謝 倩，王 威，陳清西

橄欖多酚含量測(cè)定方法的比較

謝 倩，王 威，陳清西*

（福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002）

采用酒石酸鐵法、福林酚試劑法和紫外分光光度法3 種方法測(cè)定橄欖多酚類物質(zhì)含量。結(jié)果表明：3 種方法檢出限及定量限的順序?yàn)椋鹤贤夥止夤舛确ǎ几Ａ址釉噭┓ǎ季剖徼F法，且3者存在顯著性差異（P＜0.05）。3 種方法回收率順序?yàn)椋壕剖徼F法＞福林酚試劑法＞紫外分光光度法，但差異不顯著（P＞0.05），這3 種方法都具有良好的重復(fù)性。利用福林酚試劑法與紫外分光光度法測(cè)得的多酚含量顯著高于酒石酸鐵法（P＜0.01），其中福林酚試劑法測(cè)得的多酚含量略高于紫外分光光度法，但差異不顯著（P＞0.05）。同時(shí)，各方法測(cè)得的多酚含量存在良好的線性關(guān)系。實(shí)驗(yàn)證明紫外分光光度法靈敏度高、重復(fù)性好，且操作簡單、快速、經(jīng)濟(jì)，是一種較理想的測(cè)定橄欖多酚的方法。

橄欖；多酚；酒石酸鐵法；福林酚試劑法；紫外分光光度法

酚類化合物是含有一個(gè)或多個(gè)羥基、擁有一個(gè)共同芳香環(huán)的化合物[1]。多酚類物質(zhì)是橄欖中的重要功效成分，橄欖的許多藥理作用及苦澀味都與其有關(guān)，具有抗癌、抗衰老、抗氧化、抗輻射、抑菌等功能[2-9]。近年來，橄欖多酚已得到越來越多的研究。目前，測(cè)定多酚的方法主要有酒石酸鐵法、福林酚試劑法、紫外分光光度法等[10-11]，如利用酒石酸鐵法測(cè)定橄欖[2]、茶[12]、棗核[13]中植物多酚的含量；利用福林酚試劑法測(cè)定橄欖[14]、桃[15]、茶[16]、鐵皮石斛[16]、蘋果[17]中植物多酚的含量；用紫外分光光度法測(cè)定冬棗[18]中植物多酚的含量。這3 種方法由于反應(yīng)原理不同，所測(cè)得的多酚含量有所差異，但目前還未見有關(guān)這3 種方法測(cè)定多酚含量的比較研究。因此，本實(shí)驗(yàn)以橄欖為材料，運(yùn)用這3 種方法分析其多酚含量，比較3 種方法測(cè)定結(jié)果的差異性，為多酚含量測(cè)定提供理論指導(dǎo)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

橄欖于2012年10月20日采于福建省閩侯縣上岐，露天栽培，6 個(gè)品種（系）作為供試材料，分別為‘馬坑22’、‘檀頭23’、‘唐舉3號(hào)’、‘本地實(shí)生’、‘馬坑2代’、‘馬坑16’。

硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、碳酸鈉、福林酚、乙醇、石油醚（均為分析純）、沒食子酸 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BS214D電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；AllegraTM64型高速冷凍離心機(jī) 美國Beckman Coulter公司；U-1810紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；FW177中草藥粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；KQ-600DE型數(shù)控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；LGJ-S24型冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多酚提取

選擇無畸形、無病蟲害的果實(shí)，以蒸餾水沖洗干凈并去核，真空干燥，干燥果肉用多功能粉碎機(jī)研磨成粉末，過40 目篩，于-40 ℃保存?zhèn)溆谩＿x擇‘馬坑22’作為多酚不同方法的比較研究。

參照林玉芳[2]的超聲輔助法。稱取0.5 g橄欖粉末，加入石油醚（30～60 ℃）脫脂、去除色素，然后加入40%乙醇，料液比1∶30（g/mL），并攪拌，超聲處理20 min，超聲功率300 W，取上清液，提取2 次，合并2 次提取液連同殘?jiān)谷腚x心管，常溫條件下10 000 r/min離心10 min，取上清液待測(cè)。

