楊漾，嚴(yán)方，陳金龍，葉慧，鄭楓，李博，狄斌

（中國藥科大學(xué)藥物分析教研室，江蘇 南京 210009）

藥物分析在藥物的研究與開發(fā)、制備與生產(chǎn)以及質(zhì)量監(jiān)控等方面起著不可或缺的重要作用。近些年來，我國在藥物分析技術(shù)應(yīng)用研究領(lǐng)域取得了一定進(jìn)展。本文通過對2012年我國學(xué)者在國內(nèi)外發(fā)表的相關(guān)研究論文進(jìn)行檢索和整理，分類綜述各類藥物或生物樣本的過程分析技術(shù)、高通量篩選分析技術(shù)、固態(tài)性質(zhì)表征分析技術(shù)、雜質(zhì)譜檢測分析技術(shù)、體內(nèi)樣本分析技術(shù)、中藥分析技術(shù)、生化藥物分析技術(shù)等的應(yīng)用研究新進(jìn)展。

1 過程分析技術(shù)

傳統(tǒng)的藥物分析采用離線方式對制藥過程中的原料、中間產(chǎn)物以及最終產(chǎn)物進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)滯后于生產(chǎn)過程，并不能真實(shí)監(jiān)測和反映藥物在線生產(chǎn)中的質(zhì)量。而過程分析技術(shù)（process analytical technique, PAT）則通過即時(shí)檢測分析，可實(shí)現(xiàn)對藥物生產(chǎn)過程的在線質(zhì)量跟蹤，因而符合“質(zhì)量源于設(shè)計(jì)”（quality by design,QBD）的藥物質(zhì)量觀的理念。目前，在中藥提取工藝研究中，所用PAT主要為在線近紅外（NIR）光譜分析技術(shù)。例如，Wu等[1]通過在線采集NIR光譜，并以芍藥苷、苯甲酸和赤芍標(biāo)準(zhǔn)提取物的測定值作為對照，采用偏最小二乘法建立模型對赤芍的提取過程進(jìn)行了在線檢測分析。李文龍等[2]則通過在線采集黃芪提取過程中提取液的NIR光譜，同時(shí)采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）方法測得提取液中黃芪皂苷Ⅱ、異黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ和黃芪甲苷等4種成分的質(zhì)量濃度，利用偏最小二乘法建立了這4種成分及黃芪總皂苷的定量分析模型。結(jié)果顯示，所建立的模型能夠及時(shí)準(zhǔn)確地反映提取液中黃芪總皂苷的質(zhì)量濃度信息，實(shí)現(xiàn)了以黃芪總皂苷為檢測指標(biāo)、對黃芪提取過程的在線監(jiān)測，為黃芪提取過程的終點(diǎn)判斷和工藝優(yōu)化提供了有效手段。而Xu等[3]在利用在線NIR光譜研究清開靈注射液中間體金銀花的醇沉工藝時(shí)，采用簡單區(qū)間算法（simple interval calculation, SIC）建立了綠原酸的定量分析模型，并實(shí)現(xiàn)了工藝過程的在線分析。該模型較采用偏最小二乘法得到的模型更為可靠，能滿足金銀花醇沉過程的在線質(zhì)量檢測要求。

2 高通量篩選分析技術(shù)

所謂高通量篩選（high throughput screening）即以分子水平和細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)方法為基礎(chǔ)，通過微型化和自動(dòng)化的分析檢測技術(shù)，實(shí)現(xiàn)大量實(shí)驗(yàn)并行運(yùn)作，在短時(shí)間內(nèi)對大量候選化合物進(jìn)行篩選。目前，高通量篩選主要通過微孔板/微陣列和微流控芯片等2種分析技術(shù)實(shí)現(xiàn)。

2.1 微孔板/微陣列技術(shù)

