鄭冬冬，畢旺來，王宏勛，劉志國，丁洪波，李 睿,3,*

（1.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；3.農(nóng)產(chǎn)品加工湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心， 湖北 武漢 430023）

武漢肉類食品中大腸桿菌O157∶H7分離株stx亞型和毒力特征分析

鄭冬冬1，畢旺來1，王宏勛2，劉志國1，丁洪波1，李 睿1,3,*

（1.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；3.農(nóng)產(chǎn)品加工湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心， 湖北 武漢 430023）

從22 家市場銷售的117 份肉類食品中分離出4 株大腸桿菌O157∶H7菌株，經(jīng)PCR檢測這4 株菌的stx、hly、eae毒力基因均為陽性。采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）法對這4 株菌的stx亞型進行鑒定。3 株菌同時攜帶stx1、stx2基因，且均為stx1a、stx2a亞型。菌株 EC5.11僅攜帶stx2基因，但在所有的stx2分型PCR反應(yīng)中都為陰性。用PCR擴增該菌株stx2基因全長并克隆測序，序列分析結(jié)果表明EC5.11志賀毒素基因為stx2c亞型。采用Vero細胞毒性實驗檢測這4 株菌產(chǎn)志賀毒素的狀況，結(jié)果顯示這些菌株都具有一定的Vero細胞毒性。

大腸桿菌O157∶H7；志賀毒素；stx亞型；Vero細胞毒性

腸出血性大腸桿菌（enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC）O157∶H7是一類十分重要的食源性致病菌，可引起胃腸道以及全身性的疾病，如出血性腸炎（haemorrhagic colitis，HC）和溶血性尿毒綜合征（haemolytic-uraemic syndrome，HUS)，嚴重者致人死亡[1]。自1983年美國Riley等[2]首次報道腸出血性大腸桿菌O157∶H7以來，世界范圍內(nèi)發(fā)生了多起由O157∶H7引起的散發(fā)和暴發(fā)流行性病例，且最近幾年呈增多趨勢[3]。

腸出血性大腸桿菌O157∶H7最主要的毒力因子是志賀毒素（Shiga-toxin，Stx），因為能使Vero細胞發(fā)生病變，所以也稱為Vero毒素[4]。志賀毒素包括Stx1和Stx2兩種類型，由整合到O157基因組中的原噬菌體上的stx基因編碼。Stx1和Stx2在核苷酸和氨基酸序列上有60%的同源性，但兩者在免疫上沒有交叉反應(yīng)[5]。有研究表明，只產(chǎn)生Stx2毒素的菌株比只產(chǎn)生Stx1毒素或同時產(chǎn)生Stx1、Stx2兩種毒素的菌株毒力更強[6]。根據(jù)核苷酸序列的不同，stx1和stx2基因又可以分為多個亞型。stx1可分為stx1a、stx1b和stx1c 3 個亞型[7]。stx2核苷酸序列變化大，共分為7 個亞型，但亞型命名較混亂。本研究采用第7屆產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌傳染病研討會上的提議，將stx2的亞型命名為stx2a、stx2b、stx2c、stx2d、stx2e、stx2f、stx2g[8]。不同stx亞型菌株的生物學(xué)特性，如對宿主受體的黏附力、細胞毒性、對動物的致病性等都有很大差異。已有大量報道稱stx2a、stx2b、stx2c、stx2d可引起人患病[9]。stx2e主要從患水腫豬肉中分離得到[10]，從患者體中分離出來的情況極少[11-12]。stx2f最初從野鴿中分離得到[13]，但最近有報道稱，攜帶stx2f基因的腸出血性大腸桿菌也能使人致病[14]。從牛中分離出一株大腸桿菌O2∶H25，攜帶有stx2g基因，與stx2a、stx2c在核苷酸序列上有很高的同源性[15]。定期對大腸桿菌O157∶H7菌株stx亞型進行跟蹤研究，不僅可以對其毒力和流行狀況進行評估，也利于闡釋該類致病菌的致病機理。

