盧 靜 黎中寶, 陳 強 李文靜 黃永春

(1.集美大學水產(chǎn)學院 廈門 361021;2.福建省海洋漁業(yè)資源與生態(tài)環(huán)境重點試驗室 廈門 361021;3.廈門大學鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術教育部工程研究中心 廈門 361021)

雖然集約化的養(yǎng)殖模式使水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)得到迅速發(fā)展,然而高密度的養(yǎng)殖和水污染帶來的負效應如水產(chǎn)動物自身免疫能力下降、各種病害頻發(fā)以及激素類漁藥的濫用,嚴重影響了養(yǎng)殖產(chǎn)量和經(jīng)濟效益。目前,通過各種途徑開發(fā)研制低毒、高效、環(huán)保的飼料添加劑已成為調(diào)控魚類營養(yǎng)和免疫機能的主要趨勢,隨著人們對魚類營養(yǎng)免疫調(diào)控方式的更深入研究,利用新型抗病促長添加劑將會成為促進水產(chǎn)動物生長,提高魚類免疫力極為有效的途徑(黎中寶,2004)。

維生素作為一類低分子化合物,它不但是輔酶和輔基的組成部分參與新陳代謝過程而且能夠充當抗氧化劑清除機體自由基發(fā)揮免疫功效(艾慶輝等,2007)。Shiau等(2001)報道,飼料中添加維生素E可顯著提高羅非魚的生長與斑點叉尾(何敏等,2009)、泥鰍(孫翰昌,2013)的研究結果一致。維生素C和維生素E聯(lián)用不但能夠減緩應激對金頭鯛的損害(Ortunoet al,2003),而且能夠顯著提高斑點叉尾各種血液免疫指標值。以上研究表明飼料添加維生素對養(yǎng)殖動物具有顯著的促生長作用,能夠增強養(yǎng)殖動物抗應激、抗氧化能力及提高養(yǎng)殖動物免疫力,隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的深入發(fā)展,維生素作為一種綠色環(huán)保型飼料添加劑將受到更加廣泛的應用。采用多種維生素混合制劑作為飼料添加劑,可以發(fā)揮維生素成分之間的協(xié)同作用,提升抗病、促長效果。

歐洲鰻鱺(Anguilla anguilla),屬鰻鱺目(Anguilliformes)、鰻鱺科(Anguillae)、鰻鱺屬(Anguilla)。其肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富、經(jīng)濟價值高,是國內(nèi)外暢銷的一種名貴魚類。我國是世界上最大的鰻鱺生產(chǎn)國,前期主要以日本鰻鱺(Anguilla japonica)為養(yǎng)殖主體,直到20世紀90年代才開始逐漸增加歐洲鰻鱺的養(yǎng)殖比重,由于國內(nèi)對歐洲鰻鱺的研究起步較晚,關于歐洲鰻鱺營養(yǎng)與養(yǎng)殖的研究主要集中于三大營養(yǎng)(王軍霞等,1998)、生態(tài)學(李文靜等,2009;鄭偉剛等,2011)及利用一些中草藥為主的促生長添加劑(吳德峰等,2001),關于歐洲鰻鱺飼料中應用多維添加劑的研究卻鮮見報道。本研究初步嘗試評估多維添加劑對歐洲鰻鱺生長性能、消化酶活性以及免疫力的影響,評價多維添加效果和適宜添加劑量,為多維添加劑在歐洲鰻鱺飼料中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗用魚及馴養(yǎng)

試驗所用歐洲鰻鱺購于福建省龍巖市一養(yǎng)鰻場,選用同一批魚苗于正式試驗前將其暫養(yǎng)在集美大學海水試驗場循環(huán)過濾桶(1200L)中兩周。暫養(yǎng)期間每天2次飽食投喂基礎飼料(8:00,18:00),使鰻苗逐漸適應試驗飼料以及養(yǎng)殖環(huán)境。

