朱 艷

（安徽中醫(yī)藥大學(xué)附屬針灸醫(yī)院，安徽合肥 230061）

刺血加艾灸療法對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR2與TLR4mRNA表達(dá)的影響

朱 艷

（安徽中醫(yī)藥大學(xué)附屬針灸醫(yī)院，安徽合肥 230061）

目的 探究刺血加艾灸療法治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。方法 將40只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、秋水仙堿組、刺血艾灸組，每組10只，采用尿酸鈉混懸液右后踝關(guān)節(jié)注射法復(fù)制痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型。分別在模型復(fù)制時(shí)、模型復(fù)制后24h及灌胃治療后3d測(cè)量右后足腫脹度；灌胃3 d后，從腹主動(dòng)脈取血，檢測(cè)血清尿酸（uric acid，UA）含量及外周血單個(gè)核細(xì)胞中Toll樣受體2（toll－like receptor 2，TLR2）和Toll樣受體4（toll－like receptor 4，TLR4）mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果 與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠足腫脹度，血清UA含量及TLR2、TLR4mRNA表達(dá)水平均顯著上調(diào)（P＜0.01）。刺血艾灸組足腫脹度，血清UA含量，TLR2、TLR4mRNA表達(dá)水平較模型組均顯著下調(diào)（P＜0.05，或P＜0.01），且顯著低于秋水仙堿組（P＜0.05，或P＜0.01）。結(jié)論 刺血加艾灸療法能夠降低痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)腫脹度及血清UA水平，其機(jī)制可能與外周血單個(gè)核細(xì)胞中TLR2與TLR4mRNA的表達(dá)水平下調(diào)有關(guān)。

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎；刺血；艾灸；Toll樣受體；尿酸

痛風(fēng)是由嘌呤代謝紊亂，血尿酸增高，導(dǎo)致尿酸結(jié)晶沉積在關(guān)節(jié)及皮下組織而引起的一種疾病。臨床上以高尿酸血癥、特征性急性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)結(jié)石形成為特點(diǎn)。痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎就是由痛風(fēng)引起的發(fā)病急驟的關(guān)節(jié)紅腫和劇痛的關(guān)節(jié)炎癥，受累關(guān)節(jié)疼痛難忍，活動(dòng)受限，易反復(fù)發(fā)作。近年來(lái)，由于飲食結(jié)構(gòu)變化，中國(guó)痛風(fēng)發(fā)病率逐年升高，預(yù)計(jì)在21世紀(jì)，痛風(fēng)在中國(guó)將成為僅次于糖尿病的第二號(hào)代謝?。?］。Toll樣受體（toll－like receptors，TLRs）是連接固有免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁，其中TLR2與TLR4在急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，已成為目前研究急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的熱點(diǎn)。刺血療法和灸法屬于中醫(yī)傳統(tǒng)外治法，刺血療法針刺局部可以促進(jìn)和改善局部血液循環(huán)，加速炎性滲出物和致痛物質(zhì)的吸收，緩解疼痛，使致痛因子盡早排除，促進(jìn)經(jīng)絡(luò)修復(fù)。灸法具有溫經(jīng)、活血通絡(luò)、清熱解毒等功效，并且治療過(guò)程中患者有舒適感，因此很受患者歡迎。本研究旨在觀(guān)察刺血加艾灸療法對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠TLR2與TLR4的調(diào)節(jié)作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)Wistar雄性大鼠40只，體質(zhì)量（200±20）g，由安徽省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所動(dòng)物房提供（合格證號(hào)：皖醫(yī)實(shí)動(dòng)準(zhǔn)字03號(hào)）。實(shí)驗(yàn)室保持恒溫、恒濕，動(dòng)物在明暗周期各12h（明期6：00— 18：00）的條件下進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)。

