程方平 王敏曉 孫松 李超倫 張永山

0 引言

獨特的地理位置及生態(tài)特征使得南極地區(qū)成為全球氣候變化最為敏感的地區(qū)。在全球變暖的大趨勢下，該區(qū)域的南極半島20世紀50年代以來升溫顯著［1］。環(huán)流和海冰是影響南大洋生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)最為重要的因素，小范圍的溫度變化會對海冰范圍及其消融的周期產(chǎn)生重要影響，因此極地海洋生態(tài)系統(tǒng)對氣候變化反應格外敏感，南大洋已成為研究全球變化的熱點區(qū)域［2］。

浮游動物生活周期短，代謝活動強，活動能力較弱，對外界環(huán)境的變化極其敏感。而極地浮游動物的種群演替與海冰生息變化息息相關(guān)，對于環(huán)境擾動的響應更為強烈，因此常被用作研究全球氣候變化對極地生態(tài)系統(tǒng)影響的重要指標［3］。根據(jù)物種組成，極地浮游動物可以劃分為大洋群落，近岸群落和磷蝦群落。浮游動物群落結(jié)構(gòu)與洋流、海冰分布以及溫鹽等環(huán)境因素存在顯著相關(guān)性［4-5］，因此浮游動物群落結(jié)構(gòu)的長期變化觀測對于研究理解全球氣候變化對極地海洋生態(tài)系統(tǒng)的影響意義重大。而準確的種類鑒定是極地浮游動物群落結(jié)構(gòu)變化的前提條件，個別近緣物種間的更替也會導致群落結(jié)構(gòu)的變更［6］。

浮游動物涉及多個類群，準確的種類鑒定往往需要多名專家合作才能完成?；谛螒B(tài)的浮游動物分析專業(yè)技術(shù)性強，操作費時、費力，形態(tài)鑒定已成為及時獲取浮游動物群落變化信息的瓶頸［7］。同種異名以及隱種的普遍存在增加了樣品鑒定的難度［8］，而浮游動物的幼體鑒定更是困難重重［9］。

DNA條形碼（DNA barcoding）通常是指使用線粒體細胞色素c氧化酶第一亞基編碼基因片段序列（mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I gene，mtCOI）作為種類鑒定標簽條碼的技術(shù)［10］。該方法已被證明是中國近海浮游動物種類鑒定的有效手段［11-14］，北極海域的比較研究也證實了DNA條形碼在極地浮游動物種類鑒定及相關(guān)研究中的可靠性［15］。除了櫛水母外，DNA條形碼適用于浮游動物其他主要類群，并成為浮游動物生態(tài)研究中的有力工具，被應用于海洋浮游動物物種快速鑒定、隱種發(fā)現(xiàn)、營養(yǎng)關(guān)系研究、生物入侵種監(jiān)測、群落歷史演變反演、種群遺傳學以及生物地理學等多個領(lǐng)域［16］。南極海域已有基于DNA條形碼浮游動物幼體研究的相關(guān)報道［9，17］，研究結(jié)果表明由于缺乏完備的數(shù)據(jù)庫，相當部分的幼體無法得以準確鑒定［17］。雖然南極海洋生物普查（CAML）獲取了大量海洋生物的DNA條形碼，但絕大部分數(shù)據(jù)并未公開［8］，已有報道僅綜述了項目的進展情況，缺少關(guān)于浮游動物DNA條形碼的系統(tǒng)比較結(jié)果，嚴重制約了該技術(shù)在相關(guān)研究中的應用。

本研究利用2008年和2011年在南極普里茲灣和南極半島周邊海域采集的浮游動物樣品，構(gòu)建了南大洋中國南極科學考察調(diào)查海域浮游動物常見種的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫。系統(tǒng)比較分析了該海域35種常見浮游動物124條mtCOI序列，驗證南極海域DNA條形碼浮游動物種類鑒定的有效性；同時根據(jù)已有序列設(shè)計合適的通用引物，為后續(xù)基于DNA條形碼的浮游動物物種組成監(jiān)測、食物網(wǎng)營養(yǎng)關(guān)系研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

