夏曉敏 汪建君 陳立奇 顏金培 張銳
氣溶膠廣泛存在于地球大氣中。對于氣溶膠中微生物的研究一直備受關注,掌握氣候變化背景下微生物的傳輸、遷移與時空變化具有重要意義。南極地區(qū)是受人類活動影響最小、大氣最為潔凈的地區(qū),擁有世界上最后一個天然的、未曾受人為改造的生態(tài)系統(tǒng),因此,南極被公認為全球大氣本底研究的最理想?yún)^(qū)域。但有研究顯示,人類在南極的活動乃至在世界其他地區(qū)的活動,已引發(fā)了南極地區(qū)區(qū)域性的環(huán)境變化。南極站區(qū)大氣環(huán)境反映了站區(qū)人類活動對南極大氣的影響情況,一些研究表明,人類活動相關的大氣懸浮污染物對南極陸地植物產(chǎn)生威脅,并對地區(qū)環(huán)境構(gòu)成相當負面的影響[1]。
南極地區(qū)是一個受人類影響較少,且常年低溫、強紫外、盛行大風的環(huán)境,通過空氣傳播的微生物對于該地區(qū)微生物多樣性的保持具有重要的意義。南極地區(qū)氣溶膠微生物的研究開始于20世紀60年代,人們主要依靠培養(yǎng)及形態(tài)學鑒定的方法來進行空氣微生物的研究。借助培養(yǎng)基選擇分離的方法,研究人員在南極分離得到了倫黑墨氏菌屬(Rheinheimera)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和黃桿菌 (Flavobacterium)等 細菌[2-4]。但越來越多的研究表明,基于培養(yǎng)方法進行的微生物研究有很大的局限性,大部分的微生物難以培養(yǎng),傳統(tǒng)的鑒定方法對很多新物種不能給出明確的分類,培養(yǎng)手段又具有物種選擇性等等。南極地區(qū)環(huán)境中存在著大量未知微生物[5-7],對極地氣溶膠微生物的研究提出了更高的要求。近年來分子生物學手段逐漸被應用到氣溶膠微生物研究中,其快速、準確及不依賴培養(yǎng)的優(yōu)點,幫助人們更全面地了解氣溶膠微生物,發(fā)現(xiàn)更多新的氣溶膠菌群,監(jiān)測到大量的未被鑒定的微生物[8]。此外,在南極地區(qū)的氣溶膠中,人們也利用分子生物學手段鑒定出很多與人類活動密切相關的微生物,這一方面說明人類活動已經(jīng)開始影響到南極氣溶膠的生物特性,另一方面也揭示南極氣溶膠微生物對人類健康、生產(chǎn)及生活具有潛在的影響[8]。
本研究通過收集南極長城站附近的氣溶膠,使用構(gòu)建克隆文庫的方法,初步研究了南極長城站地區(qū)空氣微生物的群落結(jié)構(gòu)。通過對比不同氣溶膠收集時間,DNA提取方法,為分子生物學手段研究南極氣溶膠微生物提供了基礎數(shù)據(jù)。我們的研究表明南極地區(qū)的氣溶膠微生物具有極高的多樣性,并有相當部分的未知序列,說明進一步深入研究南極地區(qū)微生物群落構(gòu)成很有必要。
南極中國長城站空氣微生物樣品采集于中國第28次南極科學考察。大氣氣溶膠采樣器(EP-5000)由國家海洋局第三海洋研究所研制。空氣微生物樣品搜集至孔徑為1.0μm的玻璃纖維濾膜(Pall Corporation 20.3 cm×25.4 cm)。采樣時間為 2011年12月25日8:00至2012年1月11日19:00,采樣經(jīng)緯度為68°52.198′S,77°14.136′E(圖 1)。采樣期間平均氣溫0.8℃,平均風速8.3級,氣溶膠收集器流速42.69 m3/h,采樣空氣總流量為17 830m3。采樣同時放置實驗組與空白對照組,實驗組開啟采樣器空氣泵,空白對照組未開啟空氣泵,采樣結(jié)束后將濾膜含氣溶膠側(cè)朝內(nèi)對折,用無菌鋁箔包裹,放入無菌密封袋,存放于-80℃冰箱。
氣溶膠濾膜在超凈工作臺中用無菌剪刀剪取2.5 cm×2.5 cm的方塊,采用酚氯仿抽提法[9]進行空氣微生物DNA的提取。主要過程如下:將濾膜放入抽提液并震蕩混勻,去膜,液氮及65℃水浴反復凍融3次,加入溶菌酶進行37℃水浴1 h后,加入SDS和 蛋白酶K,55℃水浴1 h,然后進行酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提及異丙醇沉淀 DNA。DNA溶于35A及無菌TE,濃度及純度檢測使用1%的瓊脂糖凝膠電泳及Nanodrop 2000(Thermo Scientific公司)。