近年來，微孔板/微陣列技術(shù)的應(yīng)用研究重點(diǎn)是發(fā)展密度更高和體積更小的檢測分析平臺，且大多用于酶或受體的抑制劑/激動(dòng)劑的高通量篩選。張玥等[4]通過在昆蟲細(xì)胞中重組表達(dá)并分離得到組蛋白去乙?；?（HDAC6）蛋白，建立了HDAC6小分子抑制劑的高通量篩選模型，并通過進(jìn)一步在384孔板上測定模型的Z'因子，對模型進(jìn)行了評價(jià)。結(jié)果證實(shí)，該模型能滿足高通量篩選的要求，可用于新型 HDAC6 特異性小分子抑制劑的發(fā)現(xiàn)。

張志明等[5]以結(jié)核分枝桿菌的苯丙氨酰-tRNA合成酶（PheRS）為靶點(diǎn)，建立了結(jié)核分枝桿菌PheRS抑制劑高通量篩選模型，并用該模型在微孔板上對11 600個(gè)化合物和5 200個(gè)發(fā)酵液樣品進(jìn)行篩選，得到了46個(gè)陽性樣品。因此，該模型的應(yīng)用結(jié)合對化合物細(xì)胞毒性和抗菌活性的進(jìn)一步篩選，可為尋找新的有效的抗結(jié)核藥物奠定基礎(chǔ)。

張麗蓉等[6]以肽脫甲酰基酶（PDF）為靶點(diǎn)，建立了結(jié)核分枝桿菌PDF抑制劑篩選模型，并用該模型在96孔板上對12 400個(gè)微生物發(fā)酵粗提物進(jìn)行了初篩，得到33個(gè)陽性樣品，又以抗恥垢分枝桿菌實(shí)驗(yàn)進(jìn)行復(fù)篩，得到8個(gè)陽性樣品。

劉媛等[7]將人二型大麻受體（CB2）表達(dá)載體與雙報(bào)告基因載體共轉(zhuǎn)染至中國倉鼠卵巢（CHO）細(xì)胞中，再通過檢測不同化合物對轉(zhuǎn)染后CHO細(xì)胞熒光素酶表達(dá)水平的影響來篩選人CB2激動(dòng)劑。結(jié)果，通過在96孔板上對Z'因子進(jìn)行評價(jià)，證實(shí)此篩選模型具有良好的穩(wěn)定性，可用于CB2激動(dòng)劑的篩選。

此外，微孔板/微陣列技術(shù)也被用于抗病毒藥物的高通量篩選。Dai等[8]用轉(zhuǎn)染pPolI-vluc質(zhì)粒的人肺癌A549細(xì)胞構(gòu)建甲型流感病毒（IAV）vRNA啟動(dòng)子抑制劑的高通量篩選平臺，并以該平臺對83種中藥材提取物進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)了35種活性提取物，其中7個(gè)此前未見報(bào)道；而且，在此基礎(chǔ)上，還發(fā)現(xiàn)這些活性提取物中共有的原矢車菊素對IAV的復(fù)制具有良好的抑制作用。

2.2 微流控芯片技術(shù)

微流控芯片技術(shù)是通過對樣品全分析過程的微縮化和集成化而實(shí)現(xiàn)靈敏、快速檢測及高通量輸出，故非常適用于高通量篩選。Liu等[9]設(shè)計(jì)了包含藥物/基質(zhì)（medium）濃度梯度發(fā)生器（CGG）、氣動(dòng)微型閥、細(xì)胞培養(yǎng)微腔的多層微流控芯片，并將人肺腺癌A549/DDP細(xì)胞株導(dǎo)入芯片的微腔，采用熒光探針DAPI標(biāo)記，通過考察化合物對A549/DDP細(xì)胞凋亡的影響而進(jìn)行活性篩選。結(jié)果，通過對順鉑溶液的測定，證實(shí)該微流控芯片可用于細(xì)胞水平的高通量篩選。

3 固態(tài)性質(zhì)表征分析技術(shù)

由于潛在固相反應(yīng)以及不同固態(tài)性質(zhì)對藥物活性會產(chǎn)生重要影響，因此對固態(tài)原料藥、輔料及其混合物物理性能的分析研究是必要的，尤其是晶型研究應(yīng)該成為藥物研發(fā)的重要組成部分。

