吳月紅 韓正兵 張心齊 周亞東 吳敏 許學(xué)偉

0 引言

南極普里茲灣存在季節(jié)性的海冰區(qū)域，其表層水體物理性質(zhì)與普通大洋海水不同，影響了該生態(tài)系統(tǒng)中浮游微生物的群落結(jié)構(gòu)和功能。熒光原位顯微技術(shù)表明，γ-變形桿菌綱、放線菌綱和擬桿菌門細(xì)菌是極地海洋浮游細(xì)菌的主要類群［1］，特別是Cytophaga／Flavobacter（CF）類群，在南極生態(tài)系統(tǒng)中有廣泛的分布。在南極表層細(xì)菌可培養(yǎng)微生物研究中，γ-變形桿菌綱為最主要類群，冷單胞菌屬（Psychromonas）和假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）占總分離菌株數(shù)的65.4%，在南極浮游細(xì)菌群落中具有重要作用。

由于受采樣等條件限制，目前對南極普里茲灣浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的研究相對較少。以往研究者對南極浮游細(xì)菌多樣性研究［1-2］多采用分子生物學(xué)技術(shù)，這種方法能獲得較全面的微生物信息。然而分離培養(yǎng)是微生物學(xué)一項(xiàng)重要的研究，獲得的純培養(yǎng)物往往是環(huán)境微生物群落中最能反映生態(tài)環(huán)境特征的類群，是處于活性狀態(tài)下的微生物類群，這對于評估微生物與環(huán)境的關(guān)系至關(guān)重要，更是后續(xù)生理特性研究的基礎(chǔ)［3］。因此，菌株分離純化一直受到微生物學(xué)家的高度重視。

在微生物培養(yǎng)過程中，個(gè)別類型微生物由于數(shù)量占優(yōu)或生長速度較快等原因，在培養(yǎng)初期大量生長，從而掩蓋了數(shù)量少、生長速度慢的菌株；此外，高濃度的營養(yǎng)物質(zhì)對一些微生物具有毒性。寡營養(yǎng)培養(yǎng)方式是解決該問題的有效技術(shù)手段［4］。本研究采用寡營養(yǎng)培養(yǎng)方法，對南極普里茲灣內(nèi)達(dá)恩利角附近海域3個(gè)測站共12份海水樣品進(jìn)行微生物分離培養(yǎng)，獲得95株細(xì)菌菌株并進(jìn)行初步分類鑒定，研究工作有助于深入認(rèn)識南極普里茲灣夏季浮游細(xì)菌群落變化及其在生態(tài)系統(tǒng)中的作用，對南極細(xì)菌資源評估與開發(fā)具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

第25次中國南極科學(xué)考察（2009年2月）期間，于南極普里茲灣內(nèi)達(dá)恩利角附近海域利用Seabird 911 Plus CTD采水器進(jìn)行海水樣品采集，站位信息與位置見表1和圖1。采樣時(shí)間為盛夏，海區(qū)浮冰消融，融冰對海洋上層水體產(chǎn)生淡化作用，導(dǎo)致普里茲灣表層水溫較高、鹽度較小、密度較低。每個(gè)測站分別采集了0、50、100和200 m水樣，樣品在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行之前一直處于4℃和避光保存。

表1 站位信息表Table 1.Information of the sampling stations

圖1 普里茲灣站位圖Fig.1.Sampling stations in Prydz Bay，Antarctic

1.2 菌株分離純化

采用寡營養(yǎng)陳海水培養(yǎng)基（LMEB培養(yǎng)基）分離純化南極普里茲灣真光層水體微生物。LMEB配方為南極普里茲灣天然海水、蛋白胨0.5g／L和酵母提取物0.1g／L。固體培養(yǎng)基添加15 g／L瓊脂，滅菌后倒平板。

水樣依次稀釋10倍和100倍并涂布LMEB培養(yǎng)基，每個(gè)梯度涂布3塊平板，25℃培養(yǎng)至長出明顯菌落。根據(jù)菌落形態(tài)特征，挑取不同的單菌落在Marine 2216agar（BD）平板上劃線，25℃培養(yǎng)，挑取單菌落再次純化后－80℃甘油管和凍干管保存。

