孫 星，丁 悅，汪佳蕾，王冬蘭，沈 燕，劉賢金

QuEChERS-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定果蔬中多效唑殘留

孫 星，丁 悅，汪佳蕾，王冬蘭，沈 燕，劉賢金*

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品質(zhì)量安全與檢測研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全控制技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南 京 210014）

建立了果蔬中多效唑的QuEChERS-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測方法。樣品用乙腈快速提取，NaCl和無水MgSO4除水后，經(jīng)PSA和石墨炭黑凈化，用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析。采用正離子多反應(yīng)監(jiān)測模式檢測，定性離子對為m/z 294.2/70.0、294.2/125.0，采用m/z 294.2/70.0進(jìn)行定量分析。 在0.05、0.5、1 mg/kg添加水平下，樣品平均回收率為79.6%～94.9%；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.6%～11.4%；在梨、蘋果、桃、西紅柿和黃瓜中的檢出限分別為0.4、0.5、0.4、0.4、0.5 μg/kg。結(jié)果表明：本方法簡便、快速、安全、價(jià)格低廉，重復(fù)性良好，可用于果蔬樣品中多效唑殘留的快速確證檢測。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；QuEChERS；多效唑；水果；蔬菜；殘留

多效唑，化學(xué)名稱為（2RS,3RS）-1-（4-氯苯基）-4,4-二甲基-2-（1H-1,2,4-三唑-1-基）戊-3-醇，是20世紀(jì)80年代末開發(fā)出的一種三唑類植物生長調(diào)節(jié)劑，在果樹上使用可以控制過量的營養(yǎng)生長，促進(jìn)成花，提高產(chǎn)量[1]。目前已經(jīng)在水稻、大豆、花生、梨樹、蘋果、桃樹、葡萄、山楂、柑橘、荔枝、龍眼、芒果等的種植中得到了廣泛的研究和應(yīng)用[2-4]。多效唑雖然屬低毒植物生長調(diào)節(jié)劑，但是若使用不當(dāng)，會(huì)造成果實(shí)中殘留量過高，可能對人體健康造成危害[5]。因此，瑞典等歐洲國家現(xiàn)已在果樹上禁用多效唑，日本、新西蘭、韓國和澳大利亞等國家也制定了多效唑在多種水果中的最大殘留限量。目前我國規(guī)定該藥在蘋果和荔枝中最大殘留限量值為0.5 mg/kg[6]。對多效唑殘留量的分析，多用氣相色譜法[7-9]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[10-12]、液相色譜法[13-15]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[16-19]測定。這些方法的樣品前處理步驟繁瑣，有機(jī)溶劑用量多，而且分析時(shí)間長，或檢測靈敏度低、重現(xiàn)性差。Anastassiades等[20]開發(fā)出一種快速、簡單、廉價(jià)、高效、耐用、安全（quick, easy, cheap, effective, rugged, safe，QuEChERS）的樣品前處理方法。Lehotay等[21]對該方法進(jìn)行了改進(jìn)，目前該方法已發(fā)展成一系列針對不同基質(zhì)的方法。本研究采用改進(jìn)的QuEChERS方法作為樣品前處理方法，采用高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MSMS）測定5 種果蔬中多效唑的殘留量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

多效唑（含量99%） 德國Dr. Ehrenstorfer公司；乙腈、丙酮、甲醇（均為HPLC級） 德國Merck公司；NaCl和無水MgSO4（分析純） 西隴化工股份有限公司；乙二胺-N-丙基甲硅烷（primary secondary amine，PSA）填料（40～60 目）和石墨炭黑填料（120～400 目） 天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1260SL G6410A液-質(zhì)聯(lián)用儀 美國Agilent公司；SZ-120攪拌機(jī) 廣東美的生活電器制造有限公司；離心機(jī) 美國Thermo Fisher公司；IKAT18勻漿機(jī) 德國IKA公司；JY2002電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精確稱取多效唑標(biāo)準(zhǔn)品0.050 g（精確至0.001 g），以乙腈溶解定容至50.0 mL，配成標(biāo)準(zhǔn)母液。用流動(dòng)相乙腈-水-甲酸（80∶20∶0.1，V/V）稀釋至100 mg/L，再分別用流動(dòng)相、5 種不同果蔬空白基質(zhì)提取液逐級稀釋，配制成系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1 mg/L。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：A g i l e n t Z O R B A X S B-C18（2.1 mm×150 mm，5 ?m）及ZORBAX SB-Aq Narrow-Bore Guard Column 2.1 mm×12.5 mm，5 ?m（預(yù)柱）；流動(dòng)相：乙腈-水-甲酸（80∶20∶0.1，V/V），流速：0.20 mL/min，進(jìn)樣體積：5.0 ?L。

