曹桎銘綜述，石 蓓審校

0 引 言

既往研究認為心臟是一個終末分化器官。2003年Beltrami等［1］首次在成年大鼠心臟內發(fā)現了一類具有再生能力的心臟干細胞(cardiac stem cell，CSC)，之后許多研究也證實了這類細胞的存在［2-4］。最近Bergmann等［5］報道了正常成人心臟心肌細胞平均每年更新1%，約40%的心肌是由出生后新生的心肌細胞組成。這些證據推翻了心臟缺乏自我更新潛能的傳統(tǒng)觀點，為細胞再生治療翻開一頁嶄新篇章。

目前已在大鼠［1］、小鼠［2］、豬［6］、犬［7］、和人［8］的心臟均發(fā)現CSC的存在。CSC是未分化細胞，部分表達心臟早期轉錄因子(Nkx2.5、MEF2、GATA4)［9］，其主要存儲于心肌內干細胞小生境中，以對稱和非對稱方式分裂，具有自我更新和定向分化能力［8，10］，由于其自體來源，因此在心血管治療方面比其他類型成體干細胞更具優(yōu)勢。根據CSC生物學特性及表面標志物，將其分為幾種類型:c-kit+細胞、Sca1-1+細胞、側群細胞、心球或心球衍生細胞、心耳干細胞、Islet1+、心外膜衍生細胞等。

1 CSC群

1.1 c-kit+CSC c-kit+CSC是目前發(fā)現最早、研究最深入的一類CSC。2003年Beltrami等［1］首次在成年大鼠心臟發(fā)現并分離出c-kit+Lin-細胞，發(fā)現其具有干細胞的特性，即自我更新、克隆性和多向分化能力;能特異分化為心肌細胞、內皮細胞和血管平滑肌細胞3種主要心系細胞類型，并在體內顯示了心肌梗死后的心肌再生潛能。其后許多研究也得到了相似的結果。

目前發(fā)現c-kit+CSC包括2種不同亞群:肌源性(mCSC)和血管源性(vCSC)［11］。前者主要表達c-kit，定居于成熟心肌細胞間的肌細胞小生境中，主要分化為心肌細胞，后者表達c-kit和內皮細胞標志物 (kinase insert domain-containing receptor，KDR)，存儲于血管壁的血管小生境中，主要分化為內皮細胞和血管平滑肌細胞。體外培養(yǎng)發(fā)現2種CSC均能特異分化為心肌細胞、內皮細胞和血管平滑肌細胞，但mCSC分化為肌細胞數是vCSC的6倍，vCSC分化為平滑肌細胞數是mCSC的6倍，內皮細胞數是mCSC的5倍［8］。c-kit+CSC在心房和心尖含量豐富，心房分布高于心室［12］，以靜止狀態(tài)存儲于心臟小生境，通過連接蛋白和鈣黏素與周圍支持細胞形成連接，活化后遷移出小生境更新衰老或損傷心?。?1］。c-kit+CSC活化遷移機制可能與心肌梗死后多種趨化因子分泌增加相關。例如，低氧處理體外培養(yǎng)c-kit+CSC后其SDF-1、CXCR4均高表達，細胞遷移試驗發(fā)現SDF-1能促進低氧處理CSC的遷移，并且心肌注射該細胞，發(fā)現低氧處理組CSC在心肌梗死區(qū)募集增多［2］。而在心臟缺血再灌注大鼠的冠脈內注射c-kit+CSC，發(fā)現梗死后高表達的趨化因子SDF-1可通過CXCR4受體誘導其跨過冠脈遷移并歸巢至損傷區(qū)域［13］。

Welt等［7］在犬心肌梗死6周后心肌內注射c-kit+CSC，30周后發(fā)現其仍能顯著抑制左室重構、改善心功能。這意味著后期給予c-kit+CSC對于慢性心肌缺血也具有遠期療效。Bearzi等［10］體外培養(yǎng)擴增的人c-kit+CSC，以攜帶增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)的慢病毒轉染CSC后注射入免疫缺陷小鼠或免疫抑制大鼠心臟，發(fā)現其可形成EGFP+新生心肌、冠狀血管及毛細血管的嵌合體心臟。

雖然目前大多研究都支持了成體c-kit+CSC的心肌再生作用，但也有部分研究得出了相反的結論。Zaruba等［14］將成年小鼠 c-kit+CSC與胎兒小鼠心肌共培養(yǎng)未見心肌分化，移植入正常和梗死后成年小鼠心臟均未見心肌再生。Jesty等［15］發(fā)現梗死后成年小鼠c-kit+細胞只能生成血管原細胞，而并不能分化為心肌細胞，從而引發(fā)了其對c-kit+細胞具有干性的質疑。這些矛盾的結果還有待進一步研究解決。

1.2 Sca-1+細胞 近年來Sca-1作為干細胞標志與其它干細胞抗原如c-kit、CD34、CD45等一起用于分離某些成體CSC群［16］。而且Sca1+CSC的再生潛能也得到了廣泛驗證。移植Sca1+CSC可通過旁分泌 VCAM-1［17］、VEGF［18］和向心肌細胞分化機制改善小鼠心肌梗死后心功能。而敲除小鼠sca-1基因可造成心臟原發(fā)性收縮和修復功能缺陷，從而影響c-kit+CSC增殖存活能力［19］。這或許提示sca-1是c-kit+CSC活化、增殖和分化的必需因子。