3.1 分子水平表征

近年來，多種新型固態(tài)分子測試技術(shù)和方法的出現(xiàn)，為藥物在固態(tài)分子水平上的特征研究提供了有力支持。其中，漫反射紫外/可見（DR-UV/VIS）、傅立葉變換紅外（FT-IR）和漫反射紅外( DR-IR) 等光譜技術(shù)已用于研究藥物固相特征和評估藥物中存在的多晶型和水合物，而拉曼光譜( Raman spectrum) 是非常適用于藥物固體表征的另一種分析技術(shù)。林琳等[10]建立了測定氟康唑2種晶型（A、B 晶型）的拉曼光譜法，即采用780 nm 色散型拉曼光譜法測得氟康唑2種晶型的拉曼光譜圖，鑒定了不同廠家氟康唑固體口服制劑的晶型類別，并采用拉曼成像技術(shù)對制劑含量分布進(jìn)行了初步研究。NIR光譜可在無需破壞分析物條件下檢測和確定其中所含獨(dú)特氫原子官能團(tuán)，目前已用于藥物水分測定、片劑測試和混合物驗(yàn)證。劉永等[11]利用NIR光譜手段分別采用單一指標(biāo)成分和矢量歸一化法測定了三七通舒膠囊粉末混合過程的混合均勻度，為中藥現(xiàn)代化發(fā)展以及粉末混合過程的實(shí)時(shí)在線質(zhì)量控制提供一種新方法。固態(tài)核磁共振( solid state NMR，ss-NMR) 光譜法是通過化合物中單個(gè)原子的化學(xué)環(huán)境而獲得化合物分子水平的特征，分析結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，已較為廣泛地應(yīng)用于推斷藥物晶型的變化特性，并用于研究因溶劑化物和水合物造成的原子核所處分子環(huán)境的變化。Li等[12]利用ss-NMR光譜技術(shù)研究了新型二氫吡啶類鈣離子拮抗劑阿折地平（azelnidipine）的固態(tài)特征，發(fā)現(xiàn)它存在2種晶型和溶致液晶形式（solvatomorphism），溶劑分子與阿折地平分子之間存在的弱氫鍵作用引起阿折地平分子中羰基碳的δ向低場移動(dòng)，表明ss-NMR光譜技術(shù)可用作研究藥物多晶以及溶劑化作用的有力手段。

3.2 微觀粒子水平表征

在藥物開發(fā)的早期階段，藥物樣品的粒徑大小與分布、表面形態(tài)、內(nèi)部屬性等信息非常重要。尤其在納米藥物出現(xiàn)后，對藥物固態(tài)微觀粒子水平上的考察，對于全面評價(jià)藥效至關(guān)重要，而光學(xué)和電子顯微技術(shù)的不斷發(fā)展，為藥物微觀粒子水平上的研究提供了技術(shù)保障。目前顯微分析方法已被多國藥典收載，而X 射線衍射（XRD）分析方法主要應(yīng)用于藥物晶體結(jié)構(gòu)的測定、多晶性和溶劑化物結(jié)構(gòu)的評價(jià)、結(jié)晶度的評價(jià)和相變研究，興起的XRD透射幾何方法和小角度XRD技術(shù)可以解決藥物晶型擇優(yōu)取向的問題，實(shí)現(xiàn)對微米或納米級藥物晶體的測定。熱分析技術(shù)則常用于研究藥物的純度、多晶型、溶劑化以及藥物的降解和輔料相容性，新出現(xiàn)的溫度調(diào)幅式示差掃描量熱法（DSC）、超高效DSC等彌補(bǔ)了傳統(tǒng)熱分析技術(shù)的不足。