1.3 菌株形態(tài)特征觀察

采用活體觀察、透射電鏡觀察和掃描電鏡觀察三種方式觀察菌株形態(tài)。

活體觀察：取對數(shù)生長期菌液涂于載玻片上，通過光學(xué)顯微鏡（Olympus BX40）觀察細(xì)胞運(yùn)動性及形態(tài)特征。

透射電鏡觀察：取對數(shù)生長期的劃線斜面，刮取菌體懸浮于無菌水制成菌懸液。將菌懸液滴于銅網(wǎng)上并用濾紙吸去多余液體，然后用醋酸雙氧鈾染色。制作細(xì)胞超薄切片時(shí)，以2.5%戊二醛固定細(xì)胞，并通過鋨酸固定、乙醇脫水、包埋、切片和醋酸雙氧鈾染色等步驟制備切片樣品。透射電鏡（JEM-1230）下觀察細(xì)胞的形態(tài)、大小、分裂方式、芽孢產(chǎn)生、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、內(nèi)涵體和鞭毛數(shù)量及形態(tài)等情況。透射電鏡觀察在浙江大學(xué)分析測試中心華家池分中心完成。

掃描電鏡觀察：取對數(shù)生長期的劃線斜面刮取菌體制成菌懸液，加2.5%戊二醛固定，并通過鋨酸固定、乙醇脫水、包埋、臨界點(diǎn)干燥、粘臺和噴金等步驟制備樣品。掃描電鏡（Cambridge S260）下觀察細(xì)胞的形態(tài)、大小和芽孢產(chǎn)生等。掃描電鏡觀察在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院電鏡中心完成。

1.4 菌株基因組總DNA提取

菌株于DifcoTMMarine broth 2216培養(yǎng)基中在25℃下培養(yǎng)至混濁（OD600nm＞1.0）。采用細(xì)菌基因組快速提取試劑盒N1152（東盛生物）抽提細(xì)菌總DNA。

1.5 16S rDNA序列擴(kuò)增和鑒定

采用細(xì)菌特異性引物 Eubac27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，Eubac1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

PCR反應(yīng)體系為50μL，10*buffer 5μL，dNTP mixture（2.5 mM each）0.5μL，primer Eubac27F（4μM）1μL，primer Eubac1492R（4μM）1μL，Taq（2.5 U／μL）0.5μL，模板 50 ng，用水補(bǔ)足至50μL。

PCR反應(yīng)條件為 94℃，5 min；94℃，30 s；55℃，30 s；72℃，1 min 15 s；33次循環(huán)；72℃延伸 8 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用ABI測序儀測序，測序引物為Eubac27F，測定的序列長度大于500 bp。測定的序列通過EzTaxon-e在線比對程序（http：∥eztaxon-e.ezbiocloud.net／）與數(shù)據(jù)庫中的已有細(xì)菌16S rDNA序列進(jìn)行比對分析。序列相似性低于97%的菌株，進(jìn)一步采用TA克隆方法獲取16S rRNA基因，樣品送上海生工生物工程有限公司測序，測序引物為M13-F和RV-M，序列長度大于1 300 bp，大于16S rDNA全長序列的90%。

1.6 細(xì)菌多樣性分析

根據(jù)在線比對和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，將獲得的16S rRNA基因序列歸類，定義相似性＜97%的序列代表不同的分類單元。采用物種多樣性（Diversity）、豐富度（Richness）、均勻度（Eveness）和優(yōu)勢度（Dominance）指數(shù)進(jìn)行多樣性分析。對各分離菌株及其相近菌株的16S rRNA基因序列采用Mega 5進(jìn)行多序列匹配比對，采用鄰接法（Neighbor-joiningmethod）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并通過自舉分析（Bootstrap）進(jìn)行置信度檢測，自舉數(shù)據(jù)集為1 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 南極真光層水體細(xì)菌分離與分子鑒定

根據(jù)菌落大小、形態(tài)和顏色等特征，挑取分離平板上的單菌落進(jìn)行四分劃線純化，最終從南極水樣中分離得到95株菌。以Ar-22為例，菌落淡黃色，圓形，略微凸起，直徑為1—2 mm，顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面有凸起（圖2）。

