李建龍，潘道東，朱浩嘉，顧愿愿，趙紫微，朱珊珊

基于納米金電化學免疫傳感器測定牛奶中的青霉素G

李建龍，潘道東*，朱浩嘉，顧愿愿，趙紫微，朱珊珊

（寧波大學海洋學院，浙江 寧波 315211）

利用吸附法將青霉素G抗體固定于納米金修飾的玻碳電極表面，制備用于檢測青霉素G的電化學免疫傳感器，建立高度靈敏的一步直接電化學免疫法。納米金的強吸附和導電作用，提高了青霉素G抗體的固定量和電化學靈敏度。在優(yōu)化條件下，該傳感器的響應電流與青霉素質量濃度的對數(shù)在0.04～40.00 ng/mL范圍內呈良好的線性關系，相關系數(shù)為0.988 4，檢測限為2.49 ng/mL，該法成功的實現(xiàn)了對牛奶中青霉素G的檢測。

納米金；青霉素；電化學免疫傳感器

青霉素和一些β-內酰胺類抗生素，經常用于獸醫(yī)、食品和藥物治療中去預防細菌感染，在奶牛中常常要加入抗生素去治療牛乳腺炎等疾病，然而由于人們的不合理使用，會導致其奶中抗生素大量殘留，人們長期飲用抗生素超標的牛奶，會增加體內細菌的耐藥性，甚至可能會引起一部分過敏反應[1-4]，因此，對奶牛中的青霉素的殘留檢測顯得非常重要。歐盟法規(guī)508/1099明確規(guī)定在食品中抗生素的最大殘留量是4 ng/mL[5]。目前，常用的青霉素檢測方法有：微生物法[6-8]、高效液相色譜法[9-11]、免疫熒光法[12]等，但這些方法有一個共同的缺點就是：費時費力、價格昂貴或者需要專業(yè)的技術人員操作。近年來電化學免疫法既結合了傳統(tǒng)的抗原抗體的特異性，又結合了電化學的高度靈敏性及其快速響應性[13]，從而在食品[14]、醫(yī)學方面受到了廣泛的應用。

本實驗通過在玻碳電極（glassy carbon electrode，GCE）表面吸附納米金從而間接吸附青霉素抗體制成了青霉素電化學傳感器，創(chuàng)新地將納米金的強吸附性[15]和抗原抗體的特異反應結合起來，具有操作簡單、響應時間短、穩(wěn)定性好等優(yōu)點。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

無抗生素牛奶 市售。

0.2 mol/L pH 7.0磷酸緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）溶液（含有8 g NaCl、0.2 g KCl、1.15 g Na2HPO4·12H2O和0.2 g KH2PO4）、鐵氰化鉀、青霉素抗體（Ab*）2 mg 北京奧博森生物技術有限公司；牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA） 美國Sigma公司；氯金酸1 g 國藥集團化學試劑有限公司；所有實驗用水均為超純水。

CHI660B電化學工作站（實驗采用三電極：玻碳電極為工作電極；飽和甘汞電極為參比電極（以下實驗電位均相對于飽和甘汞電極）；大面積鉑絲為對電極） 上海辰華儀器公司；MilliQ-型水純化系統(tǒng) 美國Millipore公司；SB5200雙頻超聲波清洗機 寧波新芝生物科技有限公司；移液器（規(guī)格1 mL、500 ?L和10 ?L等） 德國Eppendorf公司；青霉素粉末（用水配制成1 000 ng/mL溶液） 美國Amresco公司；CS501-SP型超級數(shù)顯恒溫器 重慶四達實驗儀器有限公司；DHG-9108A型電熱恒溫鼓風干燥機 上海精密實驗設備有限公司；H2500-R-2型離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 GCE/Au/Ab*青霉素傳感器的制備

參照文獻[16-19]的方法處理電極：玻碳電極依次用0.3、0.05 ?m的Al2O3粉末拋光至鏡面，然后分別用超純水、無水乙醇分別超聲5 min，之后用氮氣吹干。將經過預處理的電極浸入到0.1% HAuCl4溶液中，然后在0.5～-0.5 V工作電位下，掃描20圈，之后用超純水多次洗滌并氮氣吹干。將電極浸入一定質量濃度的青霉素抗體溶液中6 h，取出后洗滌干凈并氮氣吹干，最后在電極表面滴加20 ?L 5%的BSA 1 h以封閉其活性位點從而減少非特異性吸附，從而制得了GCE/Au/Ab*青霉素免疫傳感器，最后用超純水洗凈，放置于4 ℃冰箱中備用。

參考武海[20]的方法稍作改動對牛奶樣品進行除脂：在牛奶樣品中加入不同量的青霉素，然后加入適量硫酸銨(6 g/20 mL牛奶），于4 ℃以8 000 r/min離心30 min，濾取其上清液用于傳感器測定。

1.2.2 循環(huán)伏安法測試

將制備的傳感器用超純水洗凈，氮氣吹干，30 ℃時置于100 ?L的青霉素標準溶液中，30 min后取出充分沖洗干凈，在含有0.2 mol/L PBS（含5 mmol/L K3Fe(CN)6和0.1 mol/L KCl）溶液中進行循環(huán)伏安法測試，以上過程如圖1所示。