空氣微生物細菌16S rRNA基因序列擴增采用25μL的PCR反應體系 (10μmol/L引物各1μL,dNTPs 0.5μL,10×PCR buffer 2.5μL,Taq酶0.25 U(TaKaRa公司),DNA模板 10—100 ng,滅菌雙蒸水補至25μL)。細菌16S rRNA基因通用引物為 Eubac 27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和Eubac 1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′[10]。PCR擴增程序為 95℃,預變性 5 min;94℃,45 s;55℃,45 s;72℃,90 s,擴增 30個循環(huán),72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物的質(zhì)量與分子量通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。為降低PCR擴增的傾向性,將3個PCR擴增產(chǎn)物合并后使用Omega公司生產(chǎn)的PCR產(chǎn)物純化試劑盒進行純化。
純化后的PCR產(chǎn)物送交上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行克隆文庫的構(gòu)建,隨機選取100個克隆進行測序分析。序列通過Bellerophon[11]進行嵌合子的檢查后采用Mothur軟件進行多樣性和種群結(jié)構(gòu)的分析[12]。序列的系統(tǒng)發(fā)育分析使用RDP數(shù)據(jù)庫的 Classifer工具和 Seqmatch工具(http:∥rdp.cme.msu.edu/),并在 Greengenes中進行 Blast比對??寺∥膸熘锌赡艿暮Q髞碓春完懙貋碓吹奈⑸锏呐袛喔鶕?jù)Greengenes中相似度最高的序列來源進行定義[8]。93條克隆子序列已經(jīng)提交NCBI,收錄號為JX559160—JX559252。
利用Hysplit 4.7模式計算采樣期間的大氣后向傳輸軌跡,軌跡起始點為采樣點,距地面0 m(采樣點離地面高度1 m左右,因此選擇模式計算高度0 m),由該點向后推120 h,最后輸出每小時氣團所在的位置。軌跡模式所用氣象資料為NCEP(National Centers for Environmental Prediction)的FNL全球分析資料,已經(jīng)過ARL(NOAA-Air Resources Laboratory)的預處理模塊轉(zhuǎn)化成模式所需要的格式。
相對于其他環(huán)境,極地地區(qū)溫度低,人類活動較少,空氣中的顆粒及微生物含量少。李明等[13]發(fā)現(xiàn),在熱帶及亞熱帶地區(qū)海洋邊界層的總細菌量維持在210 CFU/m3以上,中緯度地區(qū)細菌量在 100 CFU/m3左右,而在極地地區(qū),微生物的總量則降至幾十甚至幾個。所以南極區(qū)域收集微生物氣溶膠持續(xù)時間較長,以獲得足夠后期分子生態(tài)學分析的所需要的生物量。在預實驗中,我們采集了1 700—4 800 m3空氣中的氣溶膠,發(fā)現(xiàn)無法提取到足夠的DNA進行下游分子生物學實驗。當采樣時間增加至2周,過濾體積提高到17 830 m3時,我們得到了少量的DNA,能夠滿足后期克隆文庫構(gòu)建的需求,空白對照組未能提取到DNA。Pearce等[8]在南極Hally站空氣微生物研究中,采樣時間也超過2周,空氣過濾體積約20 000 m3,與我們采樣體積近似。
通過構(gòu)建南極長城站空氣微生物的細菌16S rRNA基因克隆文庫,獲得100個克隆子,其中7個為嵌合子序列,剩余93個有效克隆子序列進行了多樣性和種群結(jié)構(gòu)的分析。RDP Seqmatch分析表明有6條序列(占克隆子總數(shù)的6.5%)與NCBIGen-Bank中已有序列的相似度低于97%,分別屬于Alphaproteobacteria(1條),Gammaproteobacteria(1條),Clostridia(2條)和 Verrucomicrobiae(2條)。這說明南極長城站氣溶膠中存在一定比例的尚未被分離鑒定的細菌類群,因此氣溶膠可以作為細菌新種屬的分離來源。此外,南極長城站氣溶膠細菌克隆文庫的稀釋曲線分析顯示稀釋曲線并沒有達到平臺期(圖2),表明南極氣溶膠中微生物的多樣性較高。隨著測序通量的提高,會有更多的微生物種類出現(xiàn)。
圖2 南極長城站空氣微生物的細菌16S rRNA基因克隆文庫稀釋曲線分析Fig.2.Rarefaction analysis of the bacterial 16S rRNA gene clone library of aerosol samples at the Great Wall Station,Antarctica
