吳月紅 韓正兵 張心齊 周亞東 吳敏 許學(xué)偉
南極普里茲灣存在季節(jié)性的海冰區(qū)域,其表層水體物理性質(zhì)與普通大洋海水不同,影響了該生態(tài)系統(tǒng)中浮游微生物的群落結(jié)構(gòu)和功能。熒光原位顯微技術(shù)表明,γ-變形桿菌綱、放線菌綱和擬桿菌門細(xì)菌是極地海洋浮游細(xì)菌的主要類群[1],特別是Cytophaga/Flavobacter(CF)類群,在南極生態(tài)系統(tǒng)中有廣泛的分布。在南極表層細(xì)菌可培養(yǎng)微生物研究中,γ-變形桿菌綱為最主要類群,冷單胞菌屬(Psychromonas)和假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)占總分離菌株數(shù)的65.4%,在南極浮游細(xì)菌群落中具有重要作用。
由于受采樣等條件限制,目前對南極普里茲灣浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的研究相對較少。以往研究者對南極浮游細(xì)菌多樣性研究[1-2]多采用分子生物學(xué)技術(shù),這種方法能獲得較全面的微生物信息。然而分離培養(yǎng)是微生物學(xué)一項(xiàng)重要的研究,獲得的純培養(yǎng)物往往是環(huán)境微生物群落中最能反映生態(tài)環(huán)境特征的類群,是處于活性狀態(tài)下的微生物類群,這對于評估微生物與環(huán)境的關(guān)系至關(guān)重要,更是后續(xù)生理特性研究的基礎(chǔ)[3]。因此,菌株分離純化一直受到微生物學(xué)家的高度重視。
在微生物培養(yǎng)過程中,個(gè)別類型微生物由于數(shù)量占優(yōu)或生長速度較快等原因,在培養(yǎng)初期大量生長,從而掩蓋了數(shù)量少、生長速度慢的菌株;此外,高濃度的營養(yǎng)物質(zhì)對一些微生物具有毒性。寡營養(yǎng)培養(yǎng)方式是解決該問題的有效技術(shù)手段[4]。本研究采用寡營養(yǎng)培養(yǎng)方法,對南極普里茲灣內(nèi)達(dá)恩利角附近海域3個(gè)測站共12份海水樣品進(jìn)行微生物分離培養(yǎng),獲得95株細(xì)菌菌株并進(jìn)行初步分類鑒定,研究工作有助于深入認(rèn)識南極普里茲灣夏季浮游細(xì)菌群落變化及其在生態(tài)系統(tǒng)中的作用,對南極細(xì)菌資源評估與開發(fā)具有一定的指導(dǎo)意義。
第25次中國南極科學(xué)考察(2009年2月)期間,于南極普里茲灣內(nèi)達(dá)恩利角附近海域利用Seabird 911 Plus CTD采水器進(jìn)行海水樣品采集,站位信息與位置見表1和圖1。采樣時(shí)間為盛夏,海區(qū)浮冰消融,融冰對海洋上層水體產(chǎn)生淡化作用,導(dǎo)致普里茲灣表層水溫較高、鹽度較小、密度較低。每個(gè)測站分別采集了0、50、100和200 m水樣,樣品在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行之前一直處于4℃和避光保存。
表1 站位信息表Table 1.Information of the sampling stations
圖1 普里茲灣站位圖Fig.1.Sampling stations in Prydz Bay,Antarctic
采用寡營養(yǎng)陳海水培養(yǎng)基(LMEB培養(yǎng)基)分離純化南極普里茲灣真光層水體微生物。LMEB配方為南極普里茲灣天然海水、蛋白胨0.5g/L和酵母提取物0.1g/L。固體培養(yǎng)基添加15 g/L瓊脂,滅菌后倒平板。
水樣依次稀釋10倍和100倍并涂布LMEB培養(yǎng)基,每個(gè)梯度涂布3塊平板,25℃培養(yǎng)至長出明顯菌落。根據(jù)菌落形態(tài)特征,挑取不同的單菌落在Marine 2216agar(BD)平板上劃線,25℃培養(yǎng),挑取單菌落再次純化后-80℃甘油管和凍干管保存。
采用活體觀察、透射電鏡觀察和掃描電鏡觀察三種方式觀察菌株形態(tài)。
活體觀察:取對數(shù)生長期菌液涂于載玻片上,通過光學(xué)顯微鏡(Olympus BX40)觀察細(xì)胞運(yùn)動性及形態(tài)特征。