1.3.2 多酚含量測(cè)定

沒食子酸溶液配制：精確稱取沒食子酸500 mg，溶于雙蒸水，定容至100 mL作為母液，再分別吸取0.5、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 mL于25 mL容量瓶中，用雙蒸水定容，制備成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液。

酒石酸鐵法測(cè)定多酚含量：參照林玉芳[2]的方法進(jìn)行測(cè)定。準(zhǔn)確吸取160 μL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液，加入酒石酸鐵800 μL，加磷酸緩沖液（pH 7.5）至4 mL，用雙蒸水作參比，在540 nm波長處測(cè)其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定樣品的吸光度并計(jì)算其多酚含量，重復(fù)3次。

福林酚試劑法測(cè)定多酚含量：取上述沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL于10 mL容量瓶中，定容后制備成質(zhì)量濃度分別為0.01、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液。參照何志勇等[14]的方法進(jìn)行測(cè)定。準(zhǔn)確吸取1 mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液，加入到25 mL容量瓶中，加10 mL蒸餾水搖勻后，再加入1.5 mL福林酚試劑，充分搖勻30 s，靜置不超過8 min，加入6 mL 10% Na2CO3，混勻后加水定容，搖勻，然后在30 ℃避光反應(yīng)2 h，用雙蒸水作參比，于765 nm波長處測(cè)其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將橄欖多酚提取液稀釋20 倍后，測(cè)定其吸光度并計(jì)算多酚含量，重復(fù)3 次。

紫外分光光度法測(cè)定多酚含量：分別各取0.1 mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，定容后制備成質(zhì)量濃度分別為0.001、0.005、0.010、0.015、0.020、0.025 mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液，在190～450 nm波長處進(jìn)行光譜掃描，重復(fù)5 次，選取246 nm波長處的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將橄欖多酚提取液稀釋100 倍，測(cè)定其吸光度并計(jì)算多酚含量，重復(fù)3 次。

1.3.3 方法的檢出限和定量限

精確稱取0.5 g橄欖樣品12份，參照1.3.1節(jié)提取多酚，參照1.3.2節(jié)測(cè)定多酚含量。按式（1）、（2）計(jì)算檢出限CL與定量限CD[19-20]：

式中：k為置信因子，取值3；s為空白樣品吸光度的標(biāo)準(zhǔn)偏差；m、m’為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；k’為置信因子，取值10。

1.3.4 方法的精密度和加標(biāo)回收率

準(zhǔn)確稱取4 份相同橄欖樣品，1份作基準(zhǔn)，參照1.3.1節(jié)提取多酚，參照1.3.2節(jié)測(cè)定多酚含量。3份加入已知量的標(biāo)樣，平行測(cè)定6 次。

1.3.5 橄欖多酚含量計(jì)算

式中：C為提取液中多酚含量/（mg/mL）；Vt為提取液體積/mL；N為稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量/g。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007與SPSS 13.0軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 種測(cè)定方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線見表1。

表1 3 種多酚測(cè)定方法標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 1 Calibration curves for the determination of total phenolics with three different methods

2.2 檢出限和定量限

表2 檢出限和定量限Table 2 Detection limits and quantitation limits

由表2可知，3 種方法檢出限及定量限順序?yàn)椋鹤贤夥止夤舛确ǎ几Ａ址釉噭┓ǎ季剖徼F法，且3者存在顯著性差異（P＜0.05）。說明紫外分光光度法檢測(cè)橄欖多酚的靈敏度較高，其次為福林酚試劑法、酒石酸鐵法。

2.3 加標(biāo)回收率和精密度

表3 加標(biāo)回收和精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 3 Results of spiked recovery and precision tests (n = 6)

由表3可知，酒石酸鐵法的回收率在92.30%～97.43%之間，平均回收率為94.30%；福林酚試劑法的回收率在89.33%～95.33%之間，平均回收率為92.00%；紫外分光光度法的回收率在87.00%～94.67%之間，平均回收率為90.89%。3種方法回收率：酒石酸鐵法＞福林酚試劑法＞紫外分光光度法，但差異不顯著（P＞0.05）。