圖2 菌株Ar-22細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu).（a）掃描電鏡圖；（b）透射電鏡圖Fig.2.Cellmorphology and ultrastructure of strain Ar-22.（a）Scanning electron micrographs；（b）Transmission electronmicrographs

采用細(xì)菌通用引物，擴(kuò)增獲取了95株菌株的16S rDNA序列。序列遞交至GenBank數(shù)據(jù)庫（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov），登錄號為JX844423—JX844517。分子鑒定結(jié)果表明，95株菌株可劃分至35個(gè)不同的分類單元。分離獲得 α-變形桿菌綱（Alphaproteobactia）57株，占總菌數(shù)的 60%；γ-變形桿菌綱（Gammaproteobacteria）23株，占總菌數(shù)的24.2%；擬桿菌門（Bacteroidetes）15株占總菌株15.8%。普里茲灣真光層水體中細(xì)菌垂直分布在0、50、100和200 m的4個(gè)水層中，α-變形桿菌綱均為優(yōu)勢類群（61.9%、52.6%、61.3%和62.5%），其次為γ-變形桿菌綱（28.6%、26.3%、25.8%和16.7%）和擬桿菌門（9.5%、21.1%、12.9%和21.1%）。普里茲灣真光層水體中細(xì)菌水平分布表現(xiàn)為在P2-8、P2-11和P2-14三個(gè)站位中，α-變形桿菌綱為優(yōu)勢類群（44.4%、58.3%和 70.5%），其次為 γ-變形桿菌綱（37.0%、25%和 15.9%）和擬桿菌門（18.5%、16.7%和 13.6%）。

系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，大多數(shù)菌株與之前分離自海洋或其他環(huán)境的菌株具有較高的16S rDNA序列相似性（＞97%），但也發(fā)現(xiàn)5個(gè)菌株與已報(bào)道菌株間的序列相似性較低，例如菌株Ar-112、Ar-125與 Bizionia echini KMM 6177T（96.3%），Ar-128與 Hoefleaalexandrii AM1V30T（96.9%），Ar-142與 Marinobacteralgicola DG893T（96.1%），Ar-121與Persicivirgaxylanidelens SW256T（95.5%）間的序列相似性均低于97%，它們可能代表了一些新的分類單元。

2.2 南極水樣細(xì)菌多樣性分析

物種多樣性是把物種的數(shù)目和個(gè)體數(shù)目分配狀況（豐度和均勻度）結(jié)合起來考慮的一個(gè)統(tǒng)計(jì)量，它反映了生物群落和生態(tài)系統(tǒng)的特征，例如結(jié)構(gòu)類型、發(fā)展階段、穩(wěn)定程度和生境差異等等。Shannon多樣性指數(shù)、Margalef豐富度指數(shù)是對稀有物種敏感的指數(shù)，普里茲灣海區(qū)不同水層的這些指數(shù)具有明顯的差異，不同站位多樣性指數(shù)差異不明顯，但豐富度指數(shù)差異較大。與之相反，Shannon均勻度指數(shù)和Berger-Parker優(yōu)勢度指數(shù)屬于對富集種相對敏感的指數(shù)。普里茲灣海區(qū)不同水層這些指數(shù)差異不明顯，不同站位這些指數(shù)差異也不明顯（表2）?？傮w而言，不同水層的多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)和均勻度指數(shù)具有一定的相關(guān)性。在對數(shù)級數(shù)分布模型不是最好的理論分布時(shí)，其多樣性指數(shù)也能較好地反應(yīng)物種的多樣性狀況，并且不受樣方大小的影響。通過多種方式綜合評價(jià)物種多樣性，可有效避免單一指數(shù)評價(jià)的偏頗。

普里茲灣海區(qū)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)受到季節(jié)、溫度、營養(yǎng)鹽和溶解氧等因素影響而發(fā)生變化。P2-14位于陸架區(qū)，P2-8和P2-11位于陸坡區(qū)，3個(gè)站位的細(xì)菌多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)具有鮮明差異。位于陸架區(qū)的P2-14站位Shannon多樣性指數(shù)和Margalef豐富度指數(shù)最高，而位于陸坡區(qū)的P2-11和P2-8站位Shannon多樣性指數(shù)和Margalef豐富度指數(shù)則相對較低。這種差異可能和浮游植物生物量和生產(chǎn)力有關(guān)，浮游植物的代謝產(chǎn)物為細(xì)菌提供豐富的棲息條件。蔡昱明等研究表明，南極普里茲灣陸架區(qū)浮游植物生物量和生產(chǎn)力均較高，而大陸坡浮游植物的生物量和生產(chǎn)力則明顯降低［5］。由此推論，陸坡區(qū)和陸架區(qū)的微生物多樣性指數(shù)與浮游植物生物量和生產(chǎn)力呈正相關(guān)。

