黃 懿，丁留成綜述，衛(wèi)中慶審校

0 引 言

臨床許多疾病如膀胱收縮功能障礙、血管損傷等引起平滑肌組織功能障礙，其治療手段單一、療效欠佳。近年來，組織工程作為“再生醫(yī)學”逐漸進入到此類疾病研究中，干細胞是其廣泛研究和利用的一種手段。間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell，MSCs)是干細胞的一種，具有自我更新、多向分化和歸巢的能力，在特定的體內(nèi)外環(huán)境下，能夠誘導分化成為多種組織細胞，如內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、心肌細胞等。MSCs強大的增殖分化能力以及其來源廣泛、取材容易、擴增能力強、免疫原性低、容易進行自體移植等特點使其逐漸成為治療人類多種疾病潛在的種子細胞。

迄今為止，MSCs在細胞治療及組織工程中得到了諸多應用［1-3］，但MSCs移植應用于治療面臨兩方面問題:①MSCs移植后在局部組織中定植、存活的效率難以保證;②定向分化效率問題，MSCs具有向多種組織分化的潛能，但在移植組織內(nèi)，MSCs的生存環(huán)境發(fā)生改變，移植后能否向我們期望的方向分化。如何提高MSCs移植后在局部病理環(huán)境中的耐受性，增加細胞歸巢定植數(shù)量，現(xiàn)就此方面的相關研究進展作一綜述。

1 MSCs在組織中的歸巢定植

所謂MSCs歸巢，指自體的或者外源性MSCs在多種因素作用下，定向趨化遷移至靶器官的病變或損傷組織。這是MSCs有望應用于臨床治療的重要前提，只有增加MSCs歸巢及定植的能力，才能從根本上提高細胞治療的效率。早期的研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)環(huán)境可影響MSCs所表達的趨化因子及其受體，這些趨化因子可能促使了MSCs在體內(nèi)的遷移和定植［4］。另外，有報道發(fā)現(xiàn)通過靜脈滴注的方式注入體內(nèi)，MSCs會趨向那些創(chuàng)傷部位，并在靜滴過程中有著修復創(chuàng)傷和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的功能［5］。這些研究表明，MSCs的歸巢定植可能與一些細胞因子有關。近些年，有關MSCs遷移運動的機制的研究又有新的發(fā)現(xiàn)。

1.1 基質(zhì)細胞衍生因子(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)/CXCR4信號通路 SDF-1即CXCL12，屬于趨化因子家族中的CXC亞族。SDF-1及其受體CXCR4組成的CXCL12/CXCR4軸在干細胞的募集和遷移中發(fā)揮著重要作用。Kitaori等［6］發(fā)現(xiàn)，SDF-1信號傳導通路受損會導致MSCs喪失趨向創(chuàng)傷部位的定向遷移運動，可見SDF-1(CXCL12)/CXCR4通路在MSCs的趨化遷移過程中發(fā)揮著關鍵作用。通過對其合成和分泌機制的研究，發(fā)現(xiàn)SDF-1的分泌過程受到連接蛋白-43(Cx43)和連接蛋白-45(Cx45)縫隙連接的調(diào)控，但合成過程和這些連接蛋白并不相關［7］。隨著基因轉(zhuǎn)染技術的興起，一些有利于細胞歸巢運動的基因逐漸得到了關注。相關研究通過Snail基因轉(zhuǎn)染MSCs的方法提高了細胞中CXCR4的表達，觀察到MSCs的遷移活性得到明顯的增強［8］。同時，Piva 等［9］發(fā)現(xiàn)一種稱為 Slug 的鋅指結構轉(zhuǎn)錄因子能在轉(zhuǎn)錄過程中控制SDF-1的表達，能有效增加SDF-1在特定部位表達補充。SDF-1/CXCR4通路涉及MSCs的存活、遷移和細胞因子的分泌［10］，是目前此方面研究的熱點。

1.2 晚期糖基化產(chǎn)物(advanced glycation products，AGEs)AGEs是一種內(nèi)源性炎癥調(diào)節(jié)因子，調(diào)節(jié)MSCs的生理功能。通過相關機制研究發(fā)現(xiàn)，AGEs能通過激活活性氧-p13通路，誘導產(chǎn)生諸如CC趨化因子的配體Ccl2、Ccl3、Ccl4和白細胞介素-Ⅱ這些細胞因子，進而抑制MSCs的生長和遷移［11］。同時，AGEs還能促使細胞端粒酶的衰老(端粒酶為造血細胞、干細胞、生殖細胞所特有，可延長細胞端粒，增強細胞增殖能力)，從而影響了MSCs的生存遷移能力［12］。可見，合理地控制體內(nèi)的糖代謝，在細胞治療過程中尤為重要。