平均相對(duì)偏差分別為3.64%（酒石酸鐵法）、5.34%（福林酚試劑法）、1.61%（紫外分光光度法）。紫外分光光度法的重復(fù)性較好，其次為酒石酸鐵法、福林酚試劑法。

2.4 不同方法測(cè)定橄欖多酚含量

圖1 不同方法測(cè)定橄欖多酚含量（n=3）Fig.1 Determination of phenolics content in Chinese olive with different methods (n = 3)

由圖1可知，福林酚試劑法與紫外分光光度法的測(cè)定結(jié)果差異不顯著（P＞0.05），相較于福林酚試劑法，紫外分光光度計(jì)法測(cè)得的多酚含量平均下降0.360%。酒石酸鐵法測(cè)得的含量明顯低于福林酚試劑法與紫外分光光度法，分別平均下降了8.446%、8.087%，酒石酸鐵法與福林酚試劑法及紫外分光光度法測(cè)得的多酚含量存在極顯著的差異（P＜0.01）。對(duì)不同橄欖品種（品系）用這3 種方法測(cè)得的多酚含量進(jìn)行相關(guān)回歸分析，發(fā)現(xiàn)具有一定的相關(guān)回歸關(guān)系，說明3 種測(cè)定方法可行。

2.5 線性回歸分析結(jié)果

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

利用方差分析表做回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)，由表4可知，P值均小于0.05%，可認(rèn)為回歸系數(shù)不為零，3個(gè)回歸方程式均有意義。

表5 回歸系數(shù)分析Table 5 Regression coefficient analysis

由表5可知，福林酚試劑法與紫外分光光度法回歸系數(shù)的P值為0.000，因此認(rèn)為該回歸系數(shù)有顯著意義?；貧w方程為：y（福林酚試劑法）=-1.884+1.190x（紫外分光光度法），回歸系數(shù)0.950。

福林酚試劑法與酒石酸鐵法回歸系數(shù)的P值為0.000，因此認(rèn)為該回歸系數(shù)顯著有意義?；貧w方程為：y（福林酚試劑法）= 5.810+1.677x（酒石酸鐵法），回歸系數(shù)0.834，方程的擬合性較差。

紫外分光光度法與酒石酸鐵法回歸系數(shù)P值為0.000，因此認(rèn)為該回歸系數(shù)顯著有意義?；貧w方程為：y（紫外分光光度法）= 6.193+1.479x（酒石酸鐵法），回歸系數(shù)0.921。

綜上所述，福林酚試劑法與紫外分光光度計(jì)法、紫外分光光度計(jì)法與酒石酸鐵法均存在良好的線性關(guān)系。雖然福林酚試劑法與酒石酸鐵法的回歸方程及回歸系數(shù)有顯著意義，但其回歸系數(shù)較低、方程的擬合性較差。

3 討 論

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3 種方法的回收率中，酒石酸鐵法＞福林酚試劑法＞紫外分光光度法，但不存在顯著性差異（P＞0.05），其中紫外分光光度法較其他2 種方法的靈敏度更高、重復(fù)性較好，酒石酸鐵法的回收率、重復(fù)性均比福林酚試劑好，但福林酚試劑法的靈敏度比酒石酸鐵法高。因此認(rèn)為，紫外分光光度法是3 種方法中最佳方法。