1.2 藥品與試劑 秋水仙堿：每片0.5mg，吉林省通化百信藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，用生理鹽水配成0.0135mg／ml的混懸液，備用。艾條：上海泰成科技發(fā)展有限公司。尿酸鈉：由美國(guó)Sigma公司出品，批號(hào)127k7331。Trizol提取液：天根生化科技（北京）有限公司提供，批號(hào)DP517；PCR Master Mix試劑盒（貨號(hào)K0171）、M－Mulv Reverse試劑盒（貨號(hào)K1624）：均購(gòu)自加拿大Fermentas公司。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。RIPA裂解液購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所（貨號(hào)p0017B）。

1.3 儀器與設(shè)備 Penguin－600CL－OYLMPUS BX51圖像分析系統(tǒng)：美國(guó)BIOPAC公司；PH070Am電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；Centrifuge 5417R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf；EPS－301電泳儀：美國(guó)Amersham公司；Gel Doc XR凝膠圖像分析儀：美國(guó)Bio－RAD公司。

2 方法

2.1 模型復(fù)制方法［2］將大鼠右后踝關(guān)節(jié)屈曲，用手觸摸，可捫及兩骨突部，局部無(wú)菌操作后，用6號(hào)注射針自?xún)晒峭婚g進(jìn)針，感覺(jué)有突破感后，證明針頭進(jìn)入踝關(guān)節(jié)內(nèi)，注入0.2ml尿酸鈉混懸液（濃度為100mg／ml），正常對(duì)照組注入等量生理鹽水。注射尿酸鈉混懸液24h后，觀(guān)察右后踝關(guān)節(jié)，如有明顯腫脹，即表明模型復(fù)制成功。

2.2 分組及給藥 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，40只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、秋水仙堿組、刺血艾灸組，每組10只，后3組大鼠均進(jìn)行模型復(fù)制。模型復(fù)制24h后對(duì)各組大鼠進(jìn)行治療。分組治療3d，所有動(dòng)物均在上午10：00—11：00定時(shí)治療。各組均自由飲水和普食飼養(yǎng)。

2.2.1 秋水仙堿組［3］：先將秋水仙堿碾磨成粉，然后將其溶于生理鹽水中以制成混懸液，每日按0.135 mg／kg劑量灌胃，共灌胃治療3d。

2.2.2 刺血艾灸組：于右后踝關(guān)節(jié)最腫處去除周?chē)っ?，常?guī)無(wú)菌操作后，以三棱針點(diǎn)刺，擠出血3～5滴，然后將大鼠仰臥位束縛在大鼠固定木板上，將艾條固定在自制艾灸架上，艾條點(diǎn)燃部位離穴位約3cm，每次10min左右，以局部皮膚潮紅為度，每日1次，共3d。

2.2.3 正常對(duì)照組和模型組：予等量生理鹽水灌胃，10ml／kg，每日1次，共3d。

2.3 觀(guān)測(cè)指標(biāo)與方法

2.3.1 一般觀(guān)察：觀(guān)察大鼠的外觀(guān)、性情、活動(dòng)等情況。

2.3.2 右后足腫脹度：試驗(yàn)前每只大鼠右后足踝關(guān)節(jié)處用記號(hào)筆作一清晰橫線(xiàn)，分別于模型復(fù)制時(shí)、模型復(fù)制后24h及治療后3d用自制容積測(cè)定儀［4］測(cè)量大鼠足趾容積。給藥前腫脹度＝（給藥前足容積－致炎前足容積）／致炎前足容積×100％，給藥后腫脹度＝（給藥后足容積－給藥前足容積）／給藥前足容積×100％。

2.3.3 血清尿酸（uric acid，UA）水平檢測(cè)：末次治療24h后，用20％烏拉坦溶液按0.5ml／kg劑量予腹腔內(nèi)注射麻醉后，仰位固定。從腹主動(dòng)脈取血約2ml，4 000r／min離心10min，取血清，采用酶比色法檢測(cè)UA水平。