1.3 RhoA/Rho激酶信號通路 轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)是一種對細胞的形態(tài)發(fā)生、增殖和分化過程起著重要作用的細胞因子，廣泛用于細胞培養(yǎng)，可刺激間充質(zhì)起源細胞的增殖和分化能力。Xu等［13］研究發(fā)現(xiàn)，RhoA/Rho激酶信號通路可通過與Smad通路相互作用，刺激TGF-β的分泌，有利于MSCs的定植生存。最近還有研究發(fā)現(xiàn)，MSCs向組織缺氧損傷部位定向遷移的趨化運動，也與RhoA激酶的活性密切相關［14］。由此表明，對RhoA/Rho激酶信號通路的適當干預可能有利于MSCs在細胞治療過程中的遷移和有效增殖。

2 MSCs向平滑肌平滑肌細胞(smooth muscle cells，SMCs)的分化

平滑肌廣泛分布在血管、胃腸道、氣管以及膀胱等處，其功能損害能引起一系列疾病，如動脈硬化和膀胱逼尿肌收縮無力等，嚴重影響生活質(zhì)量。隨著組織工程研究的興起，通過將MSCs向SMCs的分化和補充，有望解決一系列臨床難題。

平滑肌細胞可分為收縮細胞和合成細胞，收縮性平滑肌細胞表達著一系列特殊收縮蛋白，合成性平滑肌細胞則表現(xiàn)出更高的增殖活性，且抑制著這些收縮性蛋白。如何將MSCs誘導分化出平滑肌組織的同時又保證其收縮功能，是目前亟待解決的問題。在體外培養(yǎng)過程中，以往使用TGF-β或者血栓素A2將BMSCs向平滑肌進行誘導分化［15-16］。

MSCs完成歸巢定植后，如何定向分化成為目標功能性組織，是細胞治療的又一個關鍵環(huán)節(jié)。其中，MSCs的成平滑肌分化目前仍未提出確切的方案，近些年有關MSCs定向分化并增殖成為平滑肌細胞的相關機制研究逐漸成為熱點，又不斷有新的理論提出。

2.1 全反式維甲酸(All-trans retinoic acid，atRA)atRA又稱維A酸，是一種常見的抗腫瘤藥。其也在平滑肌發(fā)育成熟過程中也發(fā)揮著關鍵作用，可增加肌動蛋白、鈣調(diào)蛋白、22ka平滑肌細胞特殊蛋白和平滑肌肌球蛋白重鏈等收縮性蛋白的表達，即促進平滑肌細胞收縮表型的形成。在MSCs的定向分化過程中，添加atRA能促進分化細胞的收縮能力，但同時MSCs的增殖性受到影響［17］。

2.2 TGF-β1和PDGF-BB 平滑肌 α 肌動蛋白、鈣調(diào)蛋白和SM-MHC分別是平滑肌分化的早期、中期和后期的標記物，常以此檢測平滑肌的分化程度。早期的研究證實，TGF-β1在0.1～10 ng/mL的濃度范圍內(nèi)可顯著增加鈣調(diào)蛋白的表達［18］。最近研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1在1～5 ng表現(xiàn)出誘導 MSCs向 SMCs分化的能力，在1 ng/mL下表現(xiàn)出最強的誘導能力［19］。人血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor，PDGF-BB)是一種重要的促有絲分裂因子，時常用于細胞培養(yǎng)中，將TGF-β1和PDGF-BB聯(lián)合應用，可有效提高MSCs的分化增殖效率［20］。

2.3 Myocardin-MicroRNA-1信號通路 近年來，有研究表明促血管平滑肌細胞分化因子(myocardin)在誘導SMCs的收縮表型的形成過程中發(fā)揮著關鍵作用［21］。Myocardin是一種血清應答因子共激活物，其過度表達可誘導MicroRNA-1的表達，抑制SMCs的增殖能 力［22］。通過 抑 制 myocardin 和MicroRNA-1的表達水平，進而解除了 myocardin-MicroRNA-1信號通路后，可促進平滑肌增殖，更快修復損傷組織。同時，在myocardin與Smad 2基因的協(xié)同作用下，myocardin可與 TGF-β聯(lián)合誘導MSCs向平滑肌分化，效率較高［23］。但如何兼顧MSCs的增殖和分化能力，還有待對于此信號通路的進一步研究。

