肖佩玉，萬正蘭，黃際薇（1.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院藥劑科，廣州 510630；.中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院藥學(xué)部，廣東珠海 510630）

原發(fā)性肝癌炎癥危害人類生命健康，我國(guó)是肝癌高發(fā)地區(qū)，每年死于肝癌的患者超過11萬[1]。由于該疾病早期臨床癥狀不典型，患者發(fā)現(xiàn)時(shí)大多數(shù)已屬晚期，失去了手術(shù)治療最佳時(shí)機(jī)，因此患者病死率極高，預(yù)后效果較差[2]。晚期肝癌患者臨床常用的治療方法為放化療，但放化療的毒副作用較大，導(dǎo)致部分患者不耐受而影響治療效果。枸杞多糖是從枸杞子中提煉出來的蛋白多糖，近代藥理學(xué)研究指出，枸杞多糖具有抗基因突變、抗腫瘤、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、抵抗病毒及感染等多種生物活性功能[2]。枸杞多糖不僅能直接殺死腫瘤細(xì)胞，同時(shí)可與中間宿主產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，通過多途徑作用于免疫細(xì)胞，增加抗體分泌，提高機(jī)體免疫功能，從而起到殺滅及抑制腫瘤細(xì)胞的作用[3]。為此，本研究通過復(fù)制H22肝癌小鼠模型，以探討枸杞多糖抑制腫瘤與提高機(jī)體免疫力的作用。

1 材料

1.1 儀器

BLXK-JA3003B型電子天平（上海鑫倉(cāng)電子科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

枸杞多糖（西安森冉生物工程有限公司，批號(hào)：20081201，含量：＞30%）；環(huán)磷酰胺（山西普德藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20090103）；甲胎蛋白（AFP）測(cè)試盒（北京倍愛康生物技術(shù)股份有限公司）；鐵蛋白（SF）、癌胚抗原（CEA）測(cè)試盒（天津中新科炬生物制藥有限公司）；白細(xì)胞介素（IL）-2、腫瘤壞死因子（TNF）-α、γ干擾素（INF-γ）酶聯(lián)免疫（ELISA）測(cè)試盒均購(gòu)于上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 動(dòng)物與瘤株

2 方法

2.1 模型的復(fù)制

將經(jīng)三代細(xì)胞傳代培養(yǎng)的H22瘤株經(jīng)腹腔接種到KM小鼠體內(nèi)，并于接種后7 d選擇腹水飽滿、精神狀態(tài)良好的小鼠采用頸椎脫臼處死，消毒腹腔部位后抽取小鼠腹部乳白色腹水作為腫瘤源，并用無菌生理鹽水將腫瘤細(xì)胞懸液稀釋為原來的3倍，經(jīng)常規(guī)消毒后將0.2 ml懸液皮下接種于小鼠右前肢腋窩，以復(fù)制小鼠肝癌模型。

2.2 分組與給藥

20只KM小鼠隨機(jī)均分為4組，即正常對(duì)照（等容生理鹽水）組、模型（等容生理鹽水）組、環(huán)磷酰胺（20 mg/kg）組、枸杞多糖（5 mg/kg）組。ig給藥，每天1次，連續(xù)10 d。

2.3 指標(biāo)的檢測(cè)

2.3.1 體質(zhì)量的稱定 每天上午8：00～10：00稱取小鼠去除瘤體后的純體質(zhì)量。

2.3.2 抑瘤率的計(jì)算 稱定腫瘤質(zhì)量，并根據(jù)公式計(jì)算抑瘤率：抑瘤率（%）＝[1－（用藥組平均瘤質(zhì)量/模型組平均瘤質(zhì)量）]×100%。

2.3.3 血清腫瘤標(biāo)記物的測(cè)定 空腹靜脈抽取小鼠血液3 ml，常規(guī)離心得血清，采用ELISA法測(cè)定血清腫瘤標(biāo)記物。

2.3.4 炎癥因子的測(cè)定 空腹靜脈抽取小鼠血液3 ml，常規(guī)離心得血清，采用ELISA法測(cè)定小鼠血清IL-2、TNF-α、INF-γ含量。

2.3.5 自然殺傷（NK）細(xì)胞活性的測(cè)定 采用MTT法測(cè)定NK細(xì)胞活性。NK細(xì)胞活性（%）＝[靶細(xì)胞吸光度－（用藥組吸光度－效應(yīng)細(xì)胞吸光度）]/靶細(xì)胞吸光度×100%。其中，效應(yīng)細(xì)胞為脫頸椎處死小鼠去脾臟研磨制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)200目篩網(wǎng)濾過，Hanks液洗3次，用RPMI1640培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，用臺(tái)酚藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)在95%以上，并調(diào)整細(xì)胞密度為5×106ml－1；靶細(xì)胞為將連續(xù)傳代培養(yǎng)的胞株為靶細(xì)胞，活細(xì)胞數(shù)在95%以上、細(xì)胞密度調(diào)為2.5×105ml－1。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 枸杞多糖對(duì)模型小鼠體質(zhì)量的影響