2.3.4 RT－PCR法檢測(cè)TLR2、TLR4mRNA表達(dá)：末次治療24h后，用20％烏拉坦溶液按0.5 ml／kg劑量予腹腔內(nèi)注射麻醉后，仰位固定。從腹主動(dòng)脈取血約2ml，置枸櫞酸鈉抗凝試管內(nèi)，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，重懸于RPMI－1640培養(yǎng)基，置12孔塑料皿內(nèi)，于37℃、含5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60min后，Trizol法提取外周血單個(gè)核細(xì)胞的總RNA，生物紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的純度和總量。根據(jù)Gene Bank提供的引物序列，使用Primer 5軟件設(shè)計(jì)并分析引物。以此RNA為模板，加入2.5mmol／L olig（dT）18及莫洛尼氏鼠白血病毒逆轉(zhuǎn)錄酶（moloney murine leukemia virus reverse transcriptase，M－MLV RT）。TLR2mRNA與TLR4mRNA擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性2min，然后進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增，即97℃變性1.5min→56℃退火1 min→72℃延伸1min，循環(huán)次數(shù)分別為35、32次，最后再72℃延伸10min。內(nèi)參擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性2min，然后進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增，即95℃變性1.5 min→56℃退火1min→72℃延伸1min，循環(huán)36次，最后再72℃延伸10min。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。引物序列及反應(yīng)條件、擴(kuò)增長(zhǎng)度見(jiàn)表1。采用Image－pro plus軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析，計(jì)算電泳條帶的累積光密度（integral optical density，IOD），以TLR2、TLR4與還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide－adenine dinucleotide phosphate，NADPH）的IOD比值作為T(mén)LR2mRNA及TLR4mRNA表達(dá)的相對(duì)含量。

表1 各引物序列、反應(yīng)條件、循環(huán)次數(shù)和擴(kuò)增長(zhǎng)度

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，連續(xù)性變量采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）”進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述，等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)，兩組間均數(shù)比較采用LSD法（方差齊）或Dunnett T3法（方差不齊）。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠一般情況觀(guān)察 實(shí)驗(yàn)期間，正常對(duì)照組大鼠行動(dòng)靈活，反應(yīng)靈敏。模型組大鼠出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹，精神不振，患肢屈曲因痛不能著地。刺血艾灸組和秋水仙堿組大鼠精神狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，致炎關(guān)節(jié)腫脹明顯減退，其中刺血艾灸組好轉(zhuǎn)更為明顯。

3.2 各組大鼠足趾腫脹度比較 致炎前各組大鼠足跖腫脹度無(wú)明顯差異（P＞0.05）；模型復(fù)制后24 h，模型組、刺血艾灸組、秋水仙堿組大鼠足跖腫脹度顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01）；治療后3d，刺血艾灸組和秋水仙堿組大鼠足跖腫脹度較模型組顯著減輕（P＜0.01），刺血艾灸組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度顯著低于秋水仙堿組（P＜0.01）。見(jiàn)表2。

3.3 各組大鼠血清UA含量及TLR2、TLR4mRNA表達(dá)水平比較 與正常對(duì)照組相比，模型組血清UA含量及TLR2、TLR4mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，刺血艾灸組和秋水仙堿組血清UA含量及TLR2、TLR4mRNA表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05，或P＜0.01）；刺血艾灸組血清UA含量及TLR2、TLR4mRNA表達(dá)水平顯著低于秋水仙堿組（P＜0.05，或P＜0.01）。見(jiàn)表3、圖1。

表2 各組大鼠足趾腫脹度比較（±s）

表2 各組大鼠足趾腫脹度比較（±s）

注：與正常組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；與秋水仙堿組比較，＃＃P＜0.01。

組 別n足趾腫脹度／％ 3d正常對(duì)照模型復(fù)制前模型復(fù)制后24h治療后10 1.93±0.22 2.14±0.27 2.45±0.14模 型10 1.94±0.20 15.05±0.61＊＊14.55±0.61＊＊秋水仙堿10 1.94±0.18 14.97±0.51＊＊10.59±0.71＊＊△△刺血艾灸10 1.95±0.22 14.63±0.51＊＊6.61±0.87＊△△＃＃

