胡 衛(wèi)，張苗旋，鄭崛村，王 玲，沈富兵#（.武漢大學(xué)醫(yī)院，武漢 43007；.成都醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，成都 60065）

溶瘤腺病毒抗腫瘤療法是一種具有較高臨床應(yīng)用前景的新型抗腫瘤模式[1]，其原理在于改造腺病毒載體，使其可以在腫瘤細(xì)胞中優(yōu)先復(fù)制，而大量復(fù)制的腺病毒最終將破壞宿主細(xì)胞。這種特異性復(fù)制能力的獲得是靠不同的策略達(dá)到的，如修飾病毒的包膜蛋白使之高效感染腫瘤細(xì)胞[2]；摻入腫瘤啟動(dòng)子序列以控制病毒基因的表達(dá)和清除病毒在正常細(xì)胞中復(fù)制所必需的基因[3-4]。到目前為止，已經(jīng)有成系列的條件性溶瘤腺病毒在進(jìn)行臨床前和臨床試驗(yàn)[5]。

本課題組構(gòu)建的重組腺病毒TOA02即為條件性復(fù)制溶瘤腺病毒[6]，主要用于肝癌、肺癌、前列腺癌以及頭頸部癌等多種腫瘤的抗腫瘤治療，對(duì)正常細(xì)胞沒有影響，是一種新型的抗腫瘤基因治療制品。筆者將開展TOA02 的生物分布實(shí)驗(yàn)，以把握TOA02 在體內(nèi)各組織臟器的分布情況和代謝動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，并考察TOA02 是否擴(kuò)散到生殖腺和非靶組織中，以便為預(yù)測(cè)毒性靶器官提供直接證據(jù)。鑒于TOA02只能在人類腫瘤中高度復(fù)制，筆者選擇接種人肺癌細(xì)胞A549的荷瘤裸小鼠作為實(shí)驗(yàn)載體，通過瘤內(nèi)注射藥物，觀察TOA02 在體內(nèi)的分布情況。本實(shí)驗(yàn)采用定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)法，選用腺病毒殼粒六鄰體（Hexon）基因作為檢測(cè)指標(biāo)。

1 材料

1.1 儀器

CO2培養(yǎng)箱[立德泰勀（上海）科學(xué)儀器有限公司]；倒置顯微鏡（德國Leica 公司）；FTC2000 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（加拿大楓嶺公司）；超聲波組織勻漿器（德國IEKA 公司）；ABI PRISM 7000型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

1.2 病毒與試劑

TOA02（本課題組自制，批號(hào)：20100518，滴度：1.8×1012copies/ml，－80 ℃貯藏）；新生小牛血清（成都哈里生物工程有限公司）；胰蛋白酶（美國Gibco公司）；組織DNA提取試劑盒、實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)試劑[寶生物工程（大連）有限公司]。

1.3 移植瘤細(xì)胞系和病毒株

人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、巨細(xì)胞病毒株AD169、Ⅰ型單純皰疹病毒株KOS、Ⅱ型單純皰疹病毒株HG252 和風(fēng)疹病毒株M33由華西醫(yī)院移植免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，均為ATCC來源。

1.4 動(dòng)物

2 方法

2.1 腫瘤模型構(gòu)建

2.2 給藥與取樣

根據(jù)臨床擬用劑量設(shè)置實(shí)驗(yàn)組荷瘤裸小鼠給予TOA02 3×1010copies/ml，每只50 μl，瘤體內(nèi)注射，隔日注射1 次，共3次；對(duì)照組荷瘤裸小鼠給予等體積生理氯化鈉溶液。于首次給藥后第11、18、36天各取實(shí)驗(yàn)組6只荷瘤裸小鼠（♀各半），腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后，取血并摘取組織臟器，順序依次為：血液、睪丸/子宮、附睪/卵巢、脾臟、腎臟、肝臟、肺臟、心臟、腫瘤、骨髓、大腦；對(duì)照組僅末次取樣，均于－80 ℃下保存。