3.3 批量樣品表征

候選藥物進(jìn)入后期制劑開發(fā)階段后，固體制劑及其輔料成分的物理性質(zhì)表征即批量樣品表征就顯得至關(guān)重要，需要建立賦形劑材料物理特征的綜合評估方案，特別是涉及使用和功能的屬性。批量樣品表征分析的主要指標(biāo)包括粒徑分布、微?；蚍勰┑臋C(jī)械性能等。佟鈴霞等[13]在葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇脂質(zhì)體的制備過程中，利用激光粒度測定儀對該偶聯(lián)納米紫杉醇脂質(zhì)體的粒徑及多分散指數(shù)進(jìn)行測定，并測定了其藥物包封率，結(jié)果顯示，該偶聯(lián)納米紫杉醇脂質(zhì)體的這些參數(shù)與原料藥紫杉醇納米脂質(zhì)體相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異；且實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與原料藥紫杉醇納米脂質(zhì)體相比，該偶聯(lián)納米紫杉醇脂質(zhì)體仍可有效逃避非網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的捕獲，藥效明顯增強(qiáng)。

4 雜質(zhì)譜檢測分析技術(shù)

4.1 一般雜質(zhì)檢測

藥物、輔料或制劑在制備和生產(chǎn)過程中都有可能帶入殘留溶劑，目前對殘留溶劑的檢測分析基本上仍是采用氣相色譜（GC）法，如顏敏等[14]即采用頂空氣相色譜法測定了燈盞花滴丸中殘留溶劑。

2008年歐洲藥品管理局（European Medicines Agency，EMA）頒布了關(guān)于藥品中金屬催化劑或金屬試劑殘留量限度規(guī)定的指導(dǎo)性文件《Guideline on the Specification Limits for Residues of Metal Catalysts or Metal Reagents》，文件根據(jù)毒性的大小將藥品中重金屬限度分為3類，其中血管途徑用藥品中一類重金屬雜質(zhì)的限度不得高于10-6。因此，需用專屬性更強(qiáng)、靈敏度更高的檢測方法對藥品中不同類別的重金屬進(jìn)行測定，如采用微波消解-石墨爐原子吸收法測定軟膠囊殼中的重金屬鉻[15]、采用原子熒光光譜法測定傣藥蓬萊葛中的痕量砷和汞[16]以及采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定維生素B2注射液中的鎘、砷和鉛[17]。

鑒于中藥材常用硫磺熏蒸方式加工處理，《中國藥典》推薦采用酸蒸餾-碘滴定法測定硫磺熏蒸后中藥材中二氧化硫殘留量，且有研究者對該二氧化硫殘留量測定方法進(jìn)行了改進(jìn)[18]，也有人采用離子色譜法測定浙貝母中二氧化硫殘留量[19]。

4.2 特殊雜質(zhì)檢測

4.2.1 有關(guān)物質(zhì)的檢測 藥物中的有關(guān)物質(zhì)包括起始原料、中間體、副產(chǎn)物和降解產(chǎn)物等雜質(zhì)，而對其中未知結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)進(jìn)行鑒定是控制藥物質(zhì)量的基礎(chǔ)與前提。

由于藥物中有關(guān)物質(zhì)的含量大多少于0.1%，因此要從中直接分離雜質(zhì)單體較為困難，故一般采用LC-MS法對未知雜質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步推斷。如，采用液相色譜-電噴霧離子阱質(zhì)譜法對硫酸衣替米星中的26個(gè)雜質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析[20]；采用液相色譜-電噴霧飛行時(shí)間質(zhì)譜法對瑞替加濱中4個(gè)工藝雜質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，并通過與合成得到的對照品進(jìn)行比對而加以確認(rèn)[21]；采用反相離子對色譜-基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法對藥用反義寡核苷酸中的雜質(zhì)進(jìn)行鑒定[22]。也有研究者直接從藥物中分離得到未知雜質(zhì)單體，再通過NMR等多種光譜方法確證其化學(xué)結(jié)構(gòu)，如丹參酮ⅡA磺酸鈉中有關(guān)物質(zhì)的分離與結(jié)構(gòu)確證[23]和一種新型血管緊張素AT1受體拮抗劑中4個(gè)雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)確證[24]等都是采用了這種方法。