1.3.3 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離源，正離子模式；離子源溫度：350 ℃；霧化氣壓：35 psi；毛細(xì)管電壓：5.0 kV；去溶劑氣流：600 L/h；脫溶劑氣溫度：350 ℃；干燥氣流速：10 L/min；在分析過程中，采用多反應(yīng)檢測模式，以保留時(shí)間和離子對信息比較進(jìn)行定性分析；以母離子和響應(yīng)值最高的子離子進(jìn)行定量分析。多效唑的保留時(shí)間、監(jiān)測離子及碰撞電壓見表1。

表1 MRM模式下多效唑的保留時(shí)間、監(jiān)測離子（m/z） 及碰撞電壓（CE）Table 1 Retention time, monitoring ions and collision energy (CE) of paclobutrazol in the MRM mode

1.3.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取勻漿粉碎樣品4.0 g于10 mL離心管中，加0.5 g NaCl，加4 mL乙腈，旋渦振蕩1 min，3 000 r/min離心5 min取2 mL上清液轉(zhuǎn)入加有0.5 g無水MgSO4、0.1 g PSA和0.02 g石墨炭黑的4 mL離心管中，振蕩1 min，5 000 r/min離心3 min，取上清液待測。

2 結(jié)果與分析

2.1 QuEChERS方法條件的選擇

QuEChERS方法是利用吸附劑填料與基質(zhì)中的雜質(zhì)相互作用，吸附雜質(zhì)從而除雜凈化。其步驟可概括為：樣品粉碎、單一溶劑提取分離、加入Mg SO4等鹽類除水、加入吸附劑除雜、上清液進(jìn)行檢測。本方法分別用乙腈、甲醇和丙酮提取樣品，結(jié)果相比較，乙腈不容易提取色素和基質(zhì)中的非極性成分，且通過鹽析更容易去除樣品中的水分，故選用乙腈做提取劑。本研究選擇石墨炭黑、PSA和氨基填料進(jìn)行比較研究，結(jié)果顯示石墨炭黑填料對農(nóng)藥有一定的吸附作用，導(dǎo)致回收率不穩(wěn)定。PSA和氨基對色素去除不夠，污染離子源，干擾檢測結(jié)果，其中氨基填料對脂肪酸的去除效果不如PSA，從而回收率偏低。本實(shí)驗(yàn)最終確定PSA和石墨炭黑用量分別為0.1 g和0.02 g。結(jié)果表明，采用混合型分散固相萃取填料來處理樣品，凈化效果好，對目標(biāo)物干擾少，定性與定量分析效果好。

2.2 線性范圍和最低檢出限

分別用流動(dòng)相乙腈-水-甲酸（80∶20∶0.1，V/V）、5種不同空白基質(zhì)提取液配制好的0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1 mg/L多效唑標(biāo)準(zhǔn)液，進(jìn)樣5.0 ?L，平行測定5 次。當(dāng)多效唑的質(zhì)量濃度為0.002～1 mg/L時(shí)，其在流動(dòng)相和不同基質(zhì)中的線性回歸方程見表2。多效唑在梨、蘋果、桃、西紅柿和黃瓜中的檢出限分別為0.4、0.5、0.4、0.4、0.5 ?g/kg。結(jié)果表明，不同基質(zhì)對儀器響應(yīng)均有一定影響，但該方法的靈敏度和最小檢出量仍能滿足農(nóng)藥殘留的要求。

表2 多效唑在不同基質(zhì)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)Table 2 Parameters of linear calibration curves for paclobutrazol in different matrices

2.3 方法的回收率和精密度

圖1 多效唑在5 種樣品和標(biāo)樣中的色譜圖Fig.1 Chromatograms of paclobutrazol in 5 samples and standard sample

表3 多效唑在5種樣品中的加標(biāo)回收率與精密度（n=5）Table 3 Recoveries and precision for paclobutrazol in 5 samples (n= 5)

