胡紅美，郭遠(yuǎn)明,*，雷 科，張小軍，嚴(yán)忠雍，何依娜，尤炬炬，劉 琴

（1.浙江省海洋水產(chǎn)研究所 浙江省海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 舟山 316100；2.浙江海洋學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，浙江 舟山 316000）

分散固相萃取凈化-氣相色譜法測定水產(chǎn)品中氯霉素和氟苯尼考

胡紅美1，郭遠(yuǎn)明1,*，雷 科2，張小軍1，嚴(yán)忠雍1，何依娜1，尤炬炬1，劉 琴1

（1.浙江省海洋水產(chǎn)研究所 浙江省海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 舟山 316100；2.浙江海洋學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，浙江 舟山 316000）

建立測定水產(chǎn)品中氯霉素和氟苯尼考的氣相色譜-電子捕獲檢測方法。樣品通過乙酸乙酯萃取、正己烷初步凈化后，經(jīng)過分散固相萃取進(jìn)一步凈化、硅烷化試劑衍生，再采用氣相色譜-電子捕獲法檢測、外標(biāo)法定量。結(jié)果表明：氯霉素、氟苯尼考分別在1.5～100 μg/L、6～400 μg/L范圍內(nèi)，組分含量與峰面積呈線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.998 1和0.999 7，檢出限分別為0.1、0.3 μg/kg。氯霉素和氟苯尼考在不同基質(zhì)的水產(chǎn)品（鯽魚、青蟹、南美白對蝦）中不同加標(biāo)水平回收率分別為82%～106%、87%～111%和91%～98%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.3%～4.9%、2.4%～4.5%和1.4%～4.1%（n=5）。本方法基體干擾小、線性范圍寬，靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度能滿足水產(chǎn)品中氯霉素類藥物的含量分析。

分散固相萃??；氣相色譜-電子捕獲檢測法；水產(chǎn)品；氯霉素類藥物

氯霉素、氟苯尼考同屬于氯霉素類藥物，是一種廣譜抗菌藥，因其具有抑菌性和殺菌性被廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中細(xì)菌性疾病的預(yù)防和治療。氯霉素因其苯環(huán)上有硝基，故對人體有嚴(yán)重的副作用，會抑制骨髓造血功能、引起再生障礙性貧血[1]。歐盟、美國以及我國等國規(guī)定在食品中氯霉素零容許量，即不得檢出。氟苯尼考在安全性和有效性方面雖比氯霉素具有明顯優(yōu)勢，但由于獸醫(yī)臨床的濫用、誤用，細(xì)菌耐藥性問題越來越嚴(yán)重，我國規(guī)定魚肌肉+皮部分最高殘留限量為1 000 μg/kg，歐盟也規(guī)定鰭魚類肌肉+皮部分最高殘留限量為1 000 μg/kg。

目前，國內(nèi)外關(guān)于氯霉素類藥物殘留檢測方法已很很多，主要采用酶聯(lián)免疫法[2-5]、氣相色譜法[6-10]、氣相色譜-質(zhì)譜法[11-13]、液相色譜法[14-16]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[17-25]。酶聯(lián)免疫法使用酶聯(lián)免疫檢驗(yàn)試劑盒，通常適合于大規(guī)模篩選，但由于抗體批次不同，測定結(jié)果將出現(xiàn)一定差異、重復(fù)性差，而且特異性很強(qiáng)，不能進(jìn)行多殘留檢測，試劑昂貴，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果[26-27]；氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法一般需要衍生試劑進(jìn)行衍生化[28]，方法較繁瑣；液相色譜法靈敏度達(dá)不到要求[29]；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法背景干擾小、靈敏度高，是氯霉素類藥物殘留檢測的首選方法[30]，也是目前氯霉素類藥物檢測方法的研究熱點(diǎn)，但液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀價(jià)格昂貴，難以一般實(shí)驗(yàn)室普及。而采用氣相色譜法測定氯霉素類藥物近2年幾乎未見報(bào)道，且以前報(bào)道中均采用固相萃取法進(jìn)行再凈化，使得操作更加復(fù)雜。因此研究一種更簡單的前處理方法對改善氣相色譜法的應(yīng)用前景顯得十分重要。

