馬曉斐，梁天佐，宋 煒，馮浩彬，張 巖,*

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定中草藥飲料中11 種有毒生物堿

馬曉斐1，梁天佐1，宋 煒2，馮浩彬1，張 巖1,*

（1.河北省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，河北 石家莊 050091；2.河北省食品藥品檢驗院，河北 石家莊 050011）

建立同時測定中草藥飲料中11 種有毒生物堿（烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、馬錢子堿、士的寧、秋水仙堿、喜樹堿、阿托品、東莨菪堿、毛果蕓香堿和鬼臼毒素）的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。試樣直接過0.22 μm濾膜，經(jīng)Kinetex C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.6 μm）分離后，在多反應(yīng)監(jiān)測模式下定性及定量分析。結(jié)果表明：11 種有毒生物堿在在其線性范圍內(nèi)與其峰面積線性關(guān)系良好（＞0.999 0），方法檢出限為0.05～0.5 μg/L，在低、中、高3個添加水平范圍內(nèi)的平均回收率為75.0%～88.4%，相對標準偏差均小于7.6%。該方法操作簡便、靈敏度高、重復(fù)性好、定性定量準確，適用于中草藥飲料中有毒生物堿的測定。

飲料；高效液相色譜；質(zhì)譜；有毒生物堿

含有毒生物堿的植物分布極其廣泛，在各科各屬中均有分布，它們能引起攝食者輕微的肝損傷，會出現(xiàn)發(fā)冷、出虛汗、乏力、面黃肌瘦、犯困等癥狀，嚴重時可能對神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)造成損害，甚至出現(xiàn)內(nèi)分泌失調(diào)等癥狀[1]。目前，因生物堿中毒死亡案例時有發(fā)生，嚴重危害消費者的身心健康[2]。

目前，越來越多的飲料中開始添加中草藥成分，提高飲品保健功效，逐漸成為消費者選擇產(chǎn)品的重要關(guān)注點。但是這些中草藥中除了有益于人體的天然成分外，可能還會引入對人體有害的生物堿類物質(zhì)，長期使用會給消費者的身體健康帶來極大傷害。

生物堿的檢測方法主要有高效液相色譜（high perforamance liquid chromatography，HPLC）法[3-6]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）法[7-8]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS-MS）法[9-25]。HPLC檢出限高，很多情況下不能滿足生物堿鑒定的需要，且僅以保留時間進行定性分析存在風(fēng)險，當目標物濃度較低時基質(zhì)干擾嚴重、選擇性差，易出現(xiàn)假陽性。GC-MS分析有毒生物堿則需要衍生化后才能進行分析，操作過程復(fù)雜。HPLC-MS-MS法同時具備液相色譜高效的在線分離能力和質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度的檢測能力，可以同時得到化合物的保留時間、分子質(zhì)量以及特征結(jié)構(gòu)碎片等豐富的信息，其多反應(yīng)監(jiān)測技術(shù)兼具有選擇離子掃描的靈敏度和二級質(zhì)譜的特征性，在痕量分析方面具有很大的優(yōu)勢。

目前生物堿的檢測主要針對血液等生物檢材中，對食品中有毒生物堿的研究較少，而且檢測項目單一、檢測方法靈敏度較低。目前未見對中草藥飲料中有毒生物堿的測定方法，本實驗建立了同時測定飲料中11 種有毒生物堿的HPLC-MS-MS檢測方法，方法操作簡單，結(jié)果穩(wěn)定可靠，可為監(jiān)管部門提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈（均為色譜純） 美國Fisher Scientific公司；甲酸、乙酸銨（均為優(yōu)級純） 美國Sigma-Aldrich公司；烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、馬錢子堿、士的寧、秋水仙堿、喜樹堿、阿托品、東莨菪堿、毛果蕓香堿、鬼臼毒素標準物質(zhì)（純度≥95%） 中國食品藥品檢定研究院；去離子水由Millipore公司超純水器制得。

1.2 儀器與設(shè)備

Shimadzu-20A液相色譜儀 日本島津公司；AB SCIEX Q TRAP 5500氣相色譜-質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源、Analyst 1.6軟件） 美國AB SCIEX公司；CT15RT高速冷凍離心機 上海天美公司；SK-1渦旋混勻器江蘇中大儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