2.4 膠原蛋白Ⅰ和Ⅳ及非細胞基質(zhì) 在大多數(shù)研究中，我們通常在培養(yǎng)基中添加TGF-β1和PDGF-BB來完成MSCs向SMCs的誘導分化，近期又有研究將膠原蛋白Ⅰ和Ⅳ及來源膀胱的非細胞基質(zhì)添加入培養(yǎng)基中。結果發(fā)現(xiàn)，相比TGF-β1和PDGF-BB能加強細胞分化能力，膠原蛋白Ⅰ和Ⅳ及相關非細胞基質(zhì)主要作用在于維持MSCs的未分化階段，增強其增殖再生能力，并未表現(xiàn)出誘導分化的趨向［20］。

2.5 多功能性尿激酶受體(urokinasetype plasrinogen activator receptor，uPAR) 已知uPAR能通過激活細胞內(nèi)相關信號通路，調(diào)控多種組織中細胞的遷移、附著、增殖和分化。最近，Vallabhaneni等［24］發(fā)現(xiàn)，缺乏uPAR的MSCs表現(xiàn)出趨化遷移和平滑肌組織修復能力的降低，表明uPAR的表達水平同MSCs的遷移以及定向分化能力密切相關。這表示uPAR可能引導MSCs向損傷部位遷移，并調(diào)控著MSCs向功能性SMCs的分化。

2.6 支架材料 MSCs用于平滑肌組織重建往往需要合適的支架材料提供組織生長需要的環(huán)境。其中，組織工程膀胱用于臨床由來已久，多項研究相繼報道了MSCs完成了向膀胱SMCs的分化及膀胱組織損傷的修復和置換［25-26］。配合使用PDGF-BB、TGF-β1和VEGF等細胞生長因子誘導成平滑肌分化。在膀胱SMCs的分化過程中，支架的設計和材料也有著重要的作用，最近也有了新的發(fā)現(xiàn):①有研究通過將hMSCs種植在聚乙烯1，8-辛二醇-檸檬酸彈性薄膜上，發(fā)現(xiàn)能在體內(nèi)更好地支持部分膀胱組織的再生。1，8-辛二醇-檸檬酸彈性薄膜可順應壓力的變化，也適合MSCs貼壁生長的特性，從而為hMSCs向膀胱組織的再生提供一個合適的環(huán)境［27］。②還有研究將BMSCs種植在羊膜表面，再將羊膜固定在生物海綿上并移植入大鼠模型中，以此提升BMSCs再生膀胱壁的能力，但結果顯示此類方法能促進膀胱壁再生，但未測得明顯收縮力，難以保證膀胱功能［28］。此外，膀胱來源的細胞外基質(zhì)也是重要的支持物質(zhì)，將MSCs和SMCs一同種植入這些基質(zhì)中或許可增加組織重建的效率［29］。

3 結 語

MSCs作為來源廣泛、分化潛能強大的干細胞，是目前細胞治療和組織工程的新興研究熱點。臨床工作中，我們經(jīng)常遇到許多因組織器官損傷而出現(xiàn)功能失代償?shù)募膊?，如關節(jié)軟骨的損傷、心肌梗死、糖尿病膀胱等，MSCs的深入研究給其帶來治療希望。然而，要將MSCs真正應用于臨床，目前還需要解決其歸巢定植和定向分化等一系列問題。MSCs的遷移過程牽涉到了一系列趨化因子和細胞因子，通過對相應細胞因子的調(diào)控提高MSCs的定植和歸巢運動，但目前還沒有提出簡單而有效的解決方法。最近，也不斷有新的理論提出，例如成人外周血、新生兒臍帶血來源的內(nèi)皮祖細胞或者臍帶靜脈內(nèi)皮細胞，可通過MSCs細胞間的連接及細胞外調(diào)解激酶，加強 MSCs的貼壁能力及 SMCs標志基因的表達［30］。另外，利用MSCs的相關應用研究也取得初步進展。Du 等［31］和 Gunetti等［32］將 MSCs應用于動物壓力性尿失禁治療的研究中，MSCs的成肌分化和療效評價肯定了此類細胞治療的價值。Chen等［33］在膀胱慢性缺血伴逼尿肌收縮功能障礙的大鼠模型中，注射MSCs配合甲磺酸多沙唑嗪灌胃給藥，使移植的干細胞在膀胱組織再生，得到了積極的療效。如今，MSCs成平滑肌分化的理論眾多，但尚未有研究提出明確的指導方案。同時，細胞治療起步不久，技術相對不完善，如何將MSCs運用到種子細胞的培養(yǎng)并有效分化為功能性組織，以及開發(fā)出合適的支架以供植入組織的存活分化，是值得關注的問題。