隨著分散固相萃取近年來在藥物殘留前處理中發(fā)揮的巨大作用[31-33]，目前已有學(xué)者結(jié)合快速、簡易、廉價(jià)、有效、穩(wěn)定、安全（quick, easy, cheap, effective, rugged, safe，QuEChERS）前處理法、采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定氯霉素[34]。但這些報(bào)道首先限定了分散溶劑，再選擇合適的固相吸附劑，忽略了分散溶劑對不同吸附劑的影響，此外有些固相吸附劑在不同分散溶劑中的效果截然相反。本研究通過對分散固相萃取方法的研究，首次建立了分散固相萃取-氣相色譜法測定水產(chǎn)品中氯霉素和氟苯尼考?xì)埩袅康姆椒ā?/p>

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

所有水產(chǎn)品（鱸魚、大黃魚、草魚、鯽魚、鯉魚、鳊魚、甲魚、青蟹、南美白對蝦）采集于舟山、溫州和臺州等地的無公害水產(chǎn)養(yǎng)殖基地。

正己烷、丙酮、乙酸乙酯、甲醇（均為色譜純）美國Merck公司；氯霉素、氟苯尼考（純度均＞98%）德國Dr. Ehrenstorfer公司；N,O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺∶三甲基氯硅烷（99∶1）（衍生化試劑） 美國Regis公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GC-450氣相色譜儀（配有電子捕獲檢測器） 美國Varian公司；Centrifuge 5810高速離心機(jī) 德國Eppendorf公司；R-215旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)儀 瑞士Büchi公司；KD200可視氮吹儀（配有5 mL模塊） 杭州奧盛儀器有限公司；N-丙基乙二胺吸附劑（primary secondary amine，PSA，粒徑50 μm）、C18吸附劑（粒徑50 μm）上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

1.3.1.1 制樣

魚：去鱗、去皮，沿脊背取肌肉；蟹、甲魚：取可食肌肉部分；蝦：去頭、去殼、去附肢，取可食肌肉部分。樣品切為不大于0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小塊，用高速組織搗碎機(jī)勻質(zhì)，密封，-18℃冷凍保存。

1.3.1.2 提取

將樣品解凍，稱取5.00 g于50 mL離心管中，加入20 mL乙酸乙酯，渦旋2 min，以6 000 r/min高速離心3 min，收集提取液于100 mL梨形瓶中，再往試樣中加入10 mL乙酸乙酯，重復(fù)上述過程1次，合并提取液，于40 ℃水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。

1.3.1.3 凈化

殘?jiān)? mL甲醇溶解后，加入25 mL 4%氯化鈉溶液，渦旋30 s，再加入15 mL正己烷，渦旋2 min，以6 000 r/min高速離心3 min，棄去上層正己烷相，再用10 mL正己烷重復(fù)提取1遍（如果試樣含脂肪較多，可重復(fù)提取多遍）。水相中加入15 mL乙酸乙酯，渦旋2 min，以6 000 r/min高速離心3 min，吸取乙酸乙酯相，過無水硫酸鈉脫水過濾于50 mL梨形瓶中，再向水相中加入10 mL乙酸乙酯，重復(fù)上述操作1次。用少量乙酸乙酯淋洗無水硫酸鈉，合并提取液，于40 ℃水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。加入2 mL丙酮溶解提取物并轉(zhuǎn)移到5 mL具塞玻璃離心管中，用1 mL丙酮洗滌梨形瓶，合并丙酮溶解液，加入100 mg PSA吸附劑，渦旋30 s，以3 000 r/min高速離心3 min，吸取上清液于另一潔凈5 mL具塞玻璃離心管中，于50 ℃干浴中吹氮蒸發(fā)至近干，再用1 mL丙酮洗滌離心管壁并吹氮蒸發(fā)至干。