樣品搖勻后取5mL于離心管中，10 000 r/min離心3 min，吸取1.0 mL經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，濾液供HPLCMS-MS測定。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Kinetex C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.6 μm）；流動相A為0.1%甲酸溶液（含10 mmol/L乙酸銨）；流動相B為乙腈；流速0.3 mL/min；梯度洗脫程序：0～2 min，10%B；2～6 min，10%～30%B；6～10 min，30%～40%B；10.1～15 min，10%B；柱溫35 ℃；進樣量2 μL。

1.3.3 質(zhì)譜條件

電噴霧電離源；正離子模式；多反應(yīng)監(jiān)測模式；離子源溫度500 ℃；霧化氣壓力0.7 MPa；氣簾氣壓力0.4 MPa；輔助氣壓力0.4 MPa；電噴霧電壓5500 V；11 種有毒生物堿的特征碎片離子對、去簇電壓和碰撞能量見表1。

表1 11種有毒生物堿檢測質(zhì)譜條件Table 1 MS-MS conditions for the detection of 11 poisonous alkaloids

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱的選擇及分離條件的優(yōu)化

對比了2 種色譜柱（Kinetex C18和Agilent Eclipse Plus-C18）對11 種有毒生物堿的分離效果。結(jié)果表明，使用Kinetex C18柱時11 種生物堿峰形良好，但烏頭堿和次烏頭堿沒有達到基線分離（圖1A），而使用Eclipse Plus-C18柱時，除以上2種目標物沒有分離外，阿托品和馬錢子堿也重合到一起，而且烏頭堿和次烏頭堿的峰形展寬，分叉（圖1B），最終實驗選擇Kinetex C18色譜柱。

圖1 Kinetex C18（A）和Agilent Eclipse Plus-C18（B）色譜柱的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms on Kinetex C18(A) and Agilent Eclipse Plus-C18(B)

本研究分別考察了甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.1%甲酸和0.1%甲酸（含10 mmol/L乙酸銨）-乙腈，0.1%甲酸（含10 mmol/L乙酸銨）-甲醇混合溶劑體系作為流動相對有毒生物堿的色譜行為和離子化程度的影響。結(jié)果表明，當流動相為乙腈-0.1%甲酸時，儀器信號響應(yīng)高，且柱壓明顯低于甲醇-0.1%甲酸，但是目標物的峰形寬，分叉。實驗將0.1%甲酸溶液中加入10 mmol/L乙酸銨后，峰形得到明顯改善，最終確定選用0.1%甲酸（含10 mmol/L乙酸銨）-乙腈作為流動相。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

11 種有毒生物堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)中，除鬼臼毒素外，都含有雜環(huán)原子，所以在正離子模式下易得到一個H+形成準分子離子峰[M+H]+，所以實驗選用正離子模式。分別將11種有毒生物堿儲備標準溶液用流動相配制為10ng/mL的標準溶液，用流動注射泵連續(xù)進樣方式進行質(zhì)譜條件的優(yōu)化。首先采用全掃方式，各標準物質(zhì)均可得到較高豐度的[M+H]+準分子離子峰。在確定母離子的基礎(chǔ)上選擇2個以上的子離子。采用子離子掃描方式對子離子及碰撞能進行優(yōu)化選擇，通過改變碰撞能值，使得母離子的強度占最大子離子強度的1/3左右時，同時優(yōu)化去簇電壓值，選擇能產(chǎn)生最高豐度子離子的碰撞能作為最佳碰撞能量，最終選定母離子與豐度較高，干擾較小的1對特征子離子進行定性分析，選擇其中響應(yīng)值高的作為定量離子。11種有毒生物堿的標準物質(zhì)總離子流圖見圖2。

圖2 11種有毒生物堿標準溶液的總離子流圖Fig.2 Positive ion electronspray ionization mass spectra of 11 poisonous alkaloids