1.2 試驗設計及試驗飼料

基礎料采用福建天馬飼料公司生產(chǎn)的鰻鱺黑仔料,其主要成分包括進口魚粉、預糊化淀粉、酵母粉、魚油、礦物質(zhì)和維生素等(主要營養(yǎng)成分見表1)。選用的添加劑為上海艾魁英有限生物公司生產(chǎn)的華易鰻用多維(表2)。多維添加劑按照等差數(shù)列設計成比例并與基礎飼料按逐級擴大法混勻,配制成對照組(0%)、Diet 1(0.25%)、Diet 2(0.50%)、Diet 3(0.75%)、Diet 4(1.00%)、Diet 5(1.25%)六種不同多維添加水平的飼料,于自封袋內(nèi)－4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 歐洲鰻鱺基礎飼料主要營養(yǎng)成分(干重%)Tab.1 Proximate ingredients of basal diet for A.anguilla(dry weight %)

表2 多維添加劑配方及成分分析(含量/kg)Tab.2 Ingredients and proximate analysis of multivitamin additives(content/kg)

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗在設有循環(huán)過濾水系統(tǒng)的玻璃水族缸(120L)中進行,共設 6個處理組,每處理組 3個重復。經(jīng)兩周馴養(yǎng)后挑選出體格健壯、規(guī)格一致的幼鰻 540尾[初始體重為(5.93±0.02)g],隨機分到 18個水族缸中。正式試驗期間每天飽食投喂2次(8:00,18:00),每次投喂前分別按組制作團狀飼料,待魚攝食20min后吸去殘餌和糞便并更換20%的曝氣自來水。每天觀察鰻鱺攝食與生長情況,記錄死亡數(shù)和水溫。每周測水質(zhì),試驗期間水溫為 18—22°C,溶解氧濃度＞7.6mg/L,氨氮濃度＜0.25mg/L,pH值為7.8—8.2。

1.4 樣品采集及處理

飼喂 42d后,使鰻鱺禁食 24h,對每缸魚進行整體稱重和計數(shù)。每缸隨機撈取5尾魚測體質(zhì)量和體長,再放入含有丁香酚的水桶中麻醉處理,分別用 1mL無菌注射器進行尾部靜脈取血于 1.5mL滅菌離心管中3000r/min離心10min收集血清置–80°C冰箱保存用于分析血清生化指標。將采血后的鰻鱺進行解剖,取肝胰腺并稱重用于計算肝體指數(shù),分離出腸道后快速剔除其內(nèi)溶物并放入液氮保存用于測定消化酶活性。另隨機取3尾魚保存于–20°C冰箱,用于測定全魚體成分。

1.5 測定指標

1.5.1 生長指標分析 對試驗魚生長性能指標測定時所用公式為:

特定生長率SGR(%/d) = 100×(ln終末體質(zhì)量－ln初始體質(zhì)量)/試驗天數(shù)

增重率 WG(%) = 100×(魚體末重－魚體初重)/魚體初重;

成活率SR(%) = 100×(收獲尾數(shù)/放養(yǎng)尾數(shù));

肝體指數(shù)HSI(%) = 100×(肝胰臟重/魚體質(zhì)量);

肥滿度CF(%) = 100×體質(zhì)量(g) /體長3(cm3)。

魚體稱濕重后于 70°C烘干,絞碎之后待測體成分。魚體成分和飼料基本成分均采用105°C常壓烘箱干燥恒重法測水分;采用半微量凱氏定氮法(總氮×6.25)測粗蛋白;索氏抽提法(乙醚為抽提液)測粗脂肪;馬福爐灼燒法(550°C)測灰分。