目前，大量有關MSCs的有利基因的過表達的研究在逐步開展［34-35］，但對于MSCs成平滑肌分化還存有大量的空白，進一步深入研究對平滑肌功能障礙所引起的疾病的臨床治療將產(chǎn)生深遠的影響。

［1］ Steinert AF，Rackwitz L，Gilbert F，et al.Concise review:the clinical application of mesenchymal stem cells for musculoskeletal regeneration:current status and perspectives［J］.Stem Cells Transl Med，2012，1(3):237-247.

［2］ Ricart E.Current status of mesenchymal stem cell therapy and bone marrow transplantation in IBD［J］.Dig Dis，2012，30(4):387-391.

［3］ Wang S，Qu X，Zhao RC.Clinical applications of mesenchymal stem cells［J］.J Hematol Oncol，2012，5(5):19-27.

［4］ Honczarenko M，Le Y，Swierkowski M，et al.Human bone marrow stromal cells Express a distinct set of biologically functional chemokine receptors［J］.Stem Cells，2006，24(4):1030-1041.

［5］ Xu J，Woods CR，Mora AL，et al.Prevention of endotoxin-induced systemic response by bone marrow-derived mesenchymal stem cells in mice［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2007，293(1):L131-L141.

［6］ Kitaori T，Ito H，Schwarz EM，et al.Stromal cell-derived factor 1/CXCR4 signaling is critical for the recruitment of mesenchymal stem cells to the fracture site during skeletal repair in a mouse model［J］.Arthritis Rheum，2009，60(3):813-823.

［7］ Schajnovitz A，Itkin T，D'uva G，et al.CXCL12 secretion by bone marrow stromal cells is dependent on cell contact and mediated by connexin-43 and connexin-45 gap junctions［J］.Nat Im-munol，2011，12(5):391-398.

［8］ Ni J，Liu X，Zha Y，et al.Effects of snail gene modification on CXCR4 expression of human bone mesenchymal stem cells and their capacity of migration to SDF-1 in vitro［J］.Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao，2009，25(2):242-250.

［9］ Piva R，Manferdini C，Lambertini E，et al.Slug contributes to the regulation of CXCL12 expression in human osteoblasts［J］.Exp Cell Res，2011，317(8):1159-1168.

［10］ Liu X，Duan B，Cheng Z，et al.SDF-1/CXCR4 axis modulates bone marrow mesenchymal stem cell apoptosis，migration and cytokine secretion［J］.Protein Cell，2011，2(10):845-854.

［11］ Yang K，Wang XQ，He YS，et al.Advanced glycation end products induce chemokine/cytokine production via activation of p38 pathway and inhibit proliferation and migration of bone marrow mesenchymal stem cells［J］.Cardiovasc Diabetol，2010，9(9):66-75.

［12］ Larsen SA，Kassem M，Rattan SI.Glucose metabolite glyoxal induces senescence in telomerase-immortalized human mesenchymal stem cells［J］.Chem Cent J，2012，6(1):18-30.

［13］ Xu T，Wu M，F(xiàn)eng J，et al.RhoA/Rho kinase signaling regulates transforming growth factor-β1-induced chondrogenesis and actin organization of synovium-derived mesenchymal stem cells through interaction with the Smad pathway［J］.Int J Mol Med，2012，30(5):1119-1125.

［14］ Vertelov G，Kharazi L，Muralidhar MG，et al.High targeted migration of human mesenchymal stem cells grown in hypoxia is associated with enhanced activation of RhoA［J］.Stem Cell Res Ther，2013，4(1):5-13.

［15］ Wang D，Park JS，Chu JS，et al.Proteomic profiling of bone marrow mesenchymal stem cells upon transforming growth factor beta1 stimulation［J］.J Biol Chem，2004，279(42):43725-43734.

［16］ Kim MR，Jeon ES，Kim YM，et al.Thromboxane a(2)induces differentiation of human mesenchymal stem cells to smooth muscle-like cells［J］.Stem Cells，2009，27(1):191-199.