多效唑在梨、蘋果、桃、西紅柿和黃瓜中的添加0.05 mg/kg色譜圖及標(biāo)樣0.05 mg/kg色譜圖見圖1。用5 種空白樣品進(jìn)行添加多效唑標(biāo)準(zhǔn)溶液的回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)添加水平重復(fù)5 次。多效唑在添加0.05、0.5 mg/kg和1.0 mg/kg水平時(shí)，其在梨中的添加回收率為83.7%～94.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差5.4%～10.6%；在蘋果中的添加回收率為80.5%～93.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差4.4%～9.3%；在桃中的添加回收率為82.9%～94.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差4.9%～8.1%；在西紅柿中的添加回收率為80.3%～87.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差6.9%～11.4%；在黃瓜中的添加回收率為79.6%～92.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差3.6%～8.8%（表3）。多效唑在5種基質(zhì)中的添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均符合NY/T 788—2004《農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》[22]的要求。

2.4 實(shí)際樣品的測定

采用本實(shí)驗(yàn)建立的方法對江蘇省內(nèi)5 個(gè)地級市抽取梨、蘋果、桃、西紅柿和黃瓜樣品，每個(gè)地級市不同的農(nóng)貿(mào)市場采集10 個(gè)點(diǎn)，對抽取的樣品進(jìn)行了檢測分析。結(jié)果表明，多效唑在梨、西紅柿和黃瓜樣品中均未檢出；在4 個(gè)批次的蘋果和2 個(gè)批次的桃中有檢出，在4 個(gè)批次蘋果中的殘留量為0.013～0.034 mg/kg，在2 個(gè)批次的桃中的殘留量分別為0.016 mg/kg和0.022 mg/kg。檢出多效唑的蘋果和桃中典型色譜圖（圖2）。

圖2 多效唑在蘋果（A）和桃（B）實(shí)際樣品中的色譜圖Fig.2 Chromatograms of paclobutrazol in real apple and peach samples

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用乙腈提取，QuEChERS方法凈化，HPLCMS-MS檢測，成功地建立了果蔬中多效唑的快速檢測方法。該方法較以往方法具有操作簡單、提取時(shí)間短、萃取效率高的特點(diǎn)，還降低了檢測的成本。同時(shí)避免使用大量有機(jī)溶劑，減少了對環(huán)境污染，適用于實(shí)驗(yàn)室多效唑在果蔬中殘留的常規(guī)檢測。

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Determination of Paclobutrazol Residues in Fruits and Vegetables by QuEChERS-High Performance Liquid Chromatography-Triple Quadrupole Tandem Mass Spectrometry

SUN Xing, DING Yue, WANG Jia-lei, WANG Dong-lan, SHEN Yan, LIU Xian-jin*
(Key Laboratory of Control Technology and Standard for Agro-product Safety and Quality, Ministry of Agricultrue, Institute of Food Safety and Inspection, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China)

A method was developed for the determination of paclobutrazol residues in fruits and vegetables by using QuEChERS-high performance liquid chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry (HPLC-MS-MS). Paclobutrazol residues in fruit samples were extracted with acetonitrile, dehydrated with sodium chloride and anhydrous magnesium sulfate, cleaned up by dispersive solid phase extraction on primary secondary amine and graphitized carbon black, and detected by HPLC-MS-MS under a multiple reaction-monitoring mode. The qualitative results were obtained based on the characteristic m/z 294.2/70.0 and m/z 294.2/125.0, and the quantitative results were based on the characteristic m/z 294.2/70.0. The recoveries of paclobutrazol were in the range from 79.6% to 94.9% at three spiked levels of 0.05, 0.5 and 1 mg/kg from five fruits and vegetable matrixes (pear, apple, peach, tomato and cucumber), with relative sta ndard deviations (RSDs) between 3.6% and 11.4%, and the limits of detection were 0.4, 0.5, 0.4, 0.4 and 0.5 μg/kg, respectively. The method is simple, quick, safe, reproducible and applicable to detect and conf i rm paclobutrazol residues in fruit and vegetable samples.

high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS-MS); QuEChERS; paclobutrazol; fruit; vegetable; residues

TQ45

A

1002-6630（2014）08-0076-04

10.7506/spkx1002-6630-201408014

2013-08-13

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31071719）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目（CX（12）3090）作者簡介：孫星（1985—），男，學(xué)士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品安全性研究。E-mail：sun0519@sohu.com

*通信作者：劉賢金（1963—），男，研究員，博士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品安全性研究。E-mail：jaasliu@163.com