透射電鏡觀察:取對數(shù)生長期的劃線斜面,刮取菌體懸浮于無菌水制成菌懸液。將菌懸液滴于銅網(wǎng)上并用濾紙吸去多余液體,然后用醋酸雙氧鈾染色。制作細(xì)胞超薄切片時(shí),以2.5%戊二醛固定細(xì)胞,并通過鋨酸固定、乙醇脫水、包埋、切片和醋酸雙氧鈾染色等步驟制備切片樣品。透射電鏡(JEM-1230)下觀察細(xì)胞的形態(tài)、大小、分裂方式、芽孢產(chǎn)生、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、內(nèi)涵體和鞭毛數(shù)量及形態(tài)等情況。透射電鏡觀察在浙江大學(xué)分析測試中心華家池分中心完成。
掃描電鏡觀察:取對數(shù)生長期的劃線斜面刮取菌體制成菌懸液,加2.5%戊二醛固定,并通過鋨酸固定、乙醇脫水、包埋、臨界點(diǎn)干燥、粘臺和噴金等步驟制備樣品。掃描電鏡(Cambridge S260)下觀察細(xì)胞的形態(tài)、大小和芽孢產(chǎn)生等。掃描電鏡觀察在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院電鏡中心完成。
菌株于DifcoTMMarine broth 2216培養(yǎng)基中在25℃下培養(yǎng)至混濁(OD600nm>1.0)。采用細(xì)菌基因組快速提取試劑盒N1152(東盛生物)抽提細(xì)菌總DNA。
采用細(xì)菌特異性引物 Eubac27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,Eubac1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。
PCR反應(yīng)體系為50μL,10*buffer 5μL,dNTP mixture(2.5 mM each)0.5μL,primer Eubac27F(4μM)1μL,primer Eubac1492R(4μM)1μL,Taq(2.5 U/μL)0.5μL,模板 50 ng,用水補(bǔ)足至50μL。
PCR反應(yīng)條件為 94℃,5 min;94℃,30 s;55℃,30 s;72℃,1 min 15 s;33次循環(huán);72℃延伸 8 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用ABI測序儀測序,測序引物為Eubac27F,測定的序列長度大于500 bp。測定的序列通過EzTaxon-e在線比對程序(http:∥eztaxon-e.ezbiocloud.net/)與數(shù)據(jù)庫中的已有細(xì)菌16S rDNA序列進(jìn)行比對分析。序列相似性低于97%的菌株,進(jìn)一步采用TA克隆方法獲取16S rRNA基因,樣品送上海生工生物工程有限公司測序,測序引物為M13-F和RV-M,序列長度大于1 300 bp,大于16S rDNA全長序列的90%。
根據(jù)在線比對和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果,將獲得的16S rRNA基因序列歸類,定義相似性<97%的序列代表不同的分類單元。采用物種多樣性(Diversity)、豐富度(Richness)、均勻度(Eveness)和優(yōu)勢度(Dominance)指數(shù)進(jìn)行多樣性分析。對各分離菌株及其相近菌株的16S rRNA基因序列采用Mega 5進(jìn)行多序列匹配比對,采用鄰接法(Neighbor-joiningmethod)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,并通過自舉分析(Bootstrap)進(jìn)行置信度檢測,自舉數(shù)據(jù)集為1 000次。
根據(jù)菌落大小、形態(tài)和顏色等特征,挑取分離平板上的單菌落進(jìn)行四分劃線純化,最終從南極水樣中分離得到95株菌。以Ar-22為例,菌落淡黃色,圓形,略微凸起,直徑為1—2 mm,顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面有凸起(圖2)。
圖2 菌株Ar-22細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu).(a)掃描電鏡圖;(b)透射電鏡圖Fig.2.Cellmorphology and ultrastructure of strain Ar-22.(a)Scanning electron micrographs;(b)Transmission electronmicrographs