表3 各組大鼠血清UA含量及TLR2、TLR4mRNA表達(dá)水平比較（±s）

表3 各組大鼠血清UA含量及TLR2、TLR4mRNA表達(dá)水平比較（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與秋水仙堿組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組 別n TLR2mRNA TLR4mRNA UA／（μmol／L）正常對(duì)照10 0.46±0.06 0.37±0.05 78.18±6.66模 型10 0.89±0.05＊＊0.80±0.05＊＊122.63±8.62＊＊秋水仙堿10 0.68±0.05＊＊△△0.68±0.06＊104.08±7.20＊＊△△刺血艾灸10 0.51±0.05＊＊△△＃＃0.53±0.07＊＊△△＃86.63±8.78＊△△△＃

圖1 各組大鼠TLR2和TLR4mRNA表達(dá)水平比較（M.NADPH；a.正常對(duì)照組；b.模型組；c.刺血艾灸組；d.秋水仙堿組）

4 討論

炎性細(xì)胞、細(xì)胞因子及炎性體對(duì)于痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展直至自然緩解具有重要意義，其中炎性體包括細(xì)胞內(nèi)大分子、多蛋白復(fù)合體，能夠激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶－1，促進(jìn)促炎因子白細(xì)胞介素－1β（interleukin－1beta，IL－1β）和IL－18的加工和成熟，引起細(xì)胞死亡。TLRs是與痛風(fēng)關(guān)系密切的細(xì)胞因子，是模式識(shí)別受體的一種，在抗感染免疫中首先被人們認(rèn)識(shí)，其在固有免疫和炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生及信號(hào)傳遞過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其中TLR2和TLR4協(xié)同鏈接蛋白髓樣分化因子識(shí)別尿酸鹽結(jié)晶，從而啟動(dòng)細(xì)胞信號(hào)級(jí)聯(lián)放大，最終激活一系列促炎細(xì)胞因子和啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答，這也是痛風(fēng)發(fā)作的病理學(xué)標(biāo)志［5］。近期研究發(fā)現(xiàn)，痛風(fēng)急性發(fā)作期體內(nèi)TLR2和TLR4的表達(dá)水平明顯升高，而采用抗炎、調(diào)節(jié)免疫等干預(yù)治療后則TLR2、TLR4表達(dá)水平明顯下調(diào)［6］，這與針對(duì)敲除TLRs基因的缺陷鼠的研究結(jié)果相一致［7］。

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)學(xué)“歷節(jié)”“白虎歷節(jié)風(fēng)”“痹病”范疇?！夺樉拇蟪伞分^其“病有三因，皆從氣血”，《千金方》認(rèn)為其病因?yàn)椤盁岫練鈴呐K腑出，攻于手足”，朱丹溪在《格致余論》中指出痛風(fēng)是“血中有熱，再受風(fēng)寒，熱血得寒，痰濁凝澀引起”，這些均說(shuō)明急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎與血中瘀熱有關(guān)。

中醫(yī)學(xué)早已論及刺血療法的作用機(jī)制。《素問(wèn)·調(diào)經(jīng)論》認(rèn)為：“血有余，則瀉其盛經(jīng)，出其血，視其血絡(luò)，刺出其血，惡血得入于經(jīng)，以成其疚”；“病在脈，調(diào)之血；病在血，調(diào)之絡(luò)”?！鹅`樞·小針解》：“除之者，去血脈也?！薄端貑?wèn)·針解》說(shuō)：“除之，出惡血也，邪勝則虛之，出針勿按。”使癖阻祛除、氣血通暢，以達(dá)到治療目的。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為艾屬溫性，其味芳香，善通十二經(jīng)脈，具有理氣血、逐寒濕、溫經(jīng)、解毒等作用。在艾灸治療過(guò)程中，艾葉燃燒后產(chǎn)生的溫?zé)嵝?yīng)滲透諸經(jīng)，起到治療作用。刺血及艾灸療法現(xiàn)已被臨床認(rèn)可，尤其在治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎方面療效確切［8－11］。

本研究結(jié)果提示：刺血加艾灸療法能夠緩解急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)疼痛，改善關(guān)節(jié)腫脹度，下調(diào)尿酸水平，其機(jī)制可能與其下調(diào)TLR2和TLR4 mRNA表達(dá)水平有關(guān)。

［1］邊麗娜，程宇.針灸治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的療效及機(jī)理研究進(jìn)展［J］.針灸臨床雜志，2009，25（7）：58－60.