搭載第25次和28次中國南極科學考察大洋調(diào)查航次，使用浮游動物垂直拖網(wǎng)和浮游生物高速采集器取樣。垂直拖網(wǎng)所用網(wǎng)具為孔徑330μm的北太平洋網(wǎng)，站位詳細情況見圖1。采集的樣品去除大型游泳動物后固定在95%的優(yōu)質(zhì)酒精中，酒精體積為樣品體積的4—5倍并定期更換酒精，樣品保存在－20℃冰箱中備用。鑒定后的樣品分兩份保存于－80℃冰箱和福爾馬林中，前者用于分子生物學研究，后者作為備份樣品存檔。

圖1 本研究中浮游動物的采樣站位（紅色圓點）Fig.1.Regions sampled and collection locations for samples barcoded in this study.Sample stationswere represented by the red dots

使用Qiagen公司微量組織樣品試劑盒（貨號：56304）提取基因組DNA。為了提高PCR擴增的成功率，共設(shè)計了2組通用引物，正向引物為 coxf：GGTCCTGTAATCATAAAGAYATYG，反向引物分別為 coxr1：GCGACTACATAATAAGTRTCRTG和 coxr2：TCTATCCCAACTGTAAATATRTGRTG，擴增長度分別為830 bp和1 050 bp。反應采用50μL體系，條件如下：94℃ 5 min；94℃ 1 min，42—47℃ 30 s，72℃1.5 min，36個循環(huán)；72℃ 10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳驗證后送往南方基因公司作雙向測序分析。

使用clc main workbench的默認參數(shù)拼接序列，獲得的序列均提交NCBI的GenBank，序列索引號如附表1所示。此外，DNA條形碼種類鑒定有效性分析中還導入了GenBank中13種30條南極常見浮游動物DNA條形碼序列，其索引號見附表1。使用MUSCLE默認參數(shù)比對序列，比對結(jié)果使用Paup*v4b10計算條形碼序列兩兩間的遺傳距離（p-distance）。得到的結(jié)果利用本課題組編寫的perl腳本分析種內(nèi)、種間遺傳差異，并使用spss v18進行分析。使用MEGA 5.0構(gòu)建最大鄰接（Neighbor-joining，NJ）樹，自舉500次驗證節(jié)點支持度。根據(jù)Sirovich的方法，使用matlab（2011a）分析南極浮游動物DNA條形碼的示蹤向量（indicator vector），從而直觀顯示不同類群的遺傳差異及其關(guān)系［18］。

利用獲得南極浮游動物DNA條形碼以及Gen-Bank南大洋常見海洋無脊椎動物的mtCOI序列，比對后使用oligo 7設(shè)計兼并引物，從而提高對多個類群種類的擴增效率。引物為 ICO140U：TCAACAAATCATAARGAYATHGG和ICO820L：CACTTCNGGGTGACCRAARAAYCA。引物由南方基因公司合成，使用上述條件擴增32種極地浮游動物mtCOI序列，并通過凝膠電泳檢測驗證擴增效率。

表1 本研究采樣種類名稱及樣品信息Table 1.Species of Antarctic zooplankton analyzed for this study，with specimen voucher numbers（voucher），collection information（location），and GenBank accession numbers（acc.）

續(xù)表1

2 結(jié)果

2.1 序列特征

本研究共獲得隸屬于5個門19科24屬共計32種海洋浮游動物的mtCOI序列94條（NCBI登錄號：KC754377—KC754470），其中節(jié)肢動物門覆蓋橈足類、、磷蝦和介形類四個主要類群。由于酒精保存樣品中膠質(zhì)浮游動物形態(tài)特征破壞嚴重，且DNA在更換酒精過程中大量流失，因此本研究未獲得水母類和海樽的DNA條形碼序列。根據(jù)使用的引物，擴增產(chǎn)物長度存在差異，約為830 bp到1 050 bp；比對后得到長度為800 bp的共有序列，插入缺失位點12個（indels），均出現(xiàn)在軟體動物門的編碼序列中，這可能反應了該類群線粒體基因組的獨特進化歷程［19］。在110條序列的比對結(jié)果中，核苷酸 A、C、G、T的平均含量分別為25.6%，16.5%，20.9%和37.0%，A＋T含量遠高于G＋C含量，與線粒體基因組AT偏好的特征一致。不同種類間核苷酸組成差異顯著（PAUP*；p＝0），主要是由第三位密碼子的高擺動性造成的。