2.3 線性范圍和方法檢出限

為消除樣品基質(zhì)效應(yīng)，實驗采用空白基質(zhì)匹配標準溶液法制備標準曲線。取陰性樣品按照樣品前處理方法操作，制備空白基質(zhì)溶液，將標準工作液用空白基質(zhì)溶液逐級稀釋得到質(zhì)量濃度為0.5、1、2、5、10、50、100μg/L的系列標準溶液，在選定的色譜條件和質(zhì)譜條件下進行測定。本實驗采用空白樣品加標法以不小于3倍信噪比確定檢出限，結(jié)果見表2。

表2 11種有毒生物堿的線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 2 Linear equations, correlation coefficients and limits of detection (LOD) for 11 poisonous alkaloids

2.4 方法的回收率和精密度

采用空白樣品加標的方法進行添加回收率和精密度實驗，在空白樣品中添加低、中、高3 個水平的標樣后，然后按1.3.1節(jié)方法進行操作，每個添加量平行測定6 次。同時配制標準系列溶液，計算回收率和相對標準偏差，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，在高、中、低3 個添加水平的平均回收率在75.0%～88.4%之間，相對標準偏差為4.2%～7.6%。表明本方法回收率穩(wěn)定，可滿足實際樣品的檢測要求。

表3 11種有毒生物堿的加標回收率和精密度（n=6）Table 3 Recoveries and precision (RSD) for 6 replicate determinations of 11 poisonous alkaloids (n=6)

2.5 實際樣品測定

按照本研究所建立的方法對市場上常見的10 種中草藥飲料飲料進行了測定，均未檢出有毒生物堿類藥物。

3 結(jié) 論

本方法中，樣品經(jīng)過濾后，采用HPLC-MS-MS可同時檢測中草藥飲料中11 種有毒生物堿類藥物（烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、馬錢子堿、士的寧、秋水仙堿、喜樹堿、阿托品、東莨菪堿、毛果蕓香堿和鬼臼毒素）含量的方法。本方法的回收率、檢出限和精密度等各項技術(shù)指標均符合要求，該方法具有操作簡便、檢出限低、準確度高、污染小的特點，在中草藥飲料中有毒生物堿類藥物含量的檢測與確證方面有著較高的實用價值和應(yīng)用前景。

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Simultaneous Determination of 11 Poisonous Alkaloids in Chinese Medicinal Herbal Beverages by Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

MA Xiao-fei1, LIANG Tian-zuo1, SONG Wei2, FENG Hao-bin1, ZHANG Yan1,*
(1. Hebei Institute of Food Quality Supervision Inspection and Research, Shijiazhuang 050091, China; 2. Hebei Provincial Institute for Food and Drug Control, Shijiazhuang 050011, China)

A method for the simultaneous determination of 11 poisonous alkaloids (aconitine, hypaconitine, mesaconitine, brucine, strychnine, colchicine, camptothecin, atropine, scopolamine, pilocarpine, and podophyllotoxin) in Chinese medicinal herbal beverages was developed by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS-MS). Samples were fi ltered through a 0.22 μm microporous membrane. Qualitative and quantitative analyses were carried out by mass spectrometry under the MRM mode after the chromatographic separation on a Kinetex C18(2.1 mm × 100 mm, 2.6 μm) column. All the 11 poisonous alkaloids showed a good linearity with correlation coeff i cients (r) no less than 0.999 0 within their linear ranges. The limits of detection for these poisonous alkaloids were in the range of 0.05 to 0.5 μg/kg. The mean recoveries at three spiked levels were 75.0%–88.4% and the relative standard deviations were less than 7.6%. This method is simple, sensitive, accurate and suitable for the simultaneous analysis of poisonous alkaloids in Chinese medicinal herbal beverages.

beverage; liquid chromatography; mass spectrometry; poisonous alkaloids

O657.63

A

1002-6630（2014）08-0226-05

10.7506/spkx1002-6630-201408045

2014-02-27

河北省科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計劃項目（12277122D）

馬曉斐（1984—），男，碩士，研究方向為食品中禁用物質(zhì)及藥物殘留分析。E-mail：xiaofeima1984@163.com

*通信作者：張巖（1979—），男，研究員，博士，研究方向為化學(xué)危險品安全性評價技術(shù)。E-mail：snowwinglv@126.com