表2 南極普里茲灣西部細(xì)菌類群數(shù)量及多樣性指數(shù)Table 2.Number of the cultured marine bacteria and diversity indices at the western part of the Prydz Bay，Antarctic

在3個(gè)站位的不同水層中，0 m水層可培養(yǎng)細(xì)菌Shannon多樣性指數(shù)最低，50 m水層可培養(yǎng)細(xì)菌的Shannon多樣性指數(shù)和Margalef豐富度指數(shù)最高，100 m和200 m水層可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性指數(shù)差距不大，這種差異可能和營養(yǎng)鹽豐富程度有關(guān)。在海洋生態(tài)環(huán)境中，海洋浮游細(xì)菌可以利用溶解性無機(jī)氮（Dissolved Inorganic Nitrogen，DIN）和溶解性無機(jī)磷（Dissolved Inorganic Phosphorus，DIP）作為氮源和磷源。Tupas和Koike在海洋浮游細(xì)菌室內(nèi)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DIN作為主要的N源，提供了55%—99%的總N吸收，極大地促進(jìn)了細(xì)菌的生長和新陳代謝［6］。此外，也有證據(jù)表明無機(jī)磷酸鹽也是浮游細(xì)菌的生物量和生產(chǎn)重要限制因子［7］。韓正兵等［8］研究發(fā)現(xiàn)3個(gè)站位的三項(xiàng)營養(yǎng)鹽（硝酸鹽、磷酸鹽和硅酸鹽）最小值均出現(xiàn)在表層，50 m深度以內(nèi)，各項(xiàng)營養(yǎng)鹽含量快速增加，50 m達(dá)到最高值。三項(xiàng)營養(yǎng)鹽垂直變化趨勢和可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性指數(shù)變化趨勢基本一致，由此推論，0 m和50 m水層微生物多樣性指數(shù)與營養(yǎng)鹽垂直分布呈正相關(guān)。100 m以深各項(xiàng)營養(yǎng)鹽含量基本維持不變，但受到光強(qiáng)減弱的影響，浮游植物光合作用能力減弱，100 m以深浮游植物生物量極低，溶解氧含量也極低。由此推論，100 m和200 m水層細(xì)菌多樣性指數(shù)還與浮游植物生物量和溶解氧相關(guān)。

2.3 南極水樣細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分析

分離獲得的3個(gè)細(xì)菌類群中，α-變形桿菌綱為優(yōu)勢類群。在 P2-8、P2-11和 P2-14，3個(gè)站位以及0、50、100和200 m的4個(gè)真光層水層中，α-變形桿菌綱均為優(yōu)勢類群。這一結(jié)果與已報(bào)道的南極周邊海域浮游細(xì)菌多樣性研究結(jié)果有所差異。Zeng等［9］采用可培養(yǎng)方法分離培養(yǎng)南極普里茲灣表層水體的微生物，僅分離到γ-變形桿菌綱微生物。Giudice采用熒光原位顯微技術(shù)檢測南極周邊海域浮游細(xì)菌多樣性，研究結(jié)果表明浮游細(xì)菌主要分為5個(gè)類群：γ-變形桿菌綱（67.8%）、放線菌（16.7%）、α-變形桿菌綱（9.4%）、擬桿菌門（5.3%）和后壁菌門（0.8%）。南極周邊海域的浮游細(xì)菌中存在大量α-變形桿菌綱細(xì)菌，但非優(yōu)勢類群［1］。這些研究結(jié)果的差異，可能是由于采樣季節(jié)差異、研究手段不同、以及培養(yǎng)過程選擇性造成的。