2.2 條形碼間隙驗證

具備合適分化速率的基因即可成為物種鑒定的理想標簽，當種內(nèi)變異速率遠遠小于種間變異速率時，兩個分類單元在遺傳種內(nèi)和種間差異不會發(fā)生重疊，形成條形碼間隙（Barcoding gap），這是 DNA條形碼有效性的理論基礎(chǔ)。本文比較了南極南大洋35種浮游動物的mtCOI序列，已確認是否存在條形碼間隙。本研究中mtCOI遺傳差異分布范圍較廣（圖 2），從 0—48.8%，平均值為 27.6%（SD＝8.5%）。種內(nèi)遺傳差異普遍較小，分布于0—2.6%之間（圖2），平均值為 0.67%（SD＝0.67%），94%的種類種內(nèi)最大遺傳差異＜1%。同屬近源種間遺傳差異分布在0.1%—29.3%之間（圖2），平均值為 15.3（SDSD＝8.4%）。哲水蚤屬（Calanus）中近緣哲水蚤（C.propinquus）和 C.simillimus的 mtCOI序列相似度非常高，其最小差異僅為0.64%，其他類群同屬內(nèi)近源種間遺傳差異均＞9.5%。雖有部分重疊，但種內(nèi)、種間遺傳差異顯著（t檢驗，F(xiàn)＝469.1，df＝442，p＝0），條形碼間隙明顯（圖 2），總體而言，我們的結(jié)果表明，基于mtCOI序列的DNA條形碼分析可以實現(xiàn)南極絕大部分橈足類的種類鑒定，哲水蚤屬內(nèi)種間遺傳差異異常偏低的原因?qū)⒃谟懻撝屑右苑治?。同一科?nèi)不同屬遺傳差異為9.2%—27.1%之間，平均值為 20.9%（2.7%），該范圍與同屬不同種間遺傳差異的分布范圍重疊。在目以上分類單元，90.3%以上的種間遺傳差異＞29%。

圖2 南極常見浮游動物mtCOI序列不同階元下遺傳差異水平的分布情況.柱狀圖使用左側(cè)縱坐標，線圖使用右側(cè)縱坐標軸.黑色實心柱標示種內(nèi)遺傳差異，黑色斜線柱標示同屬內(nèi)近源種間的遺傳差異，灰色柱標示同科內(nèi)不同屬間的遺傳差異，虛線標示整個樣品的遺傳差異分布Fig.2.Frequency distribution of genetic divergence（p-distance）ofmtCOIgenes for pairwise comparisons between individuals of all barcodes（dashed line），individuals within the same species（black boxes），between congenic species（white boxes）and between genera within the same family（grey boxes）

2.3 基于DNA條形碼的分子系統(tǒng)樹

在根據(jù)南極浮游動物DNA條形碼序列構(gòu)建的最大鄰接樹（圖3）中，總共生成了34個由短枝連接的單系群，分別代表一個分子操作分類單元（MOTU），其節(jié)點自舉支持度（Bootstrap）均 ＞99。除了近緣哲水蚤和C.simillimus雜糅在同一單系枝，其他單系群均標示單一物種。與遺傳差異分析結(jié)果一致，由于在屬和科水平DNA條形碼所使用的mtCOI序列并不存在顯著差異，進化趨向飽和，mtCOI序列無法準確解析科屬水平浮游動物的系統(tǒng)分化。同一屬或科的物種并不能準確聚在一起。但在更高分類階元，不同類群間顯示出高水平的遺傳差異，研究涉及到的7個浮游生物類群（橈足類、毛顎類、類、多毛類、磷蝦類、軟體動物和介形類）的單系性均得到了解析。但由于背景噪音，各大類群所在進化枝的節(jié)點支持度都不高。