圖1 免疫傳感器的組裝和檢測Fig.1 Procedures for the assembly and detection of the immunosensor

2 結果與分析

2.1 青霉素傳感器的電化學行為

傳感器在0.2 mol/L pH 7.0 PBS（含5 mmol/L K3Fe(CN)6）溶液不同掃描速率下在中的循環(huán)伏安圖，見圖2。由圖2可知，峰電流之比Ipa/Ipc‘1，峰電位在低掃描速率條件下基本不變，且可逆性良好。氧化峰和還原峰電流在20～100 mV/s掃描速率時呈正比（圖2插圖），相關系數(shù)為0.994，這表明此電極反應呈現(xiàn)表面控制氧化還原過程。

圖2 傳感器在0.2 mol/L pH 7.0 PBS（含5 mmol/L K3Fe(CN)6）溶液中不同掃描速率下的CV圖及其峰電流與掃面速率的關系圖Fig.2 Cyclic voltammogram of the immunosensor in 0.2 mol/L pH 7.0 PBS solution containing 5 mmol/L K3Fe(CN)6at different scanning rates, inset: Plot of peak current vs. scan rate: 20, 30, 40, 50, 60, 80, 90 and 100 mV/s

2.2 傳感器對青霉素抗原的響應

圖3 不同修飾電極在K3Fe(CN)6中的響應Fig.3 Response of different modified electrodes in pH 7.0 PBS solution containing 0.1 mol/L KCl and 5 mmol/L K3Fe(CN)6

由圖3可見，曲線a是裸玻碳電極的CV圖，可以看出在0.274、0.209 V有一對可逆的氧化還原峰，當電極上沉積金之后，還原峰和氧化峰的電流明顯偏大，這是由于納米金粒子的強導電性（曲線b），當電極上結合青霉素抗體時，還原峰電流隨之變小，同時也說明了青霉素抗體成功地吸附在納米金電極表面（曲線c），當電極用BSA溫育除去非特異性吸附后電流進一步減?。ㄇ€d），因為BSA為大分子物質，會阻礙鐵氰化鉀的氧化還原，當電極溫育0.6 ng/mL青霉素抗原后，電流明顯減小（曲線e），說明抗原抗體形成了免疫復合物，阻礙了電子傳輸，導致電流進一步下降[21]，因此說明傳感器對青霉素抗原具有較好的免疫性響應。

2.3 影響傳感器的因素

2.3.1 pH值的影響

溶液pH值影響青霉素酶的活性，圖4研究了不同pH值條件下溫育抗原前后的電流變化，當pH值在5.0～7.0變化時，傳感器的電流變化隨著緩沖液pH值的增大而增大，隨后在pH 7.0～8.0開始下降，在pH 7.0時候變化最大，這可能是因為青霉素抗體的活性隨著pH值的增大而增強，抗原抗體形成的復合物越穩(wěn)定，對電子的的傳遞阻礙作用越明顯，因此電流變化相應增大，但當pH值進一步增加時，青霉素酶可能逐漸失活，因此電流變化逐漸變小。綜上實驗選擇pH 7.0。

圖4 pH值對免疫傳感器的影響Fig.4 Effect of pH on CV peak current in PBS solution containing 0.1 mol/L KCl and 5 mmol/L K3Fe(CN)6

2.3.2 溫育溫度的影響

圖5 溫度對免疫傳感器的影響Fig.5 Effect of temperature on CV peak current in pH 7.0 PBS solution containing 0.1 mol/L KCl and 5 mmol/L K3Fe(CN)6

由圖5可見，在溫度10～30 ℃范圍內，傳感器的響應電流變化逐漸增大，在30 ℃達到最大值，在30～40 ℃時候，電流變化變小，這是因抗體酶隨著溫度的升高而活性增強，但是高溫又會引起蛋白質的變性失活，因此實驗應該選擇30 ℃。

2.3.3 溫育時間的影響

由圖6可知，在10～30 min時傳感器的響應電流隨時間的升高而減小，在30 min之后電流基本變化不大，這是因為電極表面形成的免疫復合物阻礙了K3Fe(CN)6的電子傳遞因此電流減小，在30 min時電極上的抗體吸附抗原已經達到飽和因此電流基本變化不大。綜上，所以實驗選擇溫育最佳時間為30 min。

圖6 溫育時間對免疫傳感器的影響Fig.6 Effect of incubation time on CV peak current in pH 7.0 PBS solution containing 0.1 mol/L KCl and 5 mmol/L K3Fe(CN)6and 0.6 ng/mL penicillin

2.4 傳感器對牛奶中青霉素抗原的響應

圖7 免疫傳感器的工作曲線Fig.7 Decrease in reductive peak current with increasing penicillin concentration in milk in the range of 0.00-40.00 ng/mL

圖8 免疫傳感器對青霉素質量濃度對數(shù)的線性關系圖Fig.8 Linear relationship between reductive peak current and logarithmic penicillin concentration in the range of 0.04-40.00 ng/mL