按照通用的97%的序列相似度,克隆文庫中的93條序列可以被劃分成53個分類操作單元(Operational Taxonomic Unit,OTU),Shannon指數(shù)為 3.58,Simpson指數(shù)為0.04。這遠遠高于我們用類似的方法研究的廈門地區(qū)空氣微生物的多樣性(12個OTU,Shannon指數(shù)為1.60)。南極長城站空氣微生物也顯示了很高的豐富度,ACE及Chao值分別達到263.131 2和127.1,遠高于廈門地區(qū)的17及14.5[14]。Bowers等[15]對美國科羅拉多西北部高海拔地區(qū)(40.45°N,106.73°W,海拔 3 200 m以上,溫度低于0℃)的研究也得到了很高的空氣微生物群落多樣性,在4864條序列中發(fā)現(xiàn)有646個OTU,這表明了高緯度高海拔地區(qū)的空氣微生物具有相對較高的多樣性。我們推測南極地區(qū)高的多樣性可能是由于低溫、干燥、低營養(yǎng)的環(huán)境,微生物生長緩慢,無法出現(xiàn)絕對的優(yōu)勢菌群,使細菌群落發(fā)展較為平衡,從而保持了較高的多樣性。David等[8]的研究在南極地區(qū)檢測到低的多樣性及很多重復序列,這可能是由于樣品保存時間過長(6年)導致群落中一些物種丟失。
克隆文庫的系統(tǒng)發(fā)育分析表明南極長城站空氣微生物中的主要細菌類群為Proteobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes、Actinobacteria、Planctomycetes、Cyanobacteria/Chloroplast及 Verrucomicrobia等 7個門(圖3)。其中Proteobacteria門的細菌是優(yōu)勢類群,占克隆文庫的65.7%。Proteobacteria門包含了Alpha-、Beta-、Delta-、Gamma-及 Epsilon-proteobacteria 5個亞門的細菌,比例分別為 4.3%、14.0%、1.1%、45.2%及 1.1%,這表明 Gammaproteobacteria亞門的細菌對南極氣候條件具有很強的適應性。Acinetobacter及Psychrobacter是Proteobacteria門的主要細菌屬,分別占到了該門的21.3%及19.7%。南極長城站氣溶膠細菌第二大門為Bacteroidetes,占所有克隆子的12.9%,所檢測到的該門的細菌類群分布比較均勻,其中最多的為Flavobacterium屬,檢測到3個克隆子。
圖3 南極長城站空氣微生物中細菌種群多樣性(16S rRNA基因克隆文庫)分析.(A)門水平上克隆子分布;(B)門水平上分類操作單元(OTU)的分布Fig.3.Community structure of the airborne bacteria based on 16S rRNA gene clone library analysis at the GreatWall Station,Antarctica.(A)Phylogenetic affiliation of clones at phylum level;(B)Phylogenetic affiliation of OTUs at phylum level
文庫的93條序列根據(jù)97%的相似度被劃分為53個OTU。Proteobacteria門包含了27個OTU,占到了OTU總數(shù)的50.9%,Bacteroidetes門包含了10個OTU,為 OTU總數(shù)的18.7%,F(xiàn)irmicutes門 8個OTU,Cyanobacteria/Chloroplast門 5個 OTU,Actinobacteria,Planctomycetes及 Verrucomicrobia只有 1個OTU。從OTU的分布上看,其中Acinetobacter屬含4個 OTU,ClostridiumⅫ,Sphingomonas屬各含3個OTU,為OTU最多的細菌屬。OTU7與OTU8為含克隆子最多的OTU,分別包含了12及11個克隆子,在分類上分別屬于Acinetobacter及Psychrobacter(表 1)。
表1 南極長城站空氣微生物主要類群(克隆子數(shù)目超過2個的OTU)的系統(tǒng)發(fā)育分析及來源分析(基于Greengenes)Table 1.Phylogenetic and Greengenes analysis ofmajor bacterial groups(clone number>2)at the GreatWall Station,Antarctica