1.3.1.4 衍生

再加入100 μL衍生化試劑，渦旋混合30 s，在70℃烘箱中反應(yīng)30 min后，再于50 ℃干浴中吹氮蒸發(fā)恰好至干。加入100 μL水，再加入1 mL甲苯，渦旋混勻，靜置10 min，以4 000 r/min高速離心3 min，吸取上層甲苯相，取1 μL進(jìn)入氣相色譜分析。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：D B-5 M S毛細(xì)管氣相色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；不分流進(jìn)樣；載氣：高純氮?dú)猓?9.999%）；流速2.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度260 ℃；電子捕獲檢測器溫度300 ℃；升溫條件：柱初始溫150 ℃，保持1.0 min，以15 ℃/min升至260 ℃，再以30℃/min升至280 ℃，保持5.0 min；總運(yùn)行時(shí)間24 min；進(jìn)樣量1 μL。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取氯霉素和氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品0.005 0 g，用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，配制成500 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液。再通過逐級稀釋、甲醇定容，配制成氯霉素質(zhì)量濃度為100 μg/L、氟苯尼考質(zhì)量濃度為400 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，4 ℃儲存。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別量取15、25、50、100、200、500、1 000 μL的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，于50 ℃干浴中吹氮蒸發(fā)至干，加入100 μL衍生化試劑，渦旋混合30 s，在70 ℃烘箱中反應(yīng)30 min后，再于50 ℃干浴中吹氮蒸發(fā)恰好至干。加入1 mL甲苯，再加入100 μL水，渦旋混勻，靜置10 min，以4 000 r/min高速離心3 min，吸取上層甲苯相，配制成質(zhì)量濃度為1.5、2.5、5、10、20、50 μg/L和100 μg/L的氯霉素溶液、質(zhì)量濃度為6、10、20、40、80、200、400 μg/L的氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)工作液，供分析。以峰面積為縱坐標(biāo)、氯霉素和氟苯尼考質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 樣品定量分析

式中：ρ為測定含量/（μg/kg）；w為上機(jī)質(zhì)量濃度/（μg/L）；V為樣品定容體積/mL；m為取樣質(zhì)量/g。其中V=1 mL，m=5.00 g。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

氯霉素、氟苯尼考微溶于水，易溶于乙酸乙酯、甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑。但甲醇、乙腈對人體毒性較大，且乙腈在揮干時(shí)容易冒泡，揮干時(shí)間長[12]，通常用于奶制品的提??；甲醇的極性比較大，提取液含雜質(zhì)較多；而乙酸乙酯偏中性，提取液含雜質(zhì)較少，提取效率高，毒性小[8]，容易揮干。本實(shí)驗(yàn)采用乙酸乙酯作為提取溶劑可以最大限度的從水產(chǎn)品中提取出有效成分并使共萃取的干擾物較少。

2.2 凈化條件的確定

對于某些樣品，經(jīng)正己烷去除脂質(zhì)和類脂后，無需進(jìn)一步凈化便可滿足分析方法要求，但對于凈化不完全的樣品則需要進(jìn)行進(jìn)一步凈化。文獻(xiàn)報(bào)道比較多的是采用C18固相萃取柱[6-7,19]、硅膠固相萃取柱[14]、HLB固相萃取柱[25]，或者多種固相萃取柱相結(jié)合[13]的方法。雖然固相萃取法能達(dá)到較好的凈化效果，但需要進(jìn)行萃取柱活化、上樣、淋洗、洗脫等過程，步驟較多、過柱時(shí)間較長，過柱和洗脫過程中流速控制不當(dāng)容易造成樣品損失，且成本較高，不利于大批量樣品的檢測。本實(shí)驗(yàn)采用分散固相萃取凈化，比較了100 mg PSA吸附劑、100 mg C18吸附劑在不同有機(jī)溶劑（乙酸乙酯、甲醇、丙酮）中的凈化效果（表1），結(jié)果表明，C18吸附劑在不同有機(jī)溶劑（乙酸乙酯、甲醇、丙酮）中的凈化效果均不明顯；PSA吸附劑在乙酸乙酯中可完全吸附目標(biāo)化合物，使得最終檢測結(jié)果中無氯霉素和氟苯尼考，此外PSA吸附劑在甲醇和丙酮中凈化效果均較好。這可能是因?yàn)镻SA吸附劑能有效地去除食品中影響農(nóng)殘檢測的碳水化合物、脂肪酸、有機(jī)酸、酚類、一些極性色素以及糖類等干擾，而C18吸附劑主要用于去除脂肪和酯類等非極性干擾物，在前一步正己烷凈化中已除去大部分的脂質(zhì)和類脂。考慮到甲醇毒性較大且沸點(diǎn)較高，選擇用丙酮溶解提取物，在丙酮中用PSA吸附劑凈化。此外，考察了不同量（0～200 mg）的PSA吸附劑對凈化效果的影響（表1）。結(jié)果表明，隨著PSA吸附劑量的增加，凈化效果有所增加，但由于PSA吸附劑會吸附一定的丙酮，PSA劑量越高，回收率會有所下降，最終選擇使用100 mg PSA吸附劑，此時(shí)既能達(dá)到較好的凈化效果，又能保證較高的回收率。

表1 不同劑量的C18、PSA吸附劑在乙酸乙酯、甲醇、丙酮中的凈化回收率（n=5）Table 1 Recoveries of CAP and FF purified with C18vs. PSA in ethyl acetate, methanol or acetone as well as different amounts of PSA in acetone (n = 5)%