1.5.2 消化酶及血清免疫酶活性測定 將腸道稱重,按 1︰9(V/W)加入 4°C的 0.85%生理鹽水,在冰水浴中勻漿 5min。采用低溫高速離心機(4°C,4000r/min,20min)對勻漿液進行離心,吸取上清于–80°C冰箱保存待測消化酶。腸道淀粉酶(AMS)、脂肪酶(LPS)、胰蛋白酶活性及血清總超氧化物歧化酶(T-SOD)、溶菌酶(LZM)、堿性磷酸酶(AKP)活性和血清總蛋白(TP)含量均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的相應試劑盒測定,操作步驟按照說明書進行。

1.5.3 統(tǒng)計方法 試驗所得數(shù)據(jù)均用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA),利用Duncan法進行多重比較,取顯著水平P＜0.05。試驗所得數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標準誤進行表示。

2 結果

2.1 多維對歐洲鰻鱺生長性能的影響

飼料中添加多維顯著影響鰻鱺增重率和特定生長率(P＜0.05)(表3)。6周生長試驗結果表明,隨多維添加濃度的上升,鰻鱺增重率和特定生長率呈先升后降的趨勢,添加水平為0.75%的多維處理組增重率達最大,比對照組顯著提高了 39.52%(P＜0.05),但各處理組間增重率和特定生長率差異不顯著(P＞0.05)。各添加組鰻鱺的肝體指數(shù)比對照組略有下降,但無顯著差異。各試驗組肥滿度均無顯著差異(P＞0.05),僅Diet 5(1.25%)組成活率為97.7%。

2.2 多維對鰻鱺魚體成分的影響

表4的結果表明:飼料中添加多維能顯著降低歐洲鰻鱺體魚體中的水分同時提高灰分和粗蛋白含量(P＜0.05)。Diet 3(0.75%)組鰻鱺魚體水分含量相比對照組顯著降低,同時該組魚體灰分和粗蛋白含量顯著高于對照組。魚體粗脂肪含量隨著多維濃度增大也有上升趨勢但無顯著差異(P＞0.05)。

2.3 多維對鰻鱺腸道消化酶的影響

鰻鱺攝食試驗料 6周后腸道中消化酶活性見表5,鰻鱺腸道中胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性均得到顯著提高(P＜0.05)。所有添加多維處理組的鰻鱺腸道胰蛋白酶和淀粉酶活性均顯著高于不添加多維的對照組,但各添加組間的胰蛋白酶活性均處于同一水平無顯著差異,隨著多維添加水平的增加淀粉酶和脂肪酶活性均呈先升高后下降趨勢,多維添加水平為 1.00%時淀粉酶活性達最高,當多維添加量處于 0.75%—1.00%濃度范圍時鰻鱺腸道脂肪酶活性達最高水平且顯著高于對照組(P＜0.05)。

表3 多維添加劑對歐洲鰻鱺生長的影響Tab.3 Effects of multivitamin additives on the growth performance of A.anguilla

表4 多維添加劑對歐洲鰻鱺體成分的影響(濕重%)Tab.4 Effects of multivitamin additives on the whole-body composition of A.anguilla(wet weight %)

2.4 多維對鰻鱺血清中免疫酶的影響

試驗選取超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶(LZM)、堿性磷酸酶(AKP)活性和血清總蛋白濃度(TP)4個指標來反映飼料添加多維后歐洲鰻鱺免疫力的變化(表6)。飼料中添加多維使各處理組的免疫指標值均得到提高,各添加組鰻鱺血清 SOD活性隨多維添加水平的升高而不斷增加,Diet 5(1.25%)組鰻鱺SOD活性達到最大與對照、Diet1(0.25%)組形成顯著差異(P＜0.05)。Diet 1和Diet 3(0.75%)兩組鰻鱺血清LZM活性在所有試驗組中達到最高水平且與對照組、Diet4及Diet5形成顯著差異(P＜0.05)。Diet 3添加組鰻鱺血清AKP活性和血清TP含量均顯著高于對照組(P＜0.05),兩指標變化趨于一致,但兩種指標各添加組間活性均無顯著差異(P＞0.05)。