采用3 種方法測(cè)定6 個(gè)橄欖品種（系）多酚含量，結(jié)果表明3種方法測(cè)定的多酚含量存在差異，可能是以下原因造成的：1）酒石酸鐵法是測(cè)多酚類物質(zhì)的總含量，是利用Fe2+與多酚類物質(zhì)絡(luò)合形成藍(lán)色物質(zhì)，在540 nm波長處有最大吸收峰[21]；福林酚試劑法是利用酚羥基被高價(jià)鎢氧化后形成藍(lán)色物質(zhì)，在765 nm波長處有最大吸收峰[21]的原理進(jìn)行測(cè)定；紫外分光光度法是根據(jù)酚類物質(zhì)在紫外區(qū)有吸收光譜的原理，直接通過光譜掃描測(cè)定多酚含量[22]。其中，紫外分光光度法測(cè)定的不僅是所有酚類物質(zhì)的含量，還包括帶有酚羥基基團(tuán)的物質(zhì)[19]；福林酚試劑法測(cè)得的除了多酚類物質(zhì)，也包括含有酚羥基基團(tuán)的物質(zhì)及具有還原能力的抗壞血酸[23]；此外，由于橄欖多酚類化合物組成的特異性，因此福林酚試劑法測(cè)得的多酚含量略高于紫外分光光度計(jì)法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也符合上述關(guān)系。酒石酸鐵法測(cè)得的僅是多酚類物質(zhì)，且不同多酚類化合物對(duì)酒石酸鐵的呈色能力不同[24]，根據(jù)張妙芬[25]報(bào)道，酒石酸鐵與酯型兒茶素呈色較強(qiáng)，與非酯型兒茶素呈色較弱。橄欖中多酚類化合物多樣且不同多酚化合物間含量差異較大，因此測(cè)得的結(jié)果會(huì)有偏差，使酒石酸法測(cè)得的結(jié)果低于其他2 種方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合上述關(guān)系。2）可能與不同測(cè)定方法所對(duì)應(yīng)的最佳提取工藝條件有關(guān)。本研究中3 種測(cè)定方法均采用相同的提取方法，但李偉等[26]對(duì)余甘子多酚類物質(zhì)的提取工藝及測(cè)定方法比較中指出，不同測(cè)定方法的最佳提取工藝不同，其測(cè)定結(jié)果也有所不同。

目前，福林酚試劑法、紫外分光光度法是常用的多酚含量測(cè)定方法，酒石酸鐵法則在茶多酚測(cè)定上應(yīng)用的較多。本實(shí)驗(yàn)比較了這3 種方法，認(rèn)為紫外分光光度法為較佳方法，該方法靈敏度更高、重復(fù)性較好，且操作簡單、快速、經(jīng)濟(jì)，是一種較理想的測(cè)橄欖多酚含量的方法。

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Comparative Study on Three Different Methods for the Determination of Total Phenolics in Chinese Olive

XIE Qian, WANG Wei, CHEN Qing-xi*
(College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China)

Three analytical methods (ferrous tartrate colorimetry, Folin-phenol reagent method and UV spectrophotometry) were compared for the determination of total phenolics in Chinese olive in this study. The results showed the three methods followed the decreasing order: UV spectrophotometry ＜ Folin-phenol reagent method ＜ ferrous tartrate colorimetry by detection limit and quantitation limit with a significant difference among them (P ＜ 0.05), and ferrous tartrate colorimetry ＞ Folin-phenol reagent method ＞ UV spectrophotometry by recovery with the difference being not significant. All these three methods had good repeatability. The polyphenol content determined by Folin-phenol reagent method and UV spectrophotometry was significantly higher than that determined by ferrous tartrate colorimetry (P ＜ 0.01), and the polyphenol content determined by Folin-phenol reagent method was slightly higher than that determined by UV spectrophotometry, with the difference being not significant (P ＞ 0.05). At the same time, there was a good linear relationship of total polyphenol contents determined by two of them. In comparison two other methods, UV spectrophotometry proved more suitable for the determination of total phenolics in Chinese olive, thanks to its high sensitivity, good repeatability, simplicity, rapidity, accuracy and economy.

Chinese olive; phenolics; ferrous tartrate colorimetry; Folin-phenol reagent method; UV spectrophotometry

S667.5

A

1002-6630（2014）08-0204-04

10.7506/spkx1002-6630-201408040

2013-07-04

福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2012D085）；“十一五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2007BAD07B01）；福州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2009-N-55）

謝倩（1987—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)楣麡渖砼c生態(tài)。E-mail：xieq0416@163.com

*通信作者：陳清西（1964—），男，教授，博士，研究方向?yàn)閳@藝植物栽培生理。E-mail：cqx0246@163.com