在屬的水平上,Acinetobacter及Psychrobacter為整個群落的優(yōu)勢類群,分別有13及12個克隆子。Psychrobacter屬主要是兼性或者專性嗜冷菌,廣泛分布在南極地區(qū)的海冰、沉積物、土壤及深海環(huán)境中,同時該菌還廣泛分布在食品、皮膚、魚鰓和魚腸道、企鵝體表等不同環(huán)境中,因此該菌是南極地區(qū)較容易檢測到的空氣微生物[7,16]。在氣溶膠中發(fā)現(xiàn)大量的Acinetobacter及Psychrobacter表明它們在南極地區(qū)的廣泛分布與大氣的傳播有密切的關系。
我們的結(jié)果與Bowers等對高海拔地區(qū)空氣微生物群落結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果相近,他們的研究表明,高海拔地區(qū)氣溶膠樣品的主要細菌類群也為Proteobacteria和Bacteroidetes,兩者分別占到了克隆子總數(shù)的83%及10%。而城市氣溶膠及低緯度地區(qū)氣溶膠的研究顯示其主要的細菌類群是壁厚菌門(Firmicutes)[14,17],說明特定的地理環(huán)境對空氣微生物群落構(gòu)成有一定的影響。
以往研究發(fā)現(xiàn),空氣微生物主要類群為革蘭氏陽性菌[2,18],該類菌中大部分對紫外線輻射有一定的耐受力,同時還有休眠孢子也能夠耐受惡劣的環(huán)境。李明等[15]對南極地區(qū)微生物的研究也發(fā)現(xiàn),南極地區(qū)的微生物主要為壁厚菌門中的Bacillus屬和Deinococcus屬[13]。而我們的研究中主要的兩個類群Acinetobacter及Psychrobacter均為革蘭氏陰性菌。這可能是以往研究基于培養(yǎng)方法來研究空氣微生物組成的,由于培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件偏好性,培養(yǎng)方法會選擇性地檢出易于培養(yǎng)的微生物,不能夠客觀反映原位的微生物群落構(gòu)成。
Greengene的分析顯示南極長城站空氣微生物克隆文庫中有28個可能為海源微生物的序列,分布在20個OTU中,占總序列數(shù)的30.1%。長城站氣溶膠中海源微生物的序列來源比較多樣,并沒有出現(xiàn)較為優(yōu)勢的物種,包含了 Colwellia,F(xiàn)lavobacterium,Haliea等17個屬的細菌。海洋具有極其豐富多樣的微生物,通過海氣交換,海洋微生物影響著空氣微生物的群落構(gòu)成,以往的研究已經(jīng)表明海源微生物是空氣微生物的重要組成部分。David等[8]對南極地區(qū)氣溶膠的研究檢測到了Cyanobacteria,diatom plastids等海源序列,占序列總數(shù)的9.4%。李明等對青島氣溶膠的研究表明18.99%的細菌屬于海源微生物,并指出氣溶膠中海源微生物與陸源微生物的比例與采樣點距離陸地的位置直接相關。我們利用HYSPLIT4.7軌跡模式計算了采樣期間長城站站區(qū)的大氣后向傳輸軌跡。在我們所分析的18天內(nèi)的后向軌跡中,14條軌跡為西風,2條來自北方,2條來自東方,說明長城站的大氣主要受西風帶影響,來自于西面開闊大洋的大氣是站區(qū)大氣主要來源,亦有來自北方或東面的洋區(qū)大氣影響站區(qū)。大氣后向軌跡分析支持了海洋來源的微生物會是氣溶膠的主要成分之一。
另一方面,Greengenes分析表明有28條序列是來源于陸源微生物,占總序列數(shù)的30.1%,分布在14個OTU中。在所有的陸源序列中,Psychrobacter及Clostridiales,Acinetobacter johnsonii為氣溶膠中較為優(yōu)勢的陸源微生物類群,這些物種在南極的土壤中經(jīng)常被檢測到。同時,我們發(fā)現(xiàn)有15個克隆子序列與人類活動相關,占總克隆子數(shù)的16.1%,如人類生產(chǎn)產(chǎn)生的廢水,生物反應器。這些克隆子分布在6個OTU中,占OTU總數(shù)的11.3%。長城站所處的南極半島有多國的科學考察站,是南極大陸上考察站最密集的地區(qū),也是南極大陸上觀光客最多的地區(qū),因此是南極人類活動影響最為顯著的地區(qū)。但我們并沒有檢測到 Staphylococcus,Bacillus,Corynebacterium,Micrococcus,Streptococcus,Neisseria和Pseudomonas等在Hally站氣溶膠中發(fā)現(xiàn)的細菌,這些與人類活動相關的細菌序列占Hally站克隆文庫的35.3%。我們推測人類活動對微生物氣溶膠群落結(jié)構(gòu)的影響具有地域特征,可能與考察站的功能區(qū)劃、考察活動類型以及采樣點位置等因素有關,需要進一步研究。
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