表5 多維添加劑對歐洲鰻鱺腸道消化酶活性的影響Tab.5 Effects of multivitamin additives on the activities of digestive enzymes of A.anguilla

表6 多維添加劑對歐洲鰻鱺免疫功能的影響Tab.6 Effects of multivitamin additives on the immune response of A.anguilla

3 討論

3.1 多維對歐洲鰻鱺生長的影響

維生素對維持歐洲鰻鱺正常生長和健康具有重要意義,但有關鰻鱺維生素的營養(yǎng)需求研究較少,人們在生產(chǎn)實踐中發(fā)現(xiàn)鰻鱺對維生素的需要量比其他溫水性魚類要高,鰻鱺對維生素缺乏相當敏感,很容易出現(xiàn)維生素缺乏癥(王曉娟等,2010)。

目前,國內(nèi)外眾多研究證實飼料中添加維生素C能顯著提高點帶石斑魚(Epinephelus coioides)(周歧存等,2005)、印度鯉(Labeo rohita)(Misraet al,2007)的增重率和特定生長率,適量維生素E可以促進幼建鯉(伍曦等,2011)、花鱸(周立斌等,2009)和條石鯛(Oplegnathus fasciatus)(Buenoet al,2010)的生長。本試驗采用的多維添加劑將脂溶性維生素(A、D3、E及K)、水溶性維生素(B族維生素、VC、肌醇、煙酸及生物素)和載體等進行合理配伍,考慮到了多種維生素對鰻鱺的協(xié)同作用。林仕梅等(2003)報道飼料中添加四種 B族維生素具有提高異育銀鯽的生長并明顯改善其肉質(zhì)的功效,而復合維生素制劑使試驗組的鯉魚生長速度比對照組快 6%—25%(路永吉等,1992)。在本試驗條件下,基礎飼料添加0.75%的多維顯著提高了鰻鱺增重率和特定生長率,使鰻鱺增重率比對照組提高了 39.52%,遠大于上述鯉魚的 25%,這種差異可能與陸永吉等試驗選用較大規(guī)格鯉魚種(45g)和其試驗天數(shù)較短(28d)有關。然而,超過0.75%的多維水平未能使鰻鱺增重得到持續(xù)增長反而略有下降,伍曦等(2011)也曾強調(diào)應注意維生素過量問題,超量維生素會引起代謝負擔和毒害作用對動物生長產(chǎn)生不利(黎中寶,2004)。另外,本試驗在基礎飼料中添加多維不但降低了鰻鱺肝體指數(shù)而且改善了鰻鱺的營養(yǎng)組成,使魚體水分含量下降,粗蛋白和灰分增加,這也是品質(zhì)提高的表現(xiàn),此結果與飼料中添加維生素 E投喂花鱸所得結果(周立斌等,2009)一致,這可能是由于多維能在鰻鱺脂肪、蛋白質(zhì)代謝過程中起作用,需要進一步研究。綜合考慮生長效應,本試驗中多維的最適添加量為0.75%。

3.2 多維對歐洲鰻鱺腸道消化酶的影響

魚類消化酶活性可以直接反應魚類對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用,與魚的生長關系密切,因此研究消化酶活性的影響具有重要意義。國內(nèi)使用飼料添加劑研究鰻鱺消化酶并不多見,本試驗在一定程度上彌補了類似研究的不足。42d的投喂試驗表明,多維添加組歐洲鰻鱺腸道中胰蛋白酶活性均顯著高于對照組,但各添加組間差異不顯著,淀粉酶和脂肪酶活性隨多維添加水平的提高呈先升高后下降的趨勢,當多維添加水平為 0.75%—1.00%時三種酶活性均達最佳狀態(tài),這與維生素E對泥鰍、斑點叉尾、膽堿對黃鱔消化酶活性影響的研究結果類似(楊代勤等,2006;何敏等,2009;孫翰昌,2013)。這可能與某些維生素能夠促進消化器官的生長發(fā)育從而提高魚類消化能力有關(伍曦等,2011)。消化酶活性的提高增強了鰻鱺對營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收能力,加速魚類對飼料蛋白質(zhì)、脂肪等物質(zhì)的沉積從而促進魚的生長?？傮w來說,飼料添加多維后提高了鰻鱺的消化酶活性,有助于鰻鱺更好地吸收營養(yǎng)物質(zhì),結合經(jīng)濟效益和投喂效果建議多維在飼料中的添加水平為0.75%。