2.4 南極浮游動物DNA條形碼的示蹤向量分析

示蹤向量分析方法是分析DNA條形碼數(shù)據(jù)的新方法，針對南極浮游動物DNA條形碼分析的結(jié)果如圖4所示。與分子系統(tǒng)樹和條形碼間隙分析的結(jié)果一致，除近緣哲水蚤和C.simillimus無法準確區(qū)分種類外，其他各種類均聚為深紅色的色塊。橈足類、磷蝦類、類和介形類內(nèi)部序列相似度相對較高，聚成亮色色塊，軟體動物和毛顎類則具有較高水平的內(nèi)部遺傳分化，色塊暗淡。各類群對應色塊表示的相似度與其在分子系統(tǒng)樹中進化枝的長度一致，mtCOI序列在不同類群的進化速率存在顯著差異。

圖3 基于124條cox1序列構(gòu)建的35種南極海域浮游動物樣品的無根鄰接樹（使用最大似然模型計算遺傳距離）.節(jié)點數(shù)字代表1 000次自舉檢驗得到的節(jié)點置信度Fig.3.Unrooted mtCOI gene tree for 124 specimens belonging to 35 Antarctic zooplankton species reconstructed by neighbor-joining with maximum-likelihood distances.Bootstrapping were done for 1 000 replications

2.5 新引物對南極浮游動物樣品的擴增成功率

使用新設(shè)計的引物擴增32種南極浮游動物mt-COI序列得到的膠圖如圖5所示，全部浮游動物的模板均可以得到預期長度的擴增產(chǎn)物，且亮度滿足后續(xù)測序要求。而利用相同的模板，使用Folmer引物的擴增成功率不足60%，且獲得產(chǎn)物的條帶相當模糊。

3 討論

3.1 近緣哲水蚤（C.propinquus）和 C.simillimus極低種內(nèi)遺傳差異的意義

本研究中南極浮游動物DNA條形碼的目的基因為線粒體細胞色素c氧化酶第一亞基編碼基因，該基因具有母系遺傳、多拷貝存在和變異速率適中等優(yōu)點［7］，其種類鑒定的功效已在浮游動物不同類群種類鑒定中得到了檢測［15，20-23］。根據(jù)已有研究結(jié)果，浮游動物種間遺傳差異通常大于10%，即便兩似種的遺傳差異也大于5%，而種內(nèi)遺傳差異則通常 ＜4%［13，15，20］。橈足類中，種間遺傳差異通常 ＞5%，種內(nèi)遺傳差異則＜4%，95%以上的種類種內(nèi)遺傳差異 ＜2.5%［11］。本研究中近緣哲水蚤和 C.simillimus遺傳差異最大僅為 2.9%，最小則為0.2%。根據(jù)已有報道，哲水蚤屬種間遺傳差異為7%—25%［24］，因此本研究中兩種哲水蚤的遺傳差異屬于種內(nèi)水平。此外，分子系統(tǒng)樹和示蹤向量分析均指示近緣哲水蚤和C.simillimus在mtCOI基因上并未發(fā)生分化。

圖4 針對35種南極浮游動物124條DNA條形碼的示蹤向量分析結(jié)果（以Klee圖顯示）.橫坐標標示預測得到的物種，暖色標示具有更高的相似性，橫坐標數(shù)字代表的種類見圖3Fig.4.Vector analysis of 124 barcodes belonging to 35 species（Resultswere shown as a Klee diagram）.Higher similarity was visualized by warmer colors.Species names represented by the numbers on the x-axiswere given in Fig.3

圖5 使用新設(shè)計的兼并引物對南極32種浮游動物的擴增效果圖（梯度代表D2000標記）Fig.5.Representative agorose gel electrophoresis of PCR products amplified from 32 Antarctic zooplankton samples using degenerate primer set.Ladder represents a D2000 marker