本研究于2013年5—9月期間，從武漢市22 家菜場采集肉類樣品117 份，分離到4 株攜帶stx毒力基因的大腸桿菌O157∶H7菌株，并對這4 株菌的毒力狀況和stx亞型進行分析，為武漢市流行病學(xué)監(jiān)測和食品安全防控工作提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腸出血性大腸桿菌O157∶H7 EC5.11、EC6.8、EC9.10從牛肉中分離得到；腸出血性大腸桿菌O157∶H7 EC9.12從豬肉中分離得到；大腸桿菌DH5α 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；腸出血性大腸桿菌O157∶H7臨床株EC150由日本九州大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院Miyamoto實驗室贈送。

pGEM-T Easy載體 美國Promega公司；DNA提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司；酶聯(lián)免疫反 應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物純化試劑盒 美國Omega Bio-Tek公司；氨芐青霉素、X-Gal、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）、引物合成 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；DNA Marker、Ex Taq PCR試劑盒、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ等 日本Takara公司；RPMI 1640細胞培養(yǎng)液、胰蛋白酶 武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Nichipet EX-Plus微量移液槍 日本立洋公司；CF15R立式冷凍離心機 日本Hitachi公司；5424R臺式冷凍高速離心機 德國Eppendorf公司；Tgradient PCR儀德國Biometra公司；DYY-8C電泳儀、DYCP-31D電泳槽北京市六一儀器廠；GBox-HR-E-M凝膠成像儀 英國Syngene公司；IX2-SL倒置顯微鏡 日本Olympus公司；NU-5500E二氧化碳培養(yǎng)箱 美國Nuaire公司。

1.3 方法

1.3.1 eae、hly毒力基因的鑒定

將4 株菌接種到LB培養(yǎng)基中過 夜培養(yǎng)，使用TIANGEN試劑盒提取細菌基因組DNA作為PCR模板。PCR擴增的引物及產(chǎn)物大小參照文獻[16]。PCR擴增反應(yīng)體系：2.5 μL 10×buffer，2.0 μL 2.5 mmol/L dNTP，濃度為10 μmol/L的上下游引物各0.5 μL，rTaq酶0.2 μL，DNA模板1.5 μL，補足滅菌三蒸水至25 μL。PCR擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。無菌水作為陰性對照。

1.3.2 stx亞型鑒定

stx亞型鑒定PCR擴增反應(yīng)體系：2.5 μL 10×buffer，2.0 μL 2.5 mmol/L dNTP，濃度為10 μmol/L的上下游引物各0.5 μL，rTaq酶0.2 μL，DNA模板1.5 μL，補足滅菌三蒸水至25 μL。PCR擴增的特異性引物及條件參考文獻[17]。

1.3.3 菌株EC5.11 stx2基因全長擴增與克隆測序

使用P r i m e r 5設(shè)計擴增s t x 2基因全長的引物，上游引物（5’—3’）：AT G A A G T G TAT ATTATTTAAATG GGTA，下游引物（5’—3’）：TCAGTCATTATTAAACTGCACTT，擴增產(chǎn)物大小為1 241 bp。PCR擴增反應(yīng)體系：2.5 μL 10×buffer，2.0 μ L 2.5 m m o l/L d N T P，濃度為1 0 μ m o l/L的上下游引物各0.5 μL，rTaq酶0.2 μL，DNA模板1.5 μL，補足滅菌三蒸水至25 μL。PCR擴增程序：95℃預(yù)變性1 min；95℃變性15 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，共40個循環(huán)；72℃延伸4 min。無菌水做為陰性對照。

PCR產(chǎn)物用Omega Cycle-Pure Kit純化試劑盒純化后，與pGEM-TEasy載體酶連，構(gòu)建重組子，熱擊轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞DH5α中。然后涂布含IPTG/X-Gal和氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，37℃過夜培養(yǎng)。藍白斑篩選陽性重組子，將陽性菌落接種于添加有氨芐青霉素的LB中，37℃搖床過夜培養(yǎng)。使用Omega質(zhì)粒提取試劑盒提取重組菌質(zhì)粒，EcoRⅠ酶切后電泳驗證。將驗證正確的重組質(zhì)粒送到生工生物工程（上海）股份有限公司武漢分公司測序。

1.3.4 序列比對分析

雙向測序得到菌株EC5.11 stx2基因序列，采用軟件DNAStar拼接，并去除多余的克隆載體序列，得到完整的stx2基因序列。然后把序列提交到NCBI GenBank網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov），并進行BLAST比對。

1.3.5 志賀毒素的檢測

將腸出血性大腸桿菌O157∶H7 EC5.11、EC6.8、EC9.10、EC9.12涂布接種于腦心浸出液瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)16～20 h。用接種環(huán)刮取培養(yǎng)基表面三分之一平板大小的菌泥，懸浮于1 mL多粘菌素B溶液中。37 ℃保溫30 min，每5～10 min振蕩1 次。將菌液室溫條件下900×g離心15 min，取上清用0.22 μm濾膜過濾，即為Vero細胞毒性實驗樣品。