4.2.2 手性雜質(zhì)的檢測 手性藥物中對映異構(gòu)體雜質(zhì)的檢查主要采用手性HPLC法或手性毛細(xì)管電泳（CE）法。手性HPLC法中，手性固定相法仍是主流方法，如采用商品化的直鏈淀粉衍生物固定相Chiralpak AD-RH對手性二氫黃酮組分進(jìn)行手性拆分[25]以及采用自制的新型纖維素手性固定相拆分氯西加酮對映體[26]；手性流動(dòng)相法的應(yīng)用也占有一定比例，如采用含磺丁基醚-β-環(huán)糊精的手性流動(dòng)相添加劑法拆分3種含氮手性藥物[27]。手性CE法中，目前仍較多采用β-環(huán)糊精及其新型衍生物作為添加劑，并廣泛用于拆分手性藥物，如采用高效毛細(xì)管電泳（HPCE）法分離測定青霉胺中對映體雜質(zhì)[28]和采用自制的N-(2-羥丙基)三甲胺鹽-β-環(huán)糊精作為添加劑的非水毛細(xì)管電泳(NACE)法拆分3種酸性手性藥物[29]。

4.2.3 基因毒性雜質(zhì)的檢測 2006年EMA首先頒布了關(guān)于藥物中基因毒性雜質(zhì)殘留量限度規(guī)定的指導(dǎo)性文件，規(guī)定基因毒性雜質(zhì)每人每天攝入量不得大于1.5 μg。因此，對于藥物中基因毒性雜質(zhì)的檢查大多借助于高靈敏度的分析方法，如采用LC-MS法測定馬來酸依那普利及中間體N-[1-( S )-乙氧甲酰基-3-苯丙基]-L-丙氨酸中對甲苯磺酸乙酯的含量[30]和采用LC-MS法測定口腔復(fù)合樹脂中基因毒性單體及降解產(chǎn)物[31]。在一些藥物合成過程中，都可能產(chǎn)生具有基因毒性的磺酸酯類雜質(zhì)，所以對這類雜質(zhì)的檢測方法具有普遍借鑒意義，并且有研究者綜述了藥物中痕量磺酸酯類物質(zhì)的檢測技術(shù)研究進(jìn)展[32]。

5 體內(nèi)樣本分析技術(shù)

如今，隨著新藥研發(fā)在全球的迅速發(fā)展，體內(nèi)藥物分析方法也得到了迅速發(fā)展。我國也出臺了關(guān)于體內(nèi)藥物分析方法學(xué)考察的指導(dǎo)原則，《中國藥典》也對生物樣品定量分析的相關(guān)指導(dǎo)原則進(jìn)行了修訂與擴(kuò)充，但這些指導(dǎo)原則還有很多不足之處，例如對外源性基質(zhì)產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)和評價(jià)方法并未加以說明[33]，仍需進(jìn)一步完善。

5.1 生物樣本前處理

去除生物樣本中的基質(zhì)干擾一直是體內(nèi)藥物分析的關(guān)鍵，建立快速、高效、實(shí)時(shí)的樣本前處理方法也一直是體內(nèi)藥物分析研究的核心與熱點(diǎn)。

5.1.1 微透析技術(shù) 微透析（microdialysis, MD）技術(shù)集采樣和前處理于一體，具有活體取樣、實(shí)時(shí)、在線檢測等突出特點(diǎn)。例如，基于膜分離原理的MD與HPLC-電噴霧離子化（ESI）-MS聯(lián)用，對大鼠關(guān)節(jié)腔透析液中雙氯芬酸鈉進(jìn)行檢測分析，可滿足非甾體抗炎藥在靶部位的采集和測定的需求[34]；將MD與LC-MS聯(lián)用，測定大鼠大腦、血液和膽汁中的斯皮諾素及其與環(huán)孢素A的相互作用，可提高檢測方法的靈敏度和準(zhǔn)確度[35]；而將MD與現(xiàn)代分析儀器在線聯(lián)用，在一定程度上可實(shí)現(xiàn)內(nèi)源性物質(zhì)和體內(nèi)藥物的實(shí)時(shí)監(jiān)測[36]。