采用細(xì)菌通用引物,擴(kuò)增獲取了95株菌株的16S rDNA序列。序列遞交至GenBank數(shù)據(jù)庫(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov),登錄號為JX844423—JX844517。分子鑒定結(jié)果表明,95株菌株可劃分至35個(gè)不同的分類單元。分離獲得 α-變形桿菌綱(Alphaproteobactia)57株,占總菌數(shù)的 60%;γ-變形桿菌綱(Gammaproteobacteria)23株,占總菌數(shù)的24.2%;擬桿菌門(Bacteroidetes)15株占總菌株15.8%。普里茲灣真光層水體中細(xì)菌垂直分布在0、50、100和200 m的4個(gè)水層中,α-變形桿菌綱均為優(yōu)勢類群(61.9%、52.6%、61.3%和62.5%),其次為γ-變形桿菌綱(28.6%、26.3%、25.8%和16.7%)和擬桿菌門(9.5%、21.1%、12.9%和21.1%)。普里茲灣真光層水體中細(xì)菌水平分布表現(xiàn)為在P2-8、P2-11和P2-14三個(gè)站位中,α-變形桿菌綱為優(yōu)勢類群(44.4%、58.3%和 70.5%),其次為 γ-變形桿菌綱(37.0%、25%和 15.9%)和擬桿菌門(18.5%、16.7%和 13.6%)。
系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明,大多數(shù)菌株與之前分離自海洋或其他環(huán)境的菌株具有較高的16S rDNA序列相似性(>97%),但也發(fā)現(xiàn)5個(gè)菌株與已報(bào)道菌株間的序列相似性較低,例如菌株Ar-112、Ar-125與 Bizionia echini KMM 6177T(96.3%),Ar-128與 Hoefleaalexandrii AM1V30T(96.9%),Ar-142與 Marinobacteralgicola DG893T(96.1%),Ar-121與Persicivirgaxylanidelens SW256T(95.5%)間的序列相似性均低于97%,它們可能代表了一些新的分類單元。
物種多樣性是把物種的數(shù)目和個(gè)體數(shù)目分配狀況(豐度和均勻度)結(jié)合起來考慮的一個(gè)統(tǒng)計(jì)量,它反映了生物群落和生態(tài)系統(tǒng)的特征,例如結(jié)構(gòu)類型、發(fā)展階段、穩(wěn)定程度和生境差異等等。Shannon多樣性指數(shù)、Margalef豐富度指數(shù)是對稀有物種敏感的指數(shù),普里茲灣海區(qū)不同水層的這些指數(shù)具有明顯的差異,不同站位多樣性指數(shù)差異不明顯,但豐富度指數(shù)差異較大。與之相反,Shannon均勻度指數(shù)和Berger-Parker優(yōu)勢度指數(shù)屬于對富集種相對敏感的指數(shù)。普里茲灣海區(qū)不同水層這些指數(shù)差異不明顯,不同站位這些指數(shù)差異也不明顯(表2)??傮w而言,不同水層的多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)和均勻度指數(shù)具有一定的相關(guān)性。在對數(shù)級數(shù)分布模型不是最好的理論分布時(shí),其多樣性指數(shù)也能較好地反應(yīng)物種的多樣性狀況,并且不受樣方大小的影響。通過多種方式綜合評價(jià)物種多樣性,可有效避免單一指數(shù)評價(jià)的偏頗。
普里茲灣海區(qū)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)受到季節(jié)、溫度、營養(yǎng)鹽和溶解氧等因素影響而發(fā)生變化。P2-14位于陸架區(qū),P2-8和P2-11位于陸坡區(qū),3個(gè)站位的細(xì)菌多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)具有鮮明差異。位于陸架區(qū)的P2-14站位Shannon多樣性指數(shù)和Margalef豐富度指數(shù)最高,而位于陸坡區(qū)的P2-11和P2-8站位Shannon多樣性指數(shù)和Margalef豐富度指數(shù)則相對較低。這種差異可能和浮游植物生物量和生產(chǎn)力有關(guān),浮游植物的代謝產(chǎn)物為細(xì)菌提供豐富的棲息條件。蔡昱明等研究表明,南極普里茲灣陸架區(qū)浮游植物生物量和生產(chǎn)力均較高,而大陸坡浮游植物的生物量和生產(chǎn)力則明顯降低[5]。由此推論,陸坡區(qū)和陸架區(qū)的微生物多樣性指數(shù)與浮游植物生物量和生產(chǎn)力呈正相關(guān)。