2.3 樣品處理與測(cè)定

2.3.1 DNA 提取。分別取腫瘤及各臟器組織5～10 mg，剪成約1 mm的碎塊，加入180μl 裂解緩沖液，漩渦混勻后，加20μl蛋白酶K 漩渦混勻，置于55 ℃孵育3 h，于37 ℃過夜，然后按試劑盒說明書分別抽提總DNA。

2.3.2 引物的設(shè)計(jì)與合成。Hexon 基因是腺病毒的特異和保守序列，故以其為靶基因。使用Primer Express v 3.0 軟件，以Hexon 基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)引物及探針。為了避免DNA 的污染，上下游引物均設(shè)計(jì)為跨過內(nèi)含子。Hexon 基因上游引物：5′-CTTCGATGATGCCGCAGTG-3′；下游引物：5′-GGGCTCAGGTACTCCGAGG-3′；探針：5′-FAM-TTACATGCACATCTCGGGCCAGGAC-TAMRA-3′。引物（19 bp）與TaqMan 探針由寶生物工程（大連）有限公司合成，并經(jīng)基于蛋白質(zhì)和DNA數(shù)據(jù)庫的相似性檢索工具（BLAST）的相似性比較，期望值E值小于0.01。開蓋前短暫離心，加入經(jīng)焦碳酸二乙酯（DEPC）處理的重蒸水（ddH2O）稀釋至濃度為10－2nmol/μl，－20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.3 定量PCR擴(kuò)增。總體積為30μl，含10×Buffer緩沖液3μl、0.025 mol/L MgCl23μl、0.01 mol/L dNTP 0.9μl、0.01 mol/L上游引物1μl、0.01 mol/L下游引物1μl、0.01 mol/L TaqMan探針1μl、Taq DNA Polymerse（5 U/μl）0.3μl、焦碳酸二乙酯處理過的水14.8 μl、DNA 模板5 μl。擴(kuò)增條件為：94 ℃1 min；94 ℃10 s，55 ℃30 s，72 ℃1 min，45 個(gè)循環(huán)。在PCR 反應(yīng)過程中，設(shè)定無DNA樣品的空白管為陰性對(duì)照。

2.3.4 引物的特異性檢查。分別將AD169、KOS、HG252、M33病毒和TOA02 進(jìn)行定量PCR 擴(kuò)增，并使用Primer Express v 3.0 軟件對(duì)上下游引物的退火溫度（Tm值）和GC 含量、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、錯(cuò)配現(xiàn)象、引物二聚體等進(jìn)行分析，評(píng)價(jià)引物的特異性。

2.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。用TOA02標(biāo)準(zhǔn)模板樣品（1×108copies/ml）的DNA模板按10倍梯度進(jìn)行稀釋配制成1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102copies/ml 7個(gè)濃度梯度，制成標(biāo)準(zhǔn)系列模板，自每個(gè)稀釋模板中取樣5μl，分別加至30μl的反應(yīng)體系中，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。每個(gè)稀釋模板做5 個(gè)復(fù)孔，根據(jù)獲得的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（ct值），擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.6 精密度檢測(cè)。將TOA02 標(biāo)準(zhǔn)模板樣品（1×108copies/ml）的DNA模板用生理氯化鈉溶液稀釋為1×107、1×105、1×103copies/ml 3個(gè)濃度梯度，每一濃度樣品做5個(gè)復(fù)孔。在樣品配制的第1 天，對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)并計(jì)算每一濃度樣品的RSD，以考察標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗(yàn)內(nèi)精密度；分別在第1、3、5天檢測(cè)并計(jì)算樣品的RSD，以考察試驗(yàn)間精密度。

2.3.7 待測(cè)組織目的Hexon DNA copies的測(cè)定。將組織提取的DNA樣品各取5μl，加至反應(yīng)體系中，按“2.3.3”項(xiàng)下條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。繪制各樣品的動(dòng)力學(xué)曲線并獲得相應(yīng)ct值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線獲取各待測(cè)樣品中TOA02的Hexon DNA copies。在PCR反應(yīng)過程中，設(shè)定無DNA樣品的空白管為陰性對(duì)照。

2.4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 12軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行直線回歸、方差分析和相關(guān)性分析，P＜0.01表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 引物的特異性

經(jīng)檢測(cè)，引物對(duì)AD169、KOS、HG252、M33 病毒均無擴(kuò)增作用，而對(duì)TOA02 具有較高的特異性，依據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，Primer Express v 3.0 軟件顯示上游引物、下游引物無非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體形成，上游引物：Tm為54.5 ℃、GC占57.8%，下游引物：Tm為59.4 ℃、GC占68.4%。因此，該引物具有較高的特異性。

3.2 TOA02標(biāo)準(zhǔn)模板的熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

經(jīng)動(dòng)力學(xué)曲線確定每個(gè)樣品管中熒光強(qiáng)度增加到某一特定閾值（Threshold）時(shí)的ct值，即1×107、1×106、1×105、1×104、1×103copies/ml 的TOA02 標(biāo)準(zhǔn)模板樣品的ct值分別為16.42、20.71、24.76、27.95、30.82，將其與標(biāo)準(zhǔn)模板初始copies 的對(duì)數(shù)值作圖，得到該樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。依據(jù)擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，TOA02標(biāo)準(zhǔn)模板的熒光定量PCR的線性范圍為1×103～1×107copies/ml，最低定量濃度為1×103copies/ml，回歸系數(shù)大于0.96（r2＝0.97），擬合滿意。ct值每減少1 個(gè)循環(huán)，對(duì)應(yīng)的模板DNA增加倍數(shù)（Y值）的計(jì)算公式為：Y＝101/Δct，Δct＝靶DNA每稀釋10倍時(shí)平均增加的ct值。本檢測(cè)的Y＝1.8。

3.3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

TOA02 標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的試驗(yàn)內(nèi)和試驗(yàn)間精密性，試驗(yàn)內(nèi)RSD 為1.88%～3.58%（n＝5），試驗(yàn)間RSD 為1.98%～4.68%（n＝5）。