5.1.2 新型固相萃取技術(shù) 渦流色譜（turbulent flow chromatography,TFC）技術(shù)是利用大粒徑填料使流動(dòng)相在高流速下產(chǎn)生渦流狀態(tài)，從而實(shí)現(xiàn)對生物樣品的凈化與富集。TFC有多種應(yīng)用模式，可與分析柱聯(lián)用，直接對生物樣本進(jìn)行分析；也有研究者采取MD-TFC-LCMS聯(lián)用方式，實(shí)現(xiàn)在10 min內(nèi)對體內(nèi)蒲貝酮堿進(jìn)行在線測定，大大提高了分析效率[37]。

分子印跡固相萃取(MI-SPE)技術(shù)則能憑借其所具有的特異親和力和選擇性，在選擇性提取富集目標(biāo)物的同時(shí)消除基質(zhì)干擾組分。王培龍等[38]利用MI-SPE結(jié)合GC-MS測定豬尿中4種β-受體激動(dòng)劑——氯丙那林、馬布特羅、克倫特羅和萊克多巴胺，大大簡化了樣品前處理過程，并具有較高的檢測準(zhǔn)確度。Zhang等[39]采取MI-SPE與CE-UV聯(lián)用的方法，實(shí)現(xiàn)對血樣和尿樣中兒茶酚胺類物質(zhì)的痕量分析。

5.2 體內(nèi)藥物分析

鑒于體內(nèi)樣本分析的復(fù)雜性，目前色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)仍是體內(nèi)藥物分析方法學(xué)研究的熱點(diǎn)。

5.2.1 動(dòng)物體內(nèi)藥物分析 Zheng等[40]以梔子苷為內(nèi)標(biāo)，采用LC-ESI-MS/MS法測定大鼠血漿中梔子酸濃度，建立了梔子酸體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究方法。Li等[41]利用HPLCUV法定量測定了大鼠尿液和糞便中的抗炎藥物異丁香酚及其代謝物，結(jié)果顯示，該方法的檢測準(zhǔn)確度和精密度良好；且通過對靜脈注射和口服2種給藥方式的排泄物檢測結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)靜脈給藥后排泄物中待測物的提取率更高，并依據(jù)檢測結(jié)果對異丁香酚的給藥方式進(jìn)行了探討。

5.2.2 人體內(nèi)藥物分析 Li等[42]以LC–電噴霧四極桿線性離子阱質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)定量測定人尿液和血漿中的帕洛諾司瓊，并進(jìn)行帕洛諾司瓊藥動(dòng)學(xué)研究。Liu等[43]利用HPLC-二極管陣列檢測器（DAD）技術(shù)測定人尿液中9種嘌呤物質(zhì)，并結(jié)合模式識別技術(shù)中費(fèi)歇爾線性判別分析（FDA）及正交信號校正-偏最小二乘法顯著性分析（OSC-PLS-DA）模式，評價(jià)正常人體健康狀況，還可對痛風(fēng)病人的病情進(jìn)行診斷。Su等[44]利用CE-熒光檢測器（FL）法測定人血液和尿樣中阿侖膦酸鈉，其間采用磁性固相萃取法對樣本進(jìn)行前處理，有效縮短了樣本前處理過程，可在1.5 h內(nèi)完成包括樣本前處理在內(nèi)的全部測定過程。

5.3 體內(nèi)代謝物分析

Feng等[45]采用超高效液相色譜（UPLC）-MS法對長期給予低劑量樂果的大鼠血漿和尿樣進(jìn)行檢測，結(jié)果，在血漿中發(fā)現(xiàn)了13種代謝產(chǎn)物，尿樣中發(fā)現(xiàn)12種代謝產(chǎn)物。這一檢測結(jié)果可用作對臨床化學(xué)中檢測全身毒性的初步判斷依據(jù)。Gu等[46]采用GC-MS和LC-MS方法在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血漿中共檢測出45種特有的代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物可作為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病情診斷的依據(jù)之一。