表2 南極普里茲灣西部細(xì)菌類群數(shù)量及多樣性指數(shù)Table 2.Number of the cultured marine bacteria and diversity indices at the western part of the Prydz Bay,Antarctic
在3個(gè)站位的不同水層中,0 m水層可培養(yǎng)細(xì)菌Shannon多樣性指數(shù)最低,50 m水層可培養(yǎng)細(xì)菌的Shannon多樣性指數(shù)和Margalef豐富度指數(shù)最高,100 m和200 m水層可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性指數(shù)差距不大,這種差異可能和營養(yǎng)鹽豐富程度有關(guān)。在海洋生態(tài)環(huán)境中,海洋浮游細(xì)菌可以利用溶解性無機(jī)氮(Dissolved Inorganic Nitrogen,DIN)和溶解性無機(jī)磷(Dissolved Inorganic Phosphorus,DIP)作為氮源和磷源。Tupas和Koike在海洋浮游細(xì)菌室內(nèi)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),DIN作為主要的N源,提供了55%—99%的總N吸收,極大地促進(jìn)了細(xì)菌的生長和新陳代謝[6]。此外,也有證據(jù)表明無機(jī)磷酸鹽也是浮游細(xì)菌的生物量和生產(chǎn)重要限制因子[7]。韓正兵等[8]研究發(fā)現(xiàn)3個(gè)站位的三項(xiàng)營養(yǎng)鹽(硝酸鹽、磷酸鹽和硅酸鹽)最小值均出現(xiàn)在表層,50 m深度以內(nèi),各項(xiàng)營養(yǎng)鹽含量快速增加,50 m達(dá)到最高值。三項(xiàng)營養(yǎng)鹽垂直變化趨勢和可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性指數(shù)變化趨勢基本一致,由此推論,0 m和50 m水層微生物多樣性指數(shù)與營養(yǎng)鹽垂直分布呈正相關(guān)。100 m以深各項(xiàng)營養(yǎng)鹽含量基本維持不變,但受到光強(qiáng)減弱的影響,浮游植物光合作用能力減弱,100 m以深浮游植物生物量極低,溶解氧含量也極低。由此推論,100 m和200 m水層細(xì)菌多樣性指數(shù)還與浮游植物生物量和溶解氧相關(guān)。
分離獲得的3個(gè)細(xì)菌類群中,α-變形桿菌綱為優(yōu)勢類群。在 P2-8、P2-11和 P2-14,3個(gè)站位以及0、50、100和200 m的4個(gè)真光層水層中,α-變形桿菌綱均為優(yōu)勢類群。這一結(jié)果與已報(bào)道的南極周邊海域浮游細(xì)菌多樣性研究結(jié)果有所差異。Zeng等[9]采用可培養(yǎng)方法分離培養(yǎng)南極普里茲灣表層水體的微生物,僅分離到γ-變形桿菌綱微生物。Giudice采用熒光原位顯微技術(shù)檢測南極周邊海域浮游細(xì)菌多樣性,研究結(jié)果表明浮游細(xì)菌主要分為5個(gè)類群:γ-變形桿菌綱(67.8%)、放線菌(16.7%)、α-變形桿菌綱(9.4%)、擬桿菌門(5.3%)和后壁菌門(0.8%)。南極周邊海域的浮游細(xì)菌中存在大量α-變形桿菌綱細(xì)菌,但非優(yōu)勢類群[1]。這些研究結(jié)果的差異,可能是由于采樣季節(jié)差異、研究手段不同、以及培養(yǎng)過程選擇性造成的。
本研究在南極普里茲灣分離得到α-變形桿菌綱細(xì)菌57株,隸屬于13個(gè)屬(圖3),達(dá)到總菌株數(shù)量的60%。亞硫酸桿菌(Sulfitobacter sp.)在4個(gè)水層中均有分布,能氧化亞硫酸鹽提供代謝能量[10],也有亞硫酸桿菌代謝產(chǎn)物的研究報(bào)道[11]。
