表示，并計算其占細(xì)胞移植數(shù)的百分率。

1.10 過氧化物酶(MPO)活性 各組動物于傷后每個時間點各取5 只再次麻醉，以傷處為中心取1 cm 脊髓組織，置于液氮中保存，稱重后剪碎。加入含0.5%溴化十六烷基三甲胺的磷酸鹽緩沖液中勻漿［9］，超聲細(xì)胞粉碎儀粉碎后再于4 ℃下孵育30 min，12500 r/min 離心30 min，取上清液0.1 ml，按ELISA 測試盒方法進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法 采用單因素方差分析法比較組間差異。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后大鼠體重變化 術(shù)后大鼠體重均出現(xiàn)不同程度的減輕，且2 w 內(nèi)體重減輕明顯，4 w 時大鼠體重開始增加(見表1)，細(xì)胞移植組與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 各組大鼠后肢功能BBB 評分結(jié)果 打擊術(shù)前大鼠BBB 評分均為21 分，術(shù)后1 d 各組大鼠雙后肢功能喪失，足底向上呈不負(fù)重拖動或足置于不負(fù)重位，主要靠前肢拖動身體移動，腹部貼地，大小便失禁，BBB 評分均為0 分，術(shù)后7 d 細(xì)胞移植組大部分大鼠恢復(fù)自主膀胱，2 w 內(nèi)所有大鼠均可自行排尿。BBB 運動評分具體結(jié)果(見表2)。移植后從2 w 開始，各組的BBB 評分由高到低排列順序為D＞A ＞B ＞C 組(P ＜0.05)。

2.3 BMSC 存活及計數(shù)觀察結(jié)果 對于A、B、D 組，移植后1 w 在損傷灶內(nèi)及損傷灶臨近節(jié)段的脊髓內(nèi)可見大量大小不一、呈圓形或橢圓形、胞體較大、藍(lán)色表達(dá)于細(xì)胞漿的BrdU 陽性細(xì)胞，主要分布于灰、白質(zhì);在距損傷灶鄰近節(jié)段脊髓白、灰質(zhì)內(nèi)，陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少;移植后3 w 損傷段脊髓內(nèi)仍可見較多BrdU 陽性細(xì)胞，但在灰質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量明顯少于白質(zhì);移植后5 w 脊髓內(nèi)的BrdU 陽性細(xì)胞數(shù)量減少。D 組移植后1 w 約有(9210 ±652)個BrdU陽性細(xì)胞，約占移植細(xì)胞數(shù)量的7.0%;移植后3 w約有(7923 ±677)個BrdU 陽性細(xì)胞，約占移植細(xì)胞數(shù)量的6.2%;移植后5 w 約有(5822 ±692)個BrdU陽性細(xì)胞，約占移植細(xì)胞數(shù)量的5.1%。A 組移植后1 w 約有(7110 ±552)個BrdU 陽性細(xì)胞，約占移植細(xì)胞數(shù)量的5.8%;移植后3 w 約有(5243 ±517)個BrdU 陽性細(xì)胞，約占移植細(xì)胞數(shù)量的4.2%;移植后5 w 約有(4850 ±545)個BrdU 陽性細(xì)胞，約占移植細(xì)胞數(shù)量的3.5%。B 組移植后1 w 約有(7020±465)個BrdU 陽性細(xì)胞，約占移植細(xì)胞數(shù)量的5.5%;移植后3 w 約有(5106 ±434)個BrdU 陽性細(xì)胞，約占移植細(xì)胞數(shù)量的4.1%;移植后5 w 約有(4341 ±448)個BrdU 陽性細(xì)胞，約占移植細(xì)胞數(shù)量的3.2%。C 組損傷段脊髓及鄰近節(jié)段內(nèi)未見有BrdU 陽性細(xì)胞。

2.4 過氧化物酶(MPO)活性測定結(jié)果 傷后12 h，各組MPO 活性開始增高，分別為0.7824 ±0.085、0.8954 ±0.101、0.8636 ±0.091 和0.7786 ±0.103 (P ＜0.05);傷后3 d 達(dá)到高峰，分別達(dá)到1.8824 ±0.125、1.3064 ±0.141、1.9243 ±0.121 和1.2123 ±0.132(P ＜0.01)，之后隨著時間延長活性逐漸減弱，存在一個動態(tài)變化過程。B 和D 組在傷后3 d 起MPO 活性均弱于A 和C 組，差異具有顯著性意義(P ＜0.01)。