3.3 多維對歐洲鰻鱺血清免疫指標的影響

對于魚類特殊的生存環(huán)境,非特異性免疫機制在抵抗病害方面比特異性免疫顯得更為重要(Anderson,1992),血清中眾多抗氧化酶在防止魚類病菌感染,維持機體健康中扮演著重要角色。超氧化物歧化酶(SOD)作為動物機體內(nèi)關鍵的抗氧化酶之一能夠清除體內(nèi)多余自由基(李敬璽等,2007),而溶菌酶(LZM)可以破壞消除侵入體內(nèi)的異物,幫助魚類遠離病原微生物的感染(徐永平等,2011)。除上述兩種極為常見的非特異性免疫酶外,Bigij等(1987)報道堿性磷酸酶(AKP)可通過水解作用破壞、改變有害異物的表面分子組成,加快吞噬細胞的吞噬作用及異物的降解,阻止病菌的繁殖從而能起到免疫防御作用。另外,血清總蛋白(TP)具有維持血液正常膠體滲透壓,運輸脂肪酸和保護機體的作用,能夠間接反映機體非特異性免疫水平是重要的免疫指標(Polstraet al,1997;Hollandet al,2002)。因此,本研究選取SOD、LZM、AKP和TP四種具有代表性的非特異性免疫酶指標能夠?qū)狑~非特異性免疫狀況進行說明。

目前,國內(nèi)外許多實驗都印證了維生素的免疫效應,維生素C能提高印度鯉血清溶菌酶活性(Misraet al,2007),維生素A使凡納濱對蝦血清SOD活性呈上升趨勢且溶菌酶活性得到顯著提高(楊奇慧等,2007)。飼料中500mg/kg的維生素E水平則能提高條石鯛非特異性免疫力提高其抗弧菌能力(Buenoet al,2010)。本試驗選取多種維生素混合制劑添加到基礎飼料中,42d的投喂試驗結果表明,各多維添加組鰻鱺血清 SOD活性隨多維添加水平的升高不斷增加,1.00%添加組鰻鱺 SOD活性達到最大。鰻鱺血清LZM、AKP和血清 TP則呈先升后降趨勢,在多維0.75%添加濃度的試驗組中達到最高水平。綜合得出,0.75%的多維添加濃度使鰻鱺獲得了較佳的血清免疫指標。關于維生素的免疫機制一般認為維生素C能清除機體產(chǎn)生的自由基,阻止不飽和脂肪酸過氧化維持細胞膜正常生理功能從而提高機體免疫力(Chieet al,2001)。B族維生素一方面可作為輔酶參與體內(nèi)合成代謝,另一方面通過提高血清抗氧化酶和總鐵結合力增強魚類抗病能力(周小秋,2009)。同樣,缺乏維生素E將導致魚類細胞膜穩(wěn)定性變差,抗氧化能力減弱等(Hardieet al,1990)。對于單種維生素免疫防御機制國內(nèi)外研究較多,然而由于多種維生素之間存在錯綜復雜的相互關系,在動物體內(nèi)的免疫防御機制還尚不清楚,需要進一步的研究。

綜上所述,在本試驗條件下,飼料中添加多維能夠促進歐洲鰻鱺生長、提高鰻鱺腸道三種消化酶活性以及提高鰻鱺免疫力。結合多維抗病促長效果和經(jīng)濟效益得出,多維在鰻鱺基礎配合飼料中的適宜添加水平為0.75%。

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