5.4 體內(nèi)生物標(biāo)志物分析

由于生物樣本的復(fù)雜性及其在生物體內(nèi)復(fù)雜的代謝過程，給體內(nèi)代謝產(chǎn)物和生物標(biāo)志物的檢測分析帶來很大難度，而LC-MS作為一種強(qiáng)有力的分離分析手段，在體內(nèi)生物標(biāo)志物的檢測中更顯優(yōu)勢，并得到廣泛應(yīng)用[47]。目前臨床上尚無對早期肺癌進(jìn)行專屬檢查的方法，但Guo等[48]使用傅里葉離子回旋共振質(zhì)譜法對肺癌病人的生物標(biāo)志物進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)多種脂肪酸衍生物的分布與肺癌的形成有關(guān)，為肺癌的早期診斷提供了依據(jù)。Liu等[49]利用表面增強(qiáng)激光解吸電離-飛行時(shí)間-質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)法對血清中的胃癌生物標(biāo)志物進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)了潛在的3種胃癌生物標(biāo)志物——纖維蛋白原α鏈、載脂蛋白A-Ⅱ和載脂蛋白C-Ⅰ。

5.5 體內(nèi)原位測定分析

體內(nèi)原位測定分析使分析與過程緊密結(jié)合起來，為豐富過程中的信息量提供了更大潛力，而NIR、FT-IR和拉曼光譜等則為原位PAT的常用檢測手段。Yang等[50]建立了對小鼠頸部和頭部表皮生長因子的原位測定方法，即在對動(dòng)物無傷害的情況下，利用近紅外熒光量子點(diǎn)技術(shù)，對動(dòng)物鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)行原位檢測，這種探針技術(shù)對腫瘤的早期診斷及個(gè)性化治療都具有重要意義。Li等[51]利用近紅外熒光探針對體內(nèi)惡性腫瘤細(xì)胞進(jìn)行甄別，可實(shí)現(xiàn)惡性腫瘤的早期診斷。

6 中藥分析技術(shù)

6.1 中藥組分分離分析

中藥中有效組分分析是中藥藥效學(xué)的基礎(chǔ)，而中藥組分的復(fù)雜性也是制約中藥現(xiàn)代化的巨大障礙。目前HPLC、GC、EC及HPLC-MS、GC-MS等分析技術(shù)仍是對中藥單一組分及多組分進(jìn)行定量定性分析的常用方法。Xu等[52]采用HPLC-三重四極桿質(zhì)譜（TQMS）聯(lián)用技術(shù)，并以選擇性離子監(jiān)測（SIR）模式，同時(shí)定量測定地黃中8個(gè)主要成分（4個(gè)環(huán)烯醚萜苷類、3個(gè)苯乙醇苷類和1個(gè)糠醛衍生物）。Zhao等[53]采用HPLC-飛行時(shí)間四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（QTOF-MS）技術(shù)鑒定出梔子厚樸湯合劑中47個(gè)有效組分，并對其中15個(gè)進(jìn)行了與對照品的保留時(shí)間比對和質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析。Wang等[54]采用快速液相色譜（RRLC)-TQ-MS聯(lián)用技術(shù)鑒定了黃山藥中甾體皂苷類組分，并對其中6個(gè)組分進(jìn)行了定量分析，分析時(shí)間為9 min，最低定量限為1.20 ～ 75.20 μg·L-1。

近年來，分析技術(shù)的不斷發(fā)展為實(shí)現(xiàn)對中藥組分進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、大信息量的分離分析提供了可能。其中，UPLC技術(shù)的廣泛應(yīng)用大大提高了分析效率且能獲得更好的分離效果，如Cui等[55]采用UPLC-ESIMS技術(shù)對烏頭類藥材及炮制品中烏頭類生物堿進(jìn)行了鑒別和含量測定，Lu等[56]采用微波萃取和UPLC技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對虎杖藥材