給藥第5、10天，與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠體質(zhì)量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，枸杞多糖組小鼠體質(zhì)量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。枸杞多糖對(duì)模型小鼠體質(zhì)量的影響見表1。

表1 枸杞多糖對(duì)模型小鼠體質(zhì)量的影響（）Tab 1 Effects ofL.chinensis polysaccharides on body weight in model rats（）

表1 枸杞多糖對(duì)模型小鼠體質(zhì)量的影響（）Tab 1 Effects ofL.chinensis polysaccharides on body weight in model rats（）

與正常對(duì)照組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

3.2 枸杞多糖對(duì)模型小鼠抑瘤率的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠瘤質(zhì)量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，枸杞多糖組小鼠瘤質(zhì)量減少（抑瘤率為62.98%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。枸杞多糖對(duì)模型小鼠抑瘤率的影響見表2。

表2 枸杞多糖對(duì)模型小鼠抑瘤率的影響（）Tab 2 Effects ofL.chinensis polysaccharides on tumor inhibition rate in model rats（）

表2 枸杞多糖對(duì)模型小鼠抑瘤率的影響（）Tab 2 Effects ofL.chinensis polysaccharides on tumor inhibition rate in model rats（）

與正常對(duì)照組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

3.3 枸杞多糖對(duì)模型小鼠血清腫瘤標(biāo)記物水平的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠血清AFP、CEA含量增加，SF含量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，枸杞多糖組小鼠血清AFP、CEA含量減少，SF含量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。枸杞多糖對(duì)模型小鼠血清腫瘤標(biāo)記物水平的影響見表3。

表3 枸杞多糖對(duì)模型小鼠血清腫瘤標(biāo)記物水平的影響（）Tab 3 Effects ofL.chinensis polysaccharides on serum tumor markers in model rats（）

表3 枸杞多糖對(duì)模型小鼠血清腫瘤標(biāo)記物水平的影響（）Tab 3 Effects ofL.chinensis polysaccharides on serum tumor markers in model rats（）

與正常對(duì)照組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

3.4 枸杞多糖對(duì)模型小鼠血清細(xì)胞因子水平的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠血清IL-2、IFN-γ含量減少，TNF-α含量增加，NK細(xì)胞活性減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，枸杞多糖組小鼠血清IL-2、IFN-γ含量增加，TNF-α含量減少，NK細(xì)胞活性增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。枸杞多糖對(duì)模型小鼠血清細(xì)胞因子水平的影響見表4。

表4 枸杞多糖對(duì)模型小鼠血清細(xì)胞因子水平的影響（）Tab 4 Effects ofL.chinensis polysaccharides on inflammatory cytokines levels in model rats（）

表4 枸杞多糖對(duì)模型小鼠血清細(xì)胞因子水平的影響（）Tab 4 Effects ofL.chinensis polysaccharides on inflammatory cytokines levels in model rats（）

與正常對(duì)照組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

4 討論

腫瘤的發(fā)生及發(fā)展是非常復(fù)雜的過程，目前關(guān)于腫瘤的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究，但已有研究指出，腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、預(yù)后與機(jī)體免疫狀況有密切關(guān)系，腫瘤患者普遍存在免疫功能低下的情況[4]。機(jī)體免疫狀況對(duì)對(duì)抗腫瘤侵襲、抑制腫瘤生長(zhǎng)具有重要意義。

枸杞多糖是從植物枸杞子中提煉的活性成分，相關(guān)研究表明，其具有抗病毒、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抗腫瘤、降血糖血脂、清除機(jī)體自由基與延緩衰老等功能[5]。枸杞多糖對(duì)機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)，能通過與中間宿主產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)而起到間接抑制或殺傷腫瘤的目的[6]。枸杞多糖可通過多層面及多途徑調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)，從而激活巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞而起到免疫調(diào)節(jié)功能。此外，枸杞多糖能通過刺激NK細(xì)胞大量分泌IFN-γ，增加巨噬細(xì)胞免疫殺傷功能，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤作用[7-8]。