近緣哲水蚤和C.simillimus都是南大洋浮游橈足類的重要組成部分，其分布范圍存在重疊。近緣哲水蚤主要分布在高緯度的極地海域［25］，而C.simillimus則主要分布于亞南極區(qū)海域和極地鋒面區(qū)［26］，這與本文兩個種類的采樣位置一致。個體大小是區(qū)分兩個種類的最直觀依據(jù)；除此以外，第五胸足形態(tài)方面有一定的區(qū)別。兩者的區(qū)別主要表現(xiàn)在，近緣哲水蚤個體顯著大于C.simillimus；其雌性第五胸足內(nèi)側(cè)小齒形態(tài)也與后者存在細微差異（http：∥copepodes.obs-banyuls.fr／）。近緣哲水蚤和C.simillimus外形極為相似，幼體期兩種甚至無法區(qū)分［27］，以至于C.simillimus起初被當做近緣哲水蚤，至1902年才被劃分為獨立的種類。為了確保本研究中種類鑒定的準確性，樣品鑒定時僅選擇雌性成熟個體，此外還解剖了對應樣品的第五胸足，發(fā)現(xiàn)確實存在上文描述的差異。

然而基于mtCOI基因的比較卻顯示兩個種類共享同一種單倍型，近緣哲水蚤和C.simillimus的遺傳分化甚至小于近緣哲水蚤種內(nèi)的遺傳分化，結(jié)果并不支持不同形態(tài)的樣品存在種間遺傳分化。本研究進一步比較了GenBank中C.simillimus與本文獲得兩種哲水蚤的遺傳相似性。結(jié)果顯示GenBank序列與本文獲得的C.simillimus序列完全一致；取自南大洋大西洋海區(qū)的C.simillimus（GenBank）與近緣哲水蚤也不存在遺傳分化。由于采樣的樣品量都不足10只，采樣不夠系統(tǒng)，且僅僅使用了單一分子標記（mtCOI），缺乏核基因的驗證，本研究無法確認近緣哲水蚤和C.simillimus是否為同種異名。

哲水蚤屬是目前橈足類中研究最多的一個類群，該屬內(nèi)已發(fā)現(xiàn)多個種存在爭議。根據(jù)mtCOI基因［28］和線粒體16S rRNA編碼基因［29］的研究結(jié)果，C.helgolandicus和 C.euxinus很可能是同一個物種。此外，中華哲水蚤（C.sinicus）與C.agulhensis的物種分化也遭到了質(zhì)疑，Kozol等［30］使用 mtCOI、18S rRNA和28S rRNA分析了兩個種類不同種群的個體，發(fā)現(xiàn)兩種缺少遺傳分化。由此可見，“種間”低水平的遺傳分化在哲水蚤屬中并非特例。近緣哲水蚤和C.simillimus的差異主要體現(xiàn)在數(shù)量性狀上，而這種差異具有很強的環(huán)境可塑性［28］。本文的研究結(jié)果已對C.simillimusvs種的地位提出了質(zhì)疑，在今后的研究中有待使用多個基因位點結(jié)合形態(tài)和生活史特征驗證近緣哲水蚤和C.simillimus的分類地位。

3.2 DNA條形碼是鑒定南極浮游動物的有效工具

除近緣哲水蚤和C.simillimus外，本研究中其他浮游動物的種內(nèi)遺傳差異均顯著小于種間遺傳差異，條形碼間隙明顯。研究結(jié)果表明，與北極［15］、近岸海灣［13］以及暖溫帶大洋［20］一樣，使用 mtCOI序列作為DNA條形碼在南極進行浮游動物物種組成研究是完全可行的。利用DNA條形碼，可以區(qū)分存在爭議的兩似種。本研究中，基于形態(tài)學很難準確區(qū)分的 Themisto antarctica和 T.gaudichaudii以及Alacia belgicae和A.hettacra均可以使用DNA條形碼實現(xiàn)準確鑒定，上述物種在常規(guī)調(diào)查中均未加以甄別［26，31］。