1.3 側群(side population，SP)細胞 Hierlihy等［20］首次報道了出生后小鼠心肌中存在側群細胞，并證明了其干細胞樣活性和心肌分化潛能。SP細胞表達ABCG2轉運蛋白，可將Hoechst33342染料排除胞外。Pfister等［16］利用此特點和 Sca1、CD31等表面抗原等來分離鑒定心臟側群細胞。Liang等［21］發(fā)現心肌梗死后 SDF-1和 CXCR4均上調，誘導心臟SP細胞的Sca1+CD31-亞群遷移至損傷心肌，分化為心肌樣細胞和內皮細胞。而通過r-Wnt3a抑制側群細胞增殖，則可抑制心肌再生，加重心功能損害［22］。這進一步支持了SP細胞在心肌再生中的積極作用。

總之，SP細胞雖已明確的顯示了心血管分化潛能，但并未有研究提示其具有干細胞的克隆性和自我更新潛能，因此其特性尚待進一步研究。

1.4 心球和心球衍生細胞(cardiosphere-derived cell，CDC) 從分離心臟組織后培養(yǎng)可形成成簇聚集的細胞團，稱為“心球”，心球由多種CSC混合組成，其中 c-kit+細胞居于心球核心，其外環(huán)繞CD105+支持細胞及豐富的膠原IV。心球經過傳代擴增后可獲得細胞單層，稱為CDC［3］。心球和CDC均具有突出的克隆性和多向分化潛能［23］，其在體內的作用也得到了廣泛研究。Johnston等［6］采用冠脈內注射豬CDC，發(fā)現其可促進心肌細胞再生、減少梗死面積、改善血流動力學。Cheng等［24］將超順磁性微球標記的CDC注射入大鼠心肌，超導磁鐵吸引促進CDC歸巢至缺血區(qū)，可改善心功能。Li等［25］從人心內膜分離出心球細胞，體外培養(yǎng)時發(fā)現心球細胞能夠自發(fā)聚集形成干細胞小生境樣微環(huán)境，有利于其生長和增殖。心球高表達2種調控干細胞自我更新、分化的轉錄因子Nanog和Sox2，注射入心肌梗死后SCID小鼠心臟發(fā)現心球具有比CDC更高的移植存活率和心功能改善作用?？傊?，心球和CDC可能成為最有應用潛力的一個CSC亞群，且CDC最近已被應用于一項I期臨床試驗。

1.5 心耳干細胞 Koninckx等［26］從人體心耳組織中分離出一種ALDH+的CSC群。通過表型及體外分化研究，發(fā)現其是一種非骨髓或外周來源的固有心臟干細胞群，具克隆性以及較CDC更高的心肌分化潛能，移植到小型豬梗死模型后可見大量的心肌分化。

2 其他CSC亞群

除了以上幾種干細胞外，在心臟中還發(fā)現其他CSC亞群的存在。Laugwitz等［27］在乳鼠心臟中分離出一種 Isl1+未分化細胞，其不表達 sca1、c-kit、CD31，與心肌共培養(yǎng)能分化為成熟心肌。但是在人體中，Isl1+細胞僅存在于胎兒心臟，妊娠中期即顯著減少，出生后則消失［28］，從而限制了其臨床應用潛能。

成年哺乳動物心外膜也存在一種干細胞，稱為心外膜衍生細胞(epicardium-derived cell，EPDC)［29-30］。Smart等［29］使用Tβ4預處理EPDC使胚胎心外膜基因wt1再表達，促進EPDC轉分化為功能性心肌。但是，EPDC的分化潛能目前仍存爭議，Zhou等［30］研究認為小鼠心肌梗死后EPDC并不分化為心肌或內皮細胞，其修復損傷心肌可能是通過旁分泌機制。

3 CSC的來源和作用機制

固有CSC的存在毋庸置疑，但仍有許多問題尚未解答，如來源、體內活化機制、在內穩(wěn)態(tài)和組織修復中的作用等。其中最具爭議的是CSC的來源，一種觀點認為其形成于胎兒發(fā)育時期，出生后仍持續(xù)存在于心臟的干細胞小生境中;另一種觀點認為心臟外源原始細胞歸巢至心臟成為CSC，分化為心系細胞。前者得到許多研究結果的支持。例如，成體Isl+細胞在動物組織器官的分布與胚胎期Isl+細胞分布一致［27，31］，這意味著他們在胎兒心臟發(fā)育時期即存在。而支持后者的研究則顯示CSC可能源于骨髓源循環(huán)祖細胞，他們在內源性刺激下，募集并歸巢至心臟發(fā)揮生物學作用。異基因心臟或者骨髓移植后移植心臟可出現含宿主細胞的嵌合體，從而提出其心臟外來源的觀點［32-33］。Barile等［34］使用EGFP轉基因小鼠骨髓間充質干細胞(bone marrow stromal cell，BMSC)移植到野生型小鼠，心肌梗死后分離培養(yǎng)CSC，均表達EGFP，說明了這些CSC的骨髓來源。