表1 術(shù)后各組大鼠不同時期體重變化情況(，n=25)

表1 術(shù)后各組大鼠不同時期體重變化情況(，n=25)

與空白組比較* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

表2 術(shù)后各組大鼠不同時期BBB 運動功能評分表(，n=25)

表2 術(shù)后各組大鼠不同時期BBB 運動功能評分表(，n=25)

D 組與A 組比較* P ＜0.05;D 組與B 組比較△P ＜0.01;與C 組比較#P ＜0.01

3 討論

SCI 可以激發(fā)機體并引起損傷脊髓組織強烈的免疫炎性反應(yīng)。此過程包括中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等向損傷處浸潤、膠質(zhì)細(xì)胞的活化、炎性介質(zhì)的產(chǎn)生及代謝產(chǎn)物堆積;還可使血管發(fā)生痙攣，血管內(nèi)皮變性、水腫、出血或血小板凝集、血栓形成等，造成局部微循環(huán)障礙，從而使損傷脊髓缺血范圍不斷擴(kuò)大、損傷程度不斷加重［10～12］。

從嚴(yán)格意義上來講，SCI 后免疫炎癥反應(yīng)是一把雙刃劍。一方面該過程可以清除壞死組織，促進(jìn)組織細(xì)胞增生和創(chuàng)面修復(fù)，這是機體損傷后修復(fù)的基本過程，是一種普遍的防御和保護(hù)機制［13］。另一方面，嚴(yán)重的創(chuàng)傷如脊髓損傷時存在過度的炎癥反應(yīng)，這將導(dǎo)致脊髓組織進(jìn)一步的損傷，妨礙脊髓組織的修復(fù)和神經(jīng)元的再生，導(dǎo)致神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等繼發(fā)性的壞死和凋亡，從而阻礙損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)，最終導(dǎo)致臨床結(jié)果的惡化，而這一方面往往更為重要［14，15］。在對大鼠SCI 模型的研究中發(fā)現(xiàn)，SCI組織中的中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞的數(shù)量與繼發(fā)性SCI 程度密切相關(guān)，提示抑制損傷后的炎癥反應(yīng)可顯著地減輕神經(jīng)組織的損害。在本研究中，組織病理學(xué)檢查結(jié)果也顯示，大鼠SCI 后損傷組織中的炎癥反應(yīng)存在動態(tài)變化過程，實驗組的中性粒細(xì)胞浸潤、神經(jīng)元腫脹變性等均輕于對照組，提示ES 的干預(yù)治療對損傷后的免疫炎癥有抑制作用。免疫炎癥反應(yīng)參與繼發(fā)性脊髓損害已經(jīng)越來越得到人們的共識，而通過各種途徑抑制SCI 后的炎癥反應(yīng)已經(jīng)成為SCI 實驗性及臨床性治療的一個重要策略及熱點方向［16，17］。在急性免疫炎癥反應(yīng)過程中，中性粒細(xì)胞是主要的炎癥細(xì)胞，也是第一個到達(dá)損傷組織的炎癥細(xì)胞［18］。MPO 主要是中性粒細(xì)胞胞漿顆粒中的一種特異性酶，每個細(xì)胞所含酶約為細(xì)胞干重的5%，其活性的高低可代表中性粒細(xì)胞的數(shù)量和活性［19，20］。我們動態(tài)檢測大鼠SCI 后脊髓組織的MPO 活性，以明確SCI 后中性粒細(xì)胞活性狀態(tài)，并比較實驗組及對照組傷后不同時間點MPO 活力差異。結(jié)果表明，B 和D 組在各個時間點MPO 活性均顯著弱于A 和C 對照組，表明補體抑制劑ES 對SCI 組織中MPO 活性有顯著抑制作用，即對免疫炎癥反應(yīng)的抑制作用較強。結(jié)合上述其他實驗結(jié)果，不難看出，補體系統(tǒng)抑制劑聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植用于修復(fù)脊髓損傷大鼠效果較好，既可以增強神經(jīng)細(xì)胞的再生能力又可以抑制其繼發(fā)的免疫炎癥反應(yīng)，從而大大提高了治療效果。

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