本研究在南極普里茲灣分離得到α-變形桿菌綱細(xì)菌57株，隸屬于13個(gè)屬（圖3），達(dá)到總菌株數(shù)量的60%。亞硫酸桿菌（Sulfitobacter sp.）在4個(gè)水層中均有分布，能氧化亞硫酸鹽提供代謝能量［10］，也有亞硫酸桿菌代謝產(chǎn)物的研究報(bào)道［11］。

γ-變形桿菌綱的細(xì)菌具有很強(qiáng)的適應(yīng)性，能利用多種碳源物質(zhì)進(jìn)行生長［12］，它們在不同環(huán)境的生態(tài)系統(tǒng)中都有廣泛的分布［13］。本研究在南極普里茲灣分離得到的γ-變形桿菌綱包括交替單胞菌屬（Alteromonas），假單胞菌屬（Pseudomonas），海桿菌屬（Marinobacter）和食烷菌屬（Alcanivorax）4個(gè)屬（圖3）。其中，海桿菌屬（Marinobacter）多數(shù)為兼性好養(yǎng)菌，其生存范圍較為寬廣［14］，是海水中可培養(yǎng)的優(yōu)勢細(xì)菌，在各水層均有分布。食烷菌屬（Alcanivorax）是專性降解烷烴的海洋細(xì)菌，易出現(xiàn)在石油污染的海洋環(huán)境。一般認(rèn)為在干凈的環(huán)境中，這類專性降解菌的豐度是常規(guī)手段檢測不到的［15-17］。本文在P2-8和P2-11站位的0、100和200 m水層中均分離到了食烷菌，分別屬于已報(bào)道的2個(gè)物種。食烷菌的出現(xiàn)表明普里茲灣西部海水中有濃度較高的烴類存在，是否與海底油藏有一定關(guān)系尚不能明確。通過定量分析該類菌的豐度與水體中烷烴含量間的對應(yīng)關(guān)系，可能得出更可信的結(jié)論。

黃桿菌是一類廣泛存在于極地低溫環(huán)境的細(xì)菌。熒光原位顯微技術(shù)表明，黃桿菌是極地海洋浮游細(xì)菌的主要類群之一［1］。不同的黃桿菌具有截然不同的生活環(huán)境和生存策略［18］，在南極生態(tài)系統(tǒng)中有廣泛的分布。本研究即在不同水層均分離得到黃桿菌，共計(jì)15株，分別隸屬于黃桿菌科下的8個(gè)屬（圖3），其中Croceibacter屬在各水層均有分布。

3 結(jié)論

普里茲灣真光層水體中細(xì)菌垂直分布與營養(yǎng)鹽和溶解氧濃度存在關(guān)聯(lián)。表層水體營養(yǎng)鹽濃度較低，可培養(yǎng)細(xì)菌Shannon多樣性指數(shù)最低，Berger-Parker優(yōu)勢度指數(shù)最高；隨著深度增加，50 m水層細(xì)菌多樣性指數(shù)高于其他水層，100和200 m水層差距不明顯。普里茲灣真光層水體中細(xì)菌水平分布與浮游植物生物量和生產(chǎn)力水平存在關(guān)聯(lián)。P2-14位于陸架區(qū)，該站位Shannon多樣性指數(shù)和Margalef豐富度指數(shù)最高；P2-11和P2-8位于陸坡，多樣性和豐富度指數(shù)相對較低。

在微生物可培養(yǎng)研究過程中，應(yīng)盡可能使用模擬自然條件的培養(yǎng)基。研究采用寡營養(yǎng)陳海水培養(yǎng)基，相比其他普通培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基降低了營養(yǎng)成分濃度，與自然環(huán)境近似，從而大幅降低因營養(yǎng)物質(zhì)充足導(dǎo)致生長快速菌株占據(jù)更多生態(tài)位的可能。通過這種培養(yǎng)方式，我們發(fā)現(xiàn)多個(gè)微生物新分類單元，表明南極普里茲灣真光層水體中蘊(yùn)藏著大量浮游細(xì)菌資源。深入了解細(xì)菌在極地生態(tài)系統(tǒng)中的作用，仍需發(fā)展合適的培養(yǎng)方法獲取純培養(yǎng)菌株，并在此基礎(chǔ)上開展生理學(xué)等方面的研究工作。

圖3 南極普里茲灣可培養(yǎng)細(xì)菌16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3.Phylogenetic tree of 16S rRNA gene sequences of the strains isolated from the seawater at the Prydz Bay，Antarctic.The tree was constructed by the neighbour-joining treemethod，with Haloferaxlarsenii as the out-group.Bootstrap values are based on 1000 replicates；only values＞60%are show.Bar，0.02 substitutions per nucleotide position

1 Giudice A L，Caruso C，Mangano S，etal.Marine bacterioplanktondiversity and community composition in an antarcticcoastal environment.Microbial Ecology，2012，63（1）：210—223.