由于牛奶中的青霉素抗原與電極表面的青霉素抗體形成了抗原抗體免疫復合物，從而阻礙了電子傳輸，因此會導致響應峰電流減小，以還原峰電流對青霉素質量濃度作圖，從而實現(xiàn)了對青霉素的痕量檢測。由圖7、8可以看出，當青霉素質量濃度在0.04～40.00 ng/mL范圍內，傳感器對青霉素質量濃度的對數(shù)有良好的線性關系，其中電流改變量ΔI=3.300 2 lg（c（Ab*）/（ng/mL））+26.247，相關系數(shù)為0.988 4，檢測限為2.49 ng/mL，低于歐盟的4 ng/mL。這是因為在一定范圍內電極表面積較小，抗體固載量較小，牛奶中有其他物質的干擾，另外形成的抗原抗體復合物可能阻礙了進一步與抗原的結合，因此在較高的范圍內靈敏度較低。

2.5 重復性和穩(wěn)定性

分別采取同一支電極測定不同質量濃度的青霉素標液和同一批制備的6支電極測定同一質量濃度的青霉素標液，測定其傳感器的重復性。結果表明，傳感器的分析內相對標準偏差小于4%，傳感器的分析間相對標準偏差小于8%，說明此傳感器具有較好的重復性。

另外，將制備的傳感器保存于4 ℃的冰箱中，20 d后測定2 ng/mL的青霉素，響應電流僅僅下降了6%，說明此傳感器具有較好的穩(wěn)定性。

2.6 特異性

在PBS溶液中加入相同質量濃度的青霉素和其他抗生素，分別為氨芐青霉素、左氧氟沙星、羅紅霉素、克林霉素、氟康唑對傳感器的特異性進行了測定。結果顯示上述添加的其他物質對青霉素的檢測影響比較?。▓D9），由此說明傳感器具有較好的特異性。

圖9 免疫傳感器的特異性Fig.9 Specificity of the enzyme immunosensor

2.7 回收率的測定

在牛奶樣品中分別添加1、2、3 ng/mL的青霉素，經鹽析處理后用所制備的傳感器和ELISA法分別對樣品進行檢測，其測定結果如表1所示。由表1可知，此方法和ELISA測定的結果沒有明顯差異，說明此傳感器可以實現(xiàn)對實際樣品中青霉素的檢測。

表1 牛奶中青霉素的檢測結果（n=4）Table 1 Comparison of the results obtained by the method and ELISA for the determination of penicillin in milk (n = 4)

表1 牛奶中青霉素的檢測結果（n=4）Table 1 Comparison of the results obtained by the method and ELISA for the determination of penicillin in milk (n = 4)

樣品青霉素含量/（ng/mL）本法RSD/%本法回收率/%本法ELISA法1 0.960.953.2096.00 2 1.941.963.4097.00 3 2.902.934.4296.67

3 結 論

本實驗通過在玻碳電極表面鍍金，再吸附一定量的青霉素抗體，從而制備了電流型電化學免疫傳感器，通過測量電流變化從而實現(xiàn)青霉素的定量檢測。該傳感器既具有抗原抗體的特異性和高效性，又具有電化學的高度靈敏性和快速響應性。通過和ELISA法比較可知，其結果比ELISA的結果相差較小，但是該傳感器具有制備簡單、穩(wěn)定性強、靈敏度高、反應時間短等優(yōu)點，從而能夠滿足對牛奶中微量青霉素的快速檢測要求。

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Determination of Penicillin G in Milk by Gold Nanoparticles Based Electrochemical Immunosensor

LI Jian-long, PAN Dao-dong*, ZHU Hao-jia, GU Yuan-yuan, ZHAO Zi-wei, ZHU Shan-shan
(School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

An amperometric immunosensor was fabricated by co-immobilizing penicillin G polyclonal antibody (Ab*) on the surface of a gold nanoparticle modified glassy carbon electrode through electrostatic adsorption. A highly sensitive one-step direct electrochemical immunoassay was established due to the strong adsorption and conductive capacity of gold nanoparticles, thus raising the amount of fixed penicillin G antibody and electrochemical sensitivity. Under optimized conditions, the current response of the sensor showed a good linear relationship with logarithmic penicillin concentration in the range of 0.04-40.00 ng/mL with a correlation coefficient of 0.988 4 and the detection limit was 2.49 ng/mL. The method was able to detect penicillin in milk successfully.

gold nanoparticles; penicillin; electrochemical immunesensors

TS201.2

A

1002-6630（2014）08-0111-04

10.7506/spkx1002-6630-201408021

2013-05-15

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAK08B01）；寧波市創(chuàng)新團隊項目（2012B82017）；

寧波市人事局人才基金項目（ZX2012000380）

李建龍（1988—），男，碩士研究生，研究方向為食品安全與檢測。E-mail：lijianlong142733@163.com

*通信作者：潘道東（1964—），男，教授，博士，研究方向為畜產品加工及質量控制技術。E-mail：daodongpan@163.com