將Vero細胞用RPMI 1640（含10%胎牛血清）培養(yǎng)基培養(yǎng)4～5代，至細胞形態(tài)大小比較均勻。收集對數(shù)期Vero細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，向96孔板中加入100 μL細胞懸液，使待測細胞密度約為10 000個每孔。5% CO2、37 ℃孵育24 h。然后向每孔中加入100 μL梯度稀釋的待檢樣品，并設(shè)未經(jīng)樣品液處理的Vero細胞孔和普通大腸桿菌處理的Vero細胞孔作對照。37 ℃孵育48 h后，使用2%磷酸緩沖液配制的福爾馬林處理1 min，用無菌水洗滌，用0.1%結(jié)晶紫染色10 min，無菌水洗滌，將平板自然風(fēng)干，在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 hly、eae毒力基因的鑒定

腸出血性大腸桿菌O157∶H7菌株經(jīng)PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳檢測，產(chǎn)物大小與預(yù)期符合（圖1）。電泳結(jié)果表明4株菌都攜帶hly、eae毒力基因。

圖1 hly基因（A）、eae基因（B）擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification products of hly gene (A) and eae gene (B)

2.2 stx亞型鑒定

VT1/VT2試劑盒檢測結(jié)果表明，腸出血性大腸桿菌O157∶H7 EC6.8、EC9.10和EC9.12均同時攜帶stx1和stx2基因，而菌株EC5.11只攜帶stx2基因（圖片未附）。隨后對4 株菌的stx亞型進行PCR鑒定，EC6.8、EC9.10和EC9.12三株菌均能用stx1a和stx2a的分型引物擴增出目的條帶，擴增產(chǎn)物和預(yù)期大小符合，電泳結(jié)果見圖2。而使用其他分型引物時，EC6.8、EC9.10和EC9.12均沒有PCR擴增產(chǎn)物。以上結(jié)果顯示EC6.8、EC9.10和EC9.12攜帶的stx基因?qū)儆趕tx1a和stx2a亞型。

圖2 stx1a亞型（A）、stx2a亞型（B）PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification products of stx1a (A) and stx2a (B) genotypes

2.3 stx2基因全長擴增與克隆

圖3 菌株EC5.11 stx2基因全長擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification products of entire stx2 gene from strain EC 5.11

菌株EC5.11在所有stx亞型PCR反應(yīng)中都無擴增產(chǎn)物，因此設(shè)計了引物擴增其stx2基因全長。經(jīng)過PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳檢測，所得產(chǎn)物與預(yù)期大小相符合，結(jié)果見圖3。

EC5.11菌株P(guān)CR產(chǎn)物經(jīng)純化回收后進行克隆，提取質(zhì)粒、酶切后用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。重組質(zhì)粒大小約為4 300 bp，同時酶切產(chǎn)物在3 000 bp和1241 bp附近可見到目的條帶，表明已經(jīng)克隆出stx2基因（圖4）。

圖4 重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.4 Agarose gel electrophoresis of restriction enzymatic digestion products of recombinant plasmid

2.4 EC5.11 stx2基因測序與分析

將測得的重組質(zhì)粒的序列拼接，得到完整的stx2基因核苷酸序列。將序列上傳到NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中，序列號為KJ622354，并進行BLAST比對。結(jié)果表明，EC5.11菌株與Strauch等[18]提交的stx2c噬菌體2851（序列號：FM180578.1）stx2基因序列有100%的相似性。因此可判斷，EC5.11志賀毒素基因應(yīng)為stx2c亞型。

2.5 志賀毒素測定

Vero細胞毒性實驗中，由4 株菌制成的樣品液經(jīng)過梯度稀釋并處理Vero細胞后，在一定濃度范圍內(nèi)，細菌濾液對Vero細胞有明顯的毒害作用。Vero細胞產(chǎn)生病變，不能良好的貼壁生長，染色后Vero細胞孔中殘留的細胞數(shù)量很少。而對照孔Vero細胞生長良好，能貼壁。Vero細胞毒性實驗表明，分離到的4株菌都能產(chǎn)生志賀毒素。