本研究中對(duì)H22肝癌小鼠ig枸杞多糖，通過研究發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖具有明顯抑制腫瘤的作用。枸杞多糖組小鼠平均瘤質(zhì)量低于模型組，而抑瘤率則高于環(huán)磷酰胺組，環(huán)磷酰胺作為廣譜抗癌藥物具有較強(qiáng)的抑制腫瘤作用，但其在殺傷癌癥細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)對(duì)機(jī)體正常細(xì)胞產(chǎn)生較大的損害作用，增加患者不良反應(yīng)率。蔣艷等[9]研究指出，通過檢查腫瘤血清標(biāo)記物可以有效評(píng)價(jià)藥物抑瘤作用。CEA是由腸黏膜釋放的，進(jìn)入循環(huán)后其將會(huì)被肝臟吸收并分解，當(dāng)肝臟受損時(shí)，CEA的分解能力將受到影響，從而導(dǎo)致血液中CEA的水平上升[10]。SF是血清中的鐵蛋白質(zhì)，其生成及合成是由肝臟細(xì)胞生成的，當(dāng)肝臟細(xì)胞受損時(shí)，會(huì)導(dǎo)致鐵蛋白的合成受阻，使得血液中SF含量升高。AFP是肝組織出現(xiàn)大規(guī)模壞死后釋放到血清中的物質(zhì)，因此通過對(duì)三種標(biāo)記物進(jìn)行測(cè)定能有效預(yù)測(cè)肝癌的進(jìn)展程度。本研究枸杞多糖組小鼠血清AFP、CEA低于模型組，而SF高于模型組，從而說明枸杞多糖能有效抑制腫瘤生長(zhǎng)。鄧自輝等[11]研究認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生與機(jī)體免疫力失衡有關(guān)，通過增強(qiáng)機(jī)體免疫力可有效抵抗腫瘤。本研究枸杞多糖組NK細(xì)胞活性、IL-2、INF-γ含量高于環(huán)磷酰胺組，而TNF-α含量低于環(huán)磷酰胺組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其結(jié)果與楊書良等[12]報(bào)導(dǎo)一致。原因可能與枸杞多糖如下作用機(jī)制有關(guān)：（1）增加T淋巴細(xì)胞及淋巴細(xì)菌亞群，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。（2）通過調(diào)節(jié)小鼠巨噬細(xì)胞，釋放可溶性因素及抗原從而起到抑制腫瘤的作用。（3）枸杞多糖刺激NK細(xì)胞釋放，增加NK細(xì)胞殺傷腫瘤活性，溶解腫瘤細(xì)胞，增加白細(xì)胞，降低IL，誘導(dǎo)干擾素生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞與巨噬細(xì)胞結(jié)合，從而產(chǎn)生特異性免疫殺傷腫瘤細(xì)胞，起到抑制腫瘤的作用。

[1]張鳴號(hào)，王秀玉，王秀梅，等.枸杞多糖對(duì)小鼠移植性肝癌抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中草藥，2012，（6）：1 142.

[2]周愛國(guó)，李小蘭.枸杞多糖對(duì)大鼠小腸缺血再灌注氧化應(yīng)激的抑制作用[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（22）：221.

[3]郝習(xí)，趙明耀，楊紅艷，等.枸杞多糖對(duì)荷H22肝腹水瘤小鼠免疫功能的影響[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2011，46（2）：242.

[4]佘燕玲，何彥麗，杜標(biāo)炎，等.枸杞多糖聯(lián)合趨化因子對(duì)肝癌小鼠T輔助淋巴細(xì)胞分化的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（7）：208.

[5]劉靜.枸杞多糖對(duì)小鼠移植性肝癌抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].陜西中醫(yī)，2013，34（8）：1 079.

[6]成日華，李煥德.枸杞多糖抗腫瘤機(jī)制研究進(jìn)展[J].中南藥學(xué)，2011，9（12）：921.

[7]郝習(xí)，趙明耀，董子明，等.靈芝多糖和枸杞多糖聯(lián)合應(yīng)用對(duì)荷瘤小鼠抗腫瘤活性和免疫功能的影響[J].中醫(yī)研究，2011，24（5）：33.

[8]張鳴號(hào)，王秀玉，王秀梅，等.枸杞多糖對(duì)小鼠移植性肝癌端粒酶活性及hTERT蛋白表達(dá)的影響[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2012，23（10）：2 438.

[9]蔣艷，姜孝新.枸杞多糖對(duì)肝癌Hca-F荷瘤小鼠的抗腫瘤作用及其機(jī)制[J].腫瘤藥學(xué)，2011，01（4）：391-394.

[10]章培軍，邢雁霞，劉斌鈺，等.枸杞多糖對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝損傷保護(hù)作用的研究[J].中國(guó)藥物與臨床，2011，11（11）：1 286.

[11]鄧自輝，牛陽(yáng)，王榮，等.枸杞多糖藥理作用的研究現(xiàn)狀[J].臨床合理用藥雜志，2011，04（35）：164.

[12]楊書良，郝玉栓，單鐵英，等.口服枸杞多糖對(duì)實(shí)驗(yàn)性食管癌大鼠免疫功能影響的研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2012，16（6）：986.