除了快速、準確，基于DNA條形碼最大優(yōu)點是無需待檢測樣品保存關(guān)鍵形態(tài)特征，這使得利用DNA條形碼實現(xiàn)幼體鑒定和腸道內(nèi)含物分析成為可能。在南極海域，已有使用DNA條形碼研究浮游幼體的相關(guān)報道［9，17］，雖然由于背景數(shù)據(jù)庫尚不完善，許多幼體無法具體鑒定到種，但比較傳統(tǒng)形態(tài)學分析方法，在識別精度上仍有大幅提升。利用DNA條形碼，Janosik等［32］對 Labidiaster annulatus的浮游幼蟲生活史有了更進一步的認識。而基于DNA條形碼的南極浮游動物攝食研究也已開展。Tobe等［33］使用分子探針研究南極大磷蝦的攝食，發(fā)現(xiàn)長腹劍水蚤屬是其主要攝食對象。相信在包括本研究在內(nèi)的南極浮游動物DNA條形碼相關(guān)研究的推動下，DNA條形碼數(shù)據(jù)庫將會越來越完善，從而推動該技術(shù)在南極浮游動物生態(tài)學研究中的應用［8］。而高通量測序技術(shù)的普及使得基于宏遺傳組方法的浮游動物快速檢測成為可能［16］。

此外，我們發(fā)現(xiàn)包括Calanus propinquus／simillimus，長臂櫻磷蝦（Thysanoessa macrura），戈氏長腹水蚤（Metridia gerlachei）以及北方乳點水蚤（Pleuromamma borealis）種內(nèi)遺傳差異較大，超過1.5%。其中北方乳點水蚤遺傳差異顯示出一定的地理分化，西風帶采集樣品與普里茲灣外海域采集樣品遺傳差異最大。上述結(jié)果表明，DNA條形碼序列還可以提供種內(nèi)遺傳變異的信息，進而研究浮游動物關(guān)健種在南大洋不同海區(qū)的遺傳分化，從而更好地揭示海冰、洋流等對浮游動物種群補充的影響。類似的工作已在南極大磷蝦（Euphausia superba）［34］、鉤蝦（Orchomene sensu）［35］等多個類群中取得了進展。南極地區(qū)海洋無脊椎生物的基因流遠比預想要小，種群遺傳分化乃至隱種發(fā)生也許普遍存在。

3.3 新引物為南極浮游動物宏遺傳組學研究提供有力工具

Folmer的通用引物極大地推動了DNA條形碼計劃的開展，然而由于該引物不含有兼并堿基，因此在不同類群中的擴增效率差別很大［12］，甚至無法成功擴增部分種類的mtCOI序列［17］，從而造成觀測結(jié)果的偏差，影響浮游動物群落物種組成分析的準確性。在本研究的模擬實驗中，使用Folmer引物僅有60%的種類可以得到清晰的擴增條帶，如用于宏基因組方法的群落組成分析可能導致物種豐度的低估。由于考慮了不同類群的序列差異，本研究設(shè)計的兼并引物對南極海域常見浮游動物的擴增效率較為一致，成功率也更高，更適于基于單一基因的宏基因組分析。傳統(tǒng)測序方法中，兼并引物無法直接測序，需要提前建庫，因此費時費力，這是傳統(tǒng)測序通常摒棄兼并引物的原因，而高通量測序方法則規(guī)避了這一不利因素。更為均一的擴增效率也使得根據(jù)不同DNA條形碼表達豐度進行物種豐度估算成為可能。

4 總結(jié)

（1）南極海域哲水蚤屬的兩個常見種近緣哲水蚤和C.simillimus形態(tài)高度相似且遺傳差異細微，本研究結(jié)果顯示有必要使用包括核基因組位點，結(jié)合形態(tài)、生活史特征研究C.simillimus是否為近緣哲水蚤的地理種群。

（2）本研究結(jié)果驗證了DNA條形碼在南極浮游動物種類鑒定中的有效性。同時，部分物種較高水平的種內(nèi)遺傳差異表明DNA條形碼還可以用作相關(guān)物種的種群遺傳學研究。北方乳點水蚤極地海域和西風帶海域的種群可能存在遺傳分化，極地鋒面可能是造成種群隔離的因素。

（3）新設(shè)計的兼并引物具有更為均一的擴增效率和成功率，結(jié)合高通量測序，必將為基于DNA條形碼的環(huán)境樣品宏遺傳組分析提供有力工具。

致謝 作者感謝陶振鋮、楊光兩位同仁在樣品采集和鑒定過程中給予的大力幫助。

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