［2］Coderre TJ，Wall PD.Ankle joint urate arthritis in rats provides a useful tool for the evaluation of analgesic and anti－arthritic agents［J］.Pharmacol Biochem Behav，1988，29（3）：461－466.

［3］許延文.痹清膠囊抗痛風(fēng)作用的實(shí)驗(yàn)研究［D］.哈爾濱：黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，2005：35.

［4］徐叔云，卞如濂，陳修，等.藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：920－921.

［5］Krishnan J，Selvarajoo K，Tsuchiya M，et a1.Toll－like receptors signal transduction［J］.Exp Mol Med，2007，39（4）：421－438.

［6］蔣莉，周京國(guó)，青玉鳳，等.Toll樣受體2和Toll樣受體4及其信號(hào)通路在原發(fā)性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中作用的研究［J］.中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2011，15（5）：300－304.

［7］Liu－Bryan R，Scott P，Sydlaske A，et al.Innate immunity conferred by Toll－like receptors 2and 4and myeloid differentiation factor 88expression is pivotal to monosodium urate monohydrate crystal－induced inflammation［J］.Arthritis Rheum，2005，52（9）：2936－2946.

［8］金晨宇，孫梅，溫成平，等.祛濁通痹顆粒對(duì)急性痛風(fēng)模型炎癥因子的調(diào)節(jié)作用［J］.中草藥，2007，38（8）：1223－1225.

［9］李揚(yáng)，任開(kāi)明，蔡克銀，等.威柏膏外敷治療大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2012，30（7）：1587－1589.

［10］陳燕琴，李秀娟.針刺結(jié)合刺血療法治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎臨床研究［J］.湖北中醫(yī)雜志，2013，35（3）：63－64.

［11］黎文杰.刺絡(luò)放血配合中藥外敷治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎43例療效觀(guān)察［J］.四川中醫(yī)，2013，31（6）：142－144.

Effects of Moxibustion Combined with Blood－pricking Therapy on mRNA Expression of Toll－like Receptor 2 and Toll－like Receptor 4in Peripheral Blood Mononuclear Cells among Rats with Acute Gouty Arthritis

ZHU Yan
（The Acupuncture and Moxibustion Hospital Affiliated to Anhui University of Chinese Medicine，Anhui Hefei 230061，China）

Objective To investigate the action mechanism of moxibustion combined with blood－pricking therapy in the treatment of acute gouty arthritis.Methods Forty male Wistar rats were randomly and equally divided into normal control group，model group，colchicine group，and moxibustion／blood－pricking therapy group.A rat model of gouty arthritis was induced by injecting sodium urate suspension（0.2ml）into the right hind ankle joint.The degree of swelling of right hind foot was determined based on the toe volumes measured when the model was induced，at 24hafter the model was induced，and after 3dof treatment.Three days after treatment，blood samples were taken from the abdominal aorta，and the serum uric acid（UA）level and mRNA expression of Toll－like receptor 2（TLR2）and Toll－like receptor 4（TLR4）in peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）were measured.Results Compared with the normal control group，the model group had significantly increased foot swelling，serum UA level，and mRNA expression of TLR2and TLR4（P＜0.01）.Compared with the model group and colchicine group，the moxibustion／blood－pricking therapy group had significantly reduced foot swelling，serum UA level，and mRNA expression of TLR2and TLR4（P＜0.05or P＜0.01）.Conclusion Moxibustion combined with blood－pricking therapy can reduce joint swelling and serum UA level in rats with gouty arthritis，which may be related to down－regulated expression of TLR2and TLR4in PBMCs.

gouty arthritis；blood－pricking therapy；moxibustion；Toll－like receptor；uric acid

R684.3

A

10.3969／j.issn.2095－7246.2014.01.019

2013－07－21）

安徽中醫(yī)學(xué)院青年科學(xué)基金項(xiàng)目（2012qn042）

朱艷（1977－），女，博士，主治醫(yī)師