CSC生物學功能的另一個問題是他們在體內發(fā)揮心臟再生潛能的機制。許多文獻報道了CSC的心血管分化潛能和旁分泌作用，能夠激活抗凋亡、促血管生成信號通路、促細胞存活和改善心功能［1，2，8-10，35］。此外，心臟外源干細胞與 CSC 發(fā)揮協同作用也可能是其生物學作用的一個機制。如BMSC的條件培養(yǎng)基能夠減少CSC凋亡，促進其遷移和分化［36］。豬心肌缺血后再灌注聯合注射人c-kit+CSC和MSC能夠提高其治療效能，減少梗死面積，改善心功能［37］。

4 CSC與心肌再生

目前研究CSC主要有2種方法:①從心臟組織分離培養(yǎng)CSC，再回輸體內;②通過藥物使CSC原位活化，發(fā)揮心肌再生作用。前者存在許多缺點，如其要求行侵入性手術、細胞擴增時間長、體外操作影響細胞表型、給予CSC的理想途徑尚不明確、成功植入率較低等。后者因其直接跨過細胞移植、移植后存活、歸巢、免疫排斥等問題，而可能更具臨床實用性，且已有多個研究結果驗證了這種方法的有效性。Zhang等［38］在小型豬心肌梗死后心肌內注射bFGF，發(fā)現SDF-1及其受體CXCR4均上調，并促進c-kit+CSC增殖分化，修復梗死心肌，增加血供。Ellison等［39］研究顯示IGF-1/HGF在體外能夠激活c-kit+CD45-CSC并促進其心肌分化，將其注射至豬缺血再灌注心臟，可原位激活c-kit+CD45-CSC，促進CSC增殖分化以及心肌再生，減少梗死面積。Yaniz-Galende等［40］使用干細胞因子(stem cell factor，SCF)腺病毒注射入大鼠心肌促使其高表達SCF，發(fā)現SCF能夠促進c-kit+CSC原位募集增殖，修復梗死心臟。以上結果表明使用藥物原位激活CSC可達到CSC移植的效果，并且無細胞移植的副作用，使這一方法更具可行性。

5 CSC的臨床應用

c-kit+CSC和CDC是當前唯一應用于心臟病細胞治療臨床研究的CSC。一項關于c-kit+CSC安全性、有效性的隨機I期臨床研究(SCIPIO試驗)正在進行［41］。該試驗選取心肌梗死伴左室功能不全患者作為試驗對象，CABG術中取心臟組織，體外分離培養(yǎng)c-kit+CSC，其中16名患者術后4個月冠狀動脈內回輸CSC，對照組不予處理。試驗期間未發(fā)生細胞移植不良反應，細胞注射4個月后，超聲檢查發(fā)現細胞治療組左室射血分數(left ventricular ejection fraction，LVEF)明顯改善，對照組無變化。隨訪1年后發(fā)現細胞治療組中8名患者LVEF增加明顯，7名患者4個月和12個月后行MRI檢查梗死面積減少(對照組未行MRI)。

另一項關于CDC的前瞻性的隨機I期臨床研究(CADUCEUS試驗)于近期結束［4］。雙中心隨機選取心梗后左室功能不全患者，通過心內膜活檢收集組織，分離培養(yǎng)CDC，其中17名給予CDCs冠脈內注射，8名行常規(guī)治療作為對照組。注射24 h內未見并發(fā)癥發(fā)生。6個月后比較2組各項指標，行MRI檢查顯示瘢痕減少，存活心肌、局部收縮力、室壁厚度顯著增加，但是心臟超聲提示舒張和收縮末期容積以及LVEF并無差異。這些早期臨床數據證明了CDC的心肌再生潛能及其短期有效性和安全性。

需要注意的是CADUCEUS試驗在雙中心隨機選取病例，試驗證明了心肌再生，而SCIPIO試驗是單中心、非隨機的選取患者，也并未證明心肌再生，并且其只對細胞治療組患者隨訪行MRI檢查，而并未檢查對照組，這可能造成假陽性結果。因此SCIPIO試驗應視為一個試探性的研究。

6 結 語

冠心病作為世界范圍內發(fā)病率和死亡率均居前列的疾病，傳統(tǒng)治療手段只能控制臨床癥狀，防止心功能惡化，而不能促進受損心肌再生。隨著CSC的發(fā)現及深入研究，利用CSC修復損傷心肌成為治療缺血性心臟病的研究熱點。通過使用有效因子激活或直接移植CSC，這些細胞能夠在體內再生心肌和重建血管。由于CSC能特異性分化為心系細胞、心臟“原住性”、無需歸巢等特點，其在心臟病細胞治療方面具有強大的優(yōu)勢。雖然CSC已被廣泛研究，但仍有許多問題尚待解決，如來源、作用機制、遠期療效等。對這些問題的深入探索能夠使我們更有效利用CSC潛能，獲得最大治療效果。

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