2.3 衍生條件的確定

由于氯霉素、氟苯尼考含有羥基、氨基、硫?；皝啺坊加泻軓?qiáng)的極性且熱穩(wěn)定性差、難揮發(fā)，在采用氣相色譜法分析此類化合物時(shí)，需對其極性官能團(tuán)進(jìn)行酯化、硅烷化或?；?，生成熱穩(wěn)定性和易揮發(fā)的衍生物。本實(shí)驗(yàn)利用硅烷化試劑將氯霉素、氟苯尼考的羥基硅烷化衍生成易揮發(fā)、熱穩(wěn)定的物質(zhì)。由于衍生化試劑遇水易分解，會造成目標(biāo)化合物衍生失敗，且實(shí)驗(yàn)證實(shí)若衍生時(shí)存在少量水時(shí)，將檢測不到目標(biāo)物。因此必須保證衍生過程中無水。此外，衍生完畢后，多余的衍生溶液必須通過吹氮蒸發(fā)恰好至干，過頭或未干均會影響衍生效果，降低重復(fù)性。因此，本實(shí)驗(yàn)選用可視氮吹儀隨時(shí)觀察氮吹過程。此外，本實(shí)驗(yàn)在衍生化后加100 μL水滅活，以終止在進(jìn)樣時(shí)衍生化試劑與分析物在進(jìn)樣口進(jìn)一步發(fā)生反應(yīng)，保證了測定結(jié)果的穩(wěn)定性，同時(shí)也凈化了反應(yīng)液，有利于色譜峰的分離。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，如果不加100 μL水滅活，直接加有機(jī)試劑（如正己烷）定容，對氯霉素影響不大，峰面積變化不超過10%，但對氟苯尼考影響甚大，會造成氟苯尼考色譜峰面積不穩(wěn)定（隨著時(shí)間延長，先變大，后變?。?，峰面積變化甚至?xí)^50%。

表3 鯽魚、青蟹、南美白對蝦中氯霉素和氟苯尼考的加標(biāo)回收率及方法的精密度（n=5）Table 3 Recoveries and RSDs of CAP and FF in spiked crucian, blue crab, and Penaeus vannawei by the proposed method (n = 5)

2.4 定容試劑的選擇

本實(shí)驗(yàn)比較了正己烷、甲苯定容對測定結(jié)果的影響。結(jié)果表明，同等條件下，采用甲苯定容可使氯霉素、氟苯尼考的色譜響應(yīng)值增大，其中氯霉素峰面積增加5%～10%左右，而氟苯尼考增加將近40%～50%。高沸點(diǎn)的甲苯可提高實(shí)驗(yàn)重復(fù)性，放置一段時(shí)間后重新進(jìn)樣時(shí)的測定結(jié)果比正己烷穩(wěn)定。因此，本實(shí)驗(yàn)采用衍生化結(jié)束后直接加100 μL水、1 mL甲苯渦旋離心后取甲苯相進(jìn)樣的定容方式。

2.5 方法評價(jià)

2.5.1 方法的線性范圍及檢出限

將標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按照1.3.2節(jié)進(jìn)行分析。用外標(biāo)法繪制出校正曲線。氯霉素、氟苯尼考分別在1.5～100、6～400 μg/L范圍內(nèi)與其峰面積呈良好線性關(guān)系，氯霉素、氟苯尼考檢出限分別為0.1、0.3 μg/kg（表2）。

表2 回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 2 Regression equations, linear ranges and detection limits

圖1 氯霉素（20 μg/L）和氟苯尼考（80 μg/L）標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.1 Standard chromatogram of 20 μg/L CAP and 80 μg/L FF

2.5.2 方法的精密度和回收率

為考察基體效應(yīng)以及驗(yàn)證方法準(zhǔn)確性和重復(fù)性，分別準(zhǔn)確稱取鯽魚、青蟹、南美白對蝦樣品5.00 g，按照前述處理方法平行測定3 次，均未檢出氯霉素，但在鯽魚中檢測出氟苯尼考，含量為2.75 μg/kg，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為3.7%。再分別往5.00 g鯽魚、青蟹、南美白對蝦樣品中各加入15、75 μL和200 μL的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，配制成低（氯霉素0.3 μg/kg、氟苯尼考1.2 μg/kg）、中（氯霉素1.5 μg/kg、氟苯尼考6 μg/kg）和高（氯霉素4 μg/kg、氟苯尼考16 μg/kg）3個(gè)質(zhì)量濃度的加標(biāo)樣品，平行測定5 次。鯽魚、青蟹、南美白對蝦樣品加標(biāo)回收率為分別為82%～106%、87%～111%和91%～98%，RSD分別為2.3%～4.9%、2.4%～4.5%和1.4%～4.1%（n=5）。結(jié)果表明，該方法基體效應(yīng)可以忽略，精確度和準(zhǔn)確度滿足分析方法要求。按照本分析方法，對采集的其他樣品進(jìn)行了測定，除了在草魚中檢測出氟苯尼考（含量為0.786 μg/kg），其他樣品中均未檢出氯霉素和氟苯尼考。