［17］ Su ZY，Li Y，Zhao XL，et al.All-trans retinoic acid promotes smooth muscle cell differentiation of rabbit bone marrow-derived mesenchymal stem cells［J］.J Zhejiang Univ Sci B，2010，11(7):489-496.

［18］ Gong Z，Niklason LE.Use of human mesenchymal stem cells as alternative source of smooth muscle cells in vessel engineering［J］.Methods Mol Biol，2011，698:279-294.

［19］ Guo X，Stice SL，Boyd NL，et al.A novel in vitro model system for smooth muscle differentiation from human embryonic stem cell-derived mesenchymal cells［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2013，304(4):C289-C298.

［20］ Antoon R，Yeger H，Loai Y，et al.Impact of bladder-derived acellular matrix，growth factors，and extracellular matrix constituents on the survival and multipotency of marrow-derived mesenchymal stem cells［J］.J Biomed Mater Res A，2012，100(1):72-83.

［21］ Long X，Bell RD，Gerthoffer WT，et al.Myocardin is sufficient for a smooth muscle-like contractile phenotype［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2008，28(8):1505-1510.

［22］ Chen J，Yin H，Jiang Y，et al.Induction of microRNA-1 by myocardin in smooth muscle cells inhibits cell proliferation［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2011，31(2):368-375.

［23］ Wang N，Ren GD，Zhou Z，et al.Cooperation of myocardin and Smad2 in inducing differentiation of mesenchymal stem cells into smooth muscle cells［J］.IUBMB Life，2012，64(4):331-339.

［24］ Vallabhaneni KC，Tkachuk S，Kiyan Y，et al.Urokinase receptor mediates mobilization，migration，and differentiation of mesenchymal stem cells［J］.Cardiovasc Res，2011，90(1):113-121.

［25］ Jack GS，Zhang R，Lee M，et al.Urinary bladder smooth muscle engineered from adipose stem cells and a three dimensional synthetic composite［J］.Biomaterials，2009，30(19):3259-3270.

［26］ Shukla D，Box GN，Edwards RA，et al.Bone marrow stem cells for urologic tissue engineering［J］.World J Urol，2008，26(4):341-349.

［27］ Sharma AK，Hota PV，Matoka DJ，et al.Urinary bladder smooth muscle regeneration utilizing bone marrow derived mesenchymal stem cell seeded elastomeric poly(1，8-octanediol-co-citrate)based thin films［J］.Biomaterials，2010，31(24):6207-6217.

［28］ Adamowicz J，Juszczak K，Bajek A，et al.Morphological and urodynamic evaluation of urinary bladder wall regeneration:muscles guarantee contraction but not proper function--a rat model research study［J］.Transplant Proc，2012，44(5):1429-1434.

［29］ Liao W，Yang S，Song C，et al.Construction of ureteral grafts by seeding bone marrow mesenchymal stem cells and smooth muscle cells into bladder acellular matrix［J］.Transplant Proc，2013，45(2):730-734.

［30］ Goerke SM，Plaha J，Hager S，et al.Human endothelial progenitor cells induce extracellular signal-regulated kinase-dependent differentiation of mesenchymal stem cells into smooth muscle cells upon cocultivation［J］.Tissue Eng Part A，2012，18(23-24):2395-2405.

［31］ Du XW，Wu HL，Zhu YF，et al.Experimental study of therapy of bone marrow mesenchymal stem cells or muscle-like cells/Calcium alginate composite gel for the treatment of stress urinary incontinence［J］.Neurourol Urodyn，2013，32(3):281-286.

［32］ Gunetti M，Tomasi S，Giammò A，et al.Myogenic potential of whole bone marrow mesenchymal stem cells in vitro and in vivo for usage in urinary incontinence［J］.PLoS One，2012，7(9):e45538.

［33］ Chen S，Zhang HY，Zhang N，et al.Treatment for chronic ischaemia-induced bladder detrusor dysfunction using bone marrow mesenchymal stem cells:an experimental study［J］.Int J Mol Med，2012，29(3):416-422.

［34］ 王利平，包曉晨，魏 瑋，等.攜帶可誘導共刺激分子基因的重組腺病毒載體構建及其在小鼠間充質(zhì)干細胞中的表達［J］.醫(yī)學研究生學報，2012，25(9):909-914.

［35］ 李紅霞，周亞峰，蔣 彬，等.大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞轉(zhuǎn)染GATA-4的表達及鑒定［J］.醫(yī)學研究生學報，2013，26(3):228-231.