2 Yu Y，Li H R，Zeng Y X，etal.Antarctica gen.nov.，sp.Nov.，amember of the family Flavobacteriaceae，isolated from Antarctic intertidal sedi-ment.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2012，62（9）：2218—2223.

3 Sait M，Hugenholtz P，Janssen PH.Cultivation of globally distributed soilbacteria from phylogenetic lineages previously only detected in cultivationindependent surveys.Environmental Microbiology，2002，4（11）：654—666.

4 Ye JY，Luo G Y.Ecological interpretation and related strategies for low culturability ofmicroorganisms.Acta Microbiologica Sinica，2005，45（3）：478—482.

5 蔡昱明，寧修仁，朱根海，等.南極普里茲灣浮游植物現(xiàn)存量與初級生產(chǎn)力粒級結(jié)構(gòu)和新生產(chǎn)力研究.海洋學(xué)報(bào)，2005，27（4）：135—147.

6 Tupas L，Koike I.Amino acid and ammonium utilization by heterotrophicmarine bacteria growth in enriched seawater.Limnol Oceanogr，1990，35（5）：1145—1155.

7 Cotner JB，Ammerman JW，Peele E R，etal.Phosphorus-limited bacterioplankton growth in the Sargasso Sea.Aquatic Microbial Ecology，1997，13：141—149.

8 韓正兵，潘建明，扈傳昱，等.南極普里茲灣真光層下水體中有機(jī)碳和無機(jī)碳分解比例的估算.極地研究，2010，22（3）：254—261.

9 Zeng Y X，Li H R，Yu Y，et al.Phylogenetic diversity and phenotypic characterization of cultivable bacterioplankton isolated from polar oceans.Acta Oceanologica Sinica，2007，26（4）：93—103.

10 Pukall R，Buntefuss D，F(xiàn)rühling A，etal.Sulfitobactermediterraneus sp.nov.，a new sulfite-oxidizingmember of the alpha-Proteobacteria.International Journal of Systematic Bacteriology，1999，49（2）：513—519.

11 龍聰，劉小宇，盧小玲，等.海洋亞硫酸桿菌M44的代謝產(chǎn)物研究.中國抗生素雜志，2012，37（4）：254—257.

12 Uphoff H U，F(xiàn)elske A，F(xiàn)ehrW，etal.Themicrobial diversity in picoplankton enrichment cultures：amolecular screening ofmarine isolates.FEMS Microbiology Ecology，2001，35（3）：249—258.

13 Ravenschlag K，Sahm K，Pernthaler J，etal.High bacterial diversity in permanently coldmarine sediments.Applied and EnvironmentalMicrobiology 1999，65（9）：3982—3989.

14 Xu XW，Wu Y H，Wang C S，et al.Marinobacter pelagius sp.nov.，amoderately halophilic bacterium.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2008，58（3）：637—640.

15 Kasai Y，Kishira H，Sasaki T，et al.Predominant growth of Alcanivorax strains in oil-contaminated and nutrient-supplemented sea water.Environmental Microbiology，2002，4（3）：141—147.

16 Hara A，Syutsubo K，Harayama S.Alcanivorax which prevails in oil-contaminated seawater exhibits broad substrate specificity for alkane degradation.Environmental Microbiology，2003，5（9）：746—753.

17 Cappello S，Denaro R，Genovese M，et al.Predominant growth of Alcanivorax during experiments on“oil spill bioremediation”inmesocosms.Microbiological Research，2007，162（2）：185—190.

18 Gómez-Pereira PR，F(xiàn)uchs B M，Alonso C，et al.Distinct flavobacterial communities in contrasting watermasses of the North Atlantic Ocean.The ISME Journal，2010，4（4）：472—487.