圖2 鯽魚樣品（A）和加標(biāo)鯽魚樣品（氯霉素1.5 μg/kg、氟苯尼考6.0 μg/kg）（B）氣相色譜圖Fig.2 Chromatograms of (A) crucian and (B) spiked crucian with 1.5 μg/kg CAP and 6.0 μg/kg FF

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用分散固相萃取凈化和氣相色譜電子捕獲法對水產(chǎn)品中氯霉素和氟苯尼考進(jìn)行了同時(shí)測定。在進(jìn)行分散固相萃取凈化時(shí)，詳細(xì)考察了不同固相吸附劑在不同分散溶劑中的凈化效果，結(jié)果表明不同分散溶劑對固相吸附的影響很大。此外固相吸附劑的用量也會影響凈化效果。最終選擇100 mg PSA吸附劑、丙酮為分散溶劑。本研究還對衍生過程、定容試劑進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明衍生過程必須無水，衍生完成后，多余衍生溶液必須恰好氮吹至干，并使用100 μL水滅活，再加入定容試劑甲苯。該方法靈敏、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高、回收率令人滿意，基體干擾小，能滿足水產(chǎn)品中氯霉素類藥物的分析要求，可進(jìn)一步應(yīng)用到其他食品中氯霉素類藥物的檢測。

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Determination of Chloramphenicol and Florfenicol in Fishery Products by Using Dispersive Solid Phase Extraction and Gas Chromatography

HU Hong-mei1, GUO Yuan-ming1,*, LEI Ke2, ZHANG Xiao-jun1, YAN Zhong-yong1, HE Yi-na1, YOU Ju-ju1, LIU Qin1
(1. Key Laboratory of Mariculture and Enhancement of Zhejiang Province, Marine Fishery Institute of Zhejiang Province, Zhoushan 316100, China; 2. School of Fishery, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316000, China)

An efficient, sensitive, and low matrix interference method for the determination of chloramphenicol (CAP) and florfenicol (FF) in fishery products using gas chromatography-electron capture detector (GC-ECD) has been developed. Samples were treated by extraction with ethyl acetate and n-hexane purification. Further cleanup of the extracts was processed by a modified dispersive solid phase extraction procedure. Then, the purif i ed solutions were derivatized with slilyl reagents. The linearity of the method ranged from 1.5 to 100 μg/L for CAP, and from 6 to 400 μg/L for FF, with correlation coeff i cients ranging between 0.998 1 and 0.999 7. The limits of detection were 0.1–0.3 μg/kg. The recoveries of spiked CAP and FF with external calibration method at different concentration levels in different sample matrixes (crucian, blue crab, and Penaeus vannawei) were 82%–106%, 87%–111%, and 91%–98%, respectively, with relative standard deviations of 2.3%–4.9%, 2.4%–4.5%, and 1.4%–4.1% (n = 5), respectively. Thus it is concluded that this method can be successfully applied for the determination of choramphenicols (CAPs) in fishery products.

dispersive solid phase extraction; gas chromatography-electron capture detector; fisher products; choramphenicols

S859.84

A

1002-6630（2014）08-0231-05

10.7506/spkx1002-6630-201408046

2013-07-31

浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012F30021；2012F30026）；

浙江省“農(nóng)產(chǎn)品安全標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)”重點(diǎn)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2010R50028）；浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（LQ13C200004）作者簡介：胡紅美（1986—），女，工程師，碩士，研究方向?yàn)闈O業(yè)環(huán)境與水產(chǎn)品質(zhì)量安全。E-mail：huhm@zju.edu.cn

*通信作者：郭遠(yuǎn)明（1977—），男，高級工程師，碩士，研究方向?yàn)闈O業(yè)環(huán)境與水產(chǎn)品質(zhì)量安全。E-mail：yuanming_guo@126.com