3.4 待測(cè)組織目的Hexon DNA copies的測(cè)定結(jié)果

結(jié)果顯示，對(duì)照組荷瘤裸小鼠體內(nèi)各腫瘤、血液和組織臟器中均未檢出TOA02 的Hexon DNA copies。實(shí)驗(yàn)組首次給藥后第11天，腫瘤內(nèi)TOA02 的Hexon DNA copies明顯高于血液和其他的組織臟器，其中第18 天腫瘤的Hexon DNA copies 最高，分布量依次為肝臟＞腎臟＞脾臟＞肺臟＞心臟；第18 天后，腫瘤組織中TOA02 的Hexon DNA copies 增高，而血液及各臟器組織的生物分布卻在逐漸減少；至第36天，除腫瘤組織尚能檢出外，血液和其他臟器均未檢出；在實(shí)驗(yàn)過程中骨髓、大腦、睪丸、附睪、卵巢和子宮等組織中均未檢出TOA02 的Hexon DNA copies，結(jié)果見表1（表中“-”表示未檢出）。

表1 2組荷瘤裸小鼠體內(nèi)各腫瘤、血液和組織臟器中Hexon DNA copies（組織：copies/100μg genome DNA，血液：copies/ml，n＝6）Tab 1 DNA copy numbers of Hexon in tumor，blood and organs of tumor-bearing nude mice in 2 groups（tissue：copies/100μg genome DNA，blood：copies/ml，n＝6）

4 討論

生物分布研究是載體類轉(zhuǎn)基因藥物臨床前安全性評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容，其目的在于研究載體藥物在體內(nèi)的分布情況及代謝動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，以考察該載體藥物是否擴(kuò)散到非靶組織中，特別是生殖腺，并從而預(yù)測(cè)藥物的毒性靶器官[7-8]。目前常用的載體類藥物的生物分布檢測(cè)技術(shù)是實(shí)時(shí)定量PCR，其能對(duì)初始模板序列進(jìn)行準(zhǔn)確定量，具有較高的靈敏度和特異性，而且不需要進(jìn)行PCR 后續(xù)操作[9]。選擇基因組中特異和保守的靶基因作為載體的生物標(biāo)簽是定量PCR的重要特征。本研究選用Hexon 基因作為定量PCR 的靶基因，以其copies 來表示病毒顆粒數(shù)。Hexon蛋白是腺病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，其與五鄰體蛋白和纖維蛋白一起構(gòu)成核衣殼，決定著病毒粒子的大小，且?guī)в兄饕膶俸蛠唽偬禺愋钥乖瓫Q定簇和次要的種特異性抗原決定簇[10-11]。

生物分布實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TOA02 在腫瘤組織中能良好復(fù)制，病毒載體的濃度由11 d（第3次瘤內(nèi)給藥后）的（2 240 541±1 692）copies/100 μg genome DNA增加到18 d的（13 120 285±88 210）copies/100 μg genome DNA，36 d 后仍有（336 453±23 415）copies/100 μg genome DNA的高含量。由于腫瘤細(xì)胞中有大量病毒體增殖，病毒體隨之播散入血并進(jìn)入全身各組織中。但筆者發(fā)現(xiàn)，這種分布是機(jī)會(huì)性和一過性的，因?yàn)椴《倔w是分布在血液循環(huán)較為豐富的臟器，如肝臟、腎臟、脾臟、肺臟、心臟等，而骨髓、大腦、生殖腺等并沒有分布；而且，隨著時(shí)間推移，在腫瘤中病毒含量降低時(shí)，滯留在這些臟器中的病毒體也被清除了。由此可見，TOA02在體內(nèi)應(yīng)用，特別是瘤體給藥是安全的。這主要與TOA02的作用機(jī)制有關(guān)，因?yàn)門OA02是端粒酶活性和Rb途徑缺失特異性的，特別是其啟動(dòng)子上的E2F-1 結(jié)合位點(diǎn)的作用加強(qiáng)了hTERT 啟動(dòng)子載體在hTERT（+）、Rb（－）腫瘤細(xì)胞中啟動(dòng)作用，而在hTERT（－）、Rb（+）的正常細(xì)胞中表現(xiàn)出啟動(dòng)抑制作用，因而使得其在正常細(xì)胞中幾乎不能復(fù)制[6]。

由于只有在端粒酶高活性或Rb途徑缺失的細(xì)胞中才能復(fù)制和增殖，TOA02 在非腫瘤模型的正常動(dòng)物體內(nèi)的組織細(xì)胞中不能增殖，靜脈給予后會(huì)很快被機(jī)體免疫系統(tǒng)清除，應(yīng)該不會(huì)有可檢測(cè)到的生物分布；但其能否在組織增生活躍的臟器如生殖腺中復(fù)制和滯留，有待進(jìn)一步通過TOA02 在恒河猴中的生物分布實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。

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