3 結(jié) 論

腸出血性大腸桿菌O157∶H7的極大危害性已引起人們的重視，我國在O157∶H7的檢測和防控方面已作出了重大努力。但目前武漢地區(qū)零售食品O157∶H7的分布、分離、生物學(xué)特征等相關(guān)報道仍較少，分離到的O157∶H7菌株攜帶毒力基因的則更少。龍一兵等[19]首次從武漢地區(qū)牛糞、豬糞標(biāo)本中分離到8 株O157∶H7，用PCR的方法對菌株的eae、stx、hly基因進行檢測，結(jié)果顯示都為陰性，說明這8 株菌都不具有這3種毒力基因。2003年，余濱等[20]從3個宿主動物監(jiān)測點共采集奶牛、豬、雞的糞便標(biāo)本318份，檢出8份大腸桿菌O157，監(jiān)測生豬肉、生牛肉、羊肉、蔬菜、海產(chǎn)品等99 份食品樣品，從生豬肉中檢出1株大腸桿菌O157，經(jīng)檢測這9 株菌H抗原均為陰性，且不攜帶eae、stx等毒力基因。本研究從武漢市售肉類食品中分離到4 株攜帶stx基因的O157∶H7菌株，經(jīng)檢測這4株菌同時攜帶stx、hly、eae毒力基因，通過Vero細胞毒性實驗，證實4 株菌都能產(chǎn)志賀毒素。EC5.11菌株攜帶的志賀毒素基因為stx2c亞型。研究表明，不同亞型的菌株致病力也不同。Stx2c亞型引起HUS等嚴重疾病的幾率比其他志賀毒素亞型的要高[21]。

從初始武漢檢出的O157菌株不含eae、stx、hly毒力基因，到3種毒力基因都存在，且檢出stx2c基因亞型，說明武漢市O157∶H7菌株流行狀況和毒力狀況發(fā)生了變化，應(yīng)引起重視。各地都曾報道檢出部分腸出血性大腸桿菌O157∶H7菌株，它們攜帶stx基因，但不能產(chǎn)生志賀毒素[22]。這類腸出血性大腸桿菌毒力較弱，對人類健康威脅較小。但本研究從零售肉類中分離出產(chǎn)志賀毒素的O157∶H7，預(yù)示武漢市腸出血性大腸桿菌O157∶H7在人群中有流行的可能性，應(yīng)加強對市場零售肉類食品的監(jiān)控，并密切關(guān)注大腸桿菌O157∶H7毒力的變化。

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stx Genotypes and Virulence Characteristics of E. coli O157:H7 Strains Isolated from Meat Products Commercialized in Wuhan

ZHENG Dong-dong1, BI Wang-lai1, WANG Hong-xun2, LIU Zhi-guo1, DING Hong-bo1, LI Rui1,3,*
(1. College of Biological and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China；2. College of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic Univers ity, Wuhan 430023, China; 3. Hubei Collaborative Innovation Center for Processing of Agricultural Products, Wuhan 430023, China)

A total of 117 raw meat samples were collected from 22 markets in Wuhan, China and four E. coli O157:H7 strains were isolated from these meat samples, which were positive for stx, hly and eae genes. The stx variant genes were further subtyped by polymerase chain reaction (PCR) using sequence-specific primers targeting each stx variant. Three isolates were found to carry both stx1 and stx2 genes, and the prevalent stx genotypes were stx1a and stx2a. One isolate EC 5.11 was found to carry only stx2 gene but it could not be subtyped by PCR assay. The entire stx2 gene was then amplified from EC 5.11, cloned into a vector and sequenced. Sequencing data showed that the stx2 gene of EC5.11 was 100% identical to the published sequences of stx2c. The production of Shiga toxin from the four isolates was confirmed by Vero cell toxicity assay.

E. coli O157:H7; Shiga-toxin; stx genotype; Vero cytotoxicity

R155.5

A

1002-6630（2014）08-0094-05

10.7506/spkx1002-6630-201408018

2014-03-20

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）（2012AA101703-3）；

武漢市科技局國際科技合作計劃項目（2013030409020113）；武漢輕工大學(xué)研究生創(chuàng)新基金項目（2012cx019）作者簡介：鄭冬冬（1989—），男，碩士研究生，研究方向為食品安全。E-mail：651561949@qq.com

*通信作者：李睿（1972—），女，教授，博士，研究方向為食品安全和食品微生物。E-mail：liruiwuhan@163.com