γ-變形桿菌綱的細(xì)菌具有很強(qiáng)的適應(yīng)性,能利用多種碳源物質(zhì)進(jìn)行生長[12],它們在不同環(huán)境的生態(tài)系統(tǒng)中都有廣泛的分布[13]。本研究在南極普里茲灣分離得到的γ-變形桿菌綱包括交替單胞菌屬(Alteromonas),假單胞菌屬(Pseudomonas),海桿菌屬(Marinobacter)和食烷菌屬(Alcanivorax)4個(gè)屬(圖3)。其中,海桿菌屬(Marinobacter)多數(shù)為兼性好養(yǎng)菌,其生存范圍較為寬廣[14],是海水中可培養(yǎng)的優(yōu)勢細(xì)菌,在各水層均有分布。食烷菌屬(Alcanivorax)是專性降解烷烴的海洋細(xì)菌,易出現(xiàn)在石油污染的海洋環(huán)境。一般認(rèn)為在干凈的環(huán)境中,這類專性降解菌的豐度是常規(guī)手段檢測不到的[15-17]。本文在P2-8和P2-11站位的0、100和200 m水層中均分離到了食烷菌,分別屬于已報(bào)道的2個(gè)物種。食烷菌的出現(xiàn)表明普里茲灣西部海水中有濃度較高的烴類存在,是否與海底油藏有一定關(guān)系尚不能明確。通過定量分析該類菌的豐度與水體中烷烴含量間的對應(yīng)關(guān)系,可能得出更可信的結(jié)論。
黃桿菌是一類廣泛存在于極地低溫環(huán)境的細(xì)菌。熒光原位顯微技術(shù)表明,黃桿菌是極地海洋浮游細(xì)菌的主要類群之一[1]。不同的黃桿菌具有截然不同的生活環(huán)境和生存策略[18],在南極生態(tài)系統(tǒng)中有廣泛的分布。本研究即在不同水層均分離得到黃桿菌,共計(jì)15株,分別隸屬于黃桿菌科下的8個(gè)屬(圖3),其中Croceibacter屬在各水層均有分布。
普里茲灣真光層水體中細(xì)菌垂直分布與營養(yǎng)鹽和溶解氧濃度存在關(guān)聯(lián)。表層水體營養(yǎng)鹽濃度較低,可培養(yǎng)細(xì)菌Shannon多樣性指數(shù)最低,Berger-Parker優(yōu)勢度指數(shù)最高;隨著深度增加,50 m水層細(xì)菌多樣性指數(shù)高于其他水層,100和200 m水層差距不明顯。普里茲灣真光層水體中細(xì)菌水平分布與浮游植物生物量和生產(chǎn)力水平存在關(guān)聯(lián)。P2-14位于陸架區(qū),該站位Shannon多樣性指數(shù)和Margalef豐富度指數(shù)最高;P2-11和P2-8位于陸坡,多樣性和豐富度指數(shù)相對較低。
在微生物可培養(yǎng)研究過程中,應(yīng)盡可能使用模擬自然條件的培養(yǎng)基。研究采用寡營養(yǎng)陳海水培養(yǎng)基,相比其他普通培養(yǎng)基,該培養(yǎng)基降低了營養(yǎng)成分濃度,與自然環(huán)境近似,從而大幅降低因營養(yǎng)物質(zhì)充足導(dǎo)致生長快速菌株占據(jù)更多生態(tài)位的可能。通過這種培養(yǎng)方式,我們發(fā)現(xiàn)多個(gè)微生物新分類單元,表明南極普里茲灣真光層水體中蘊(yùn)藏著大量浮游細(xì)菌資源。深入了解細(xì)菌在極地生態(tài)系統(tǒng)中的作用,仍需發(fā)展合適的培養(yǎng)方法獲取純培養(yǎng)菌株,并在此基礎(chǔ)上開展生理學(xué)等方面的研究工作。
圖3 南極普里茲灣可培養(yǎng)細(xì)菌16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3.Phylogenetic tree of 16S rRNA gene sequences of the strains isolated from the seawater at the Prydz Bay,Antarctic.The tree was constructed by the neighbour-joining treemethod,with Haloferaxlarsenii as the out-group.Bootstrap values are based on 1000 replicates;only values>60%are show.Bar,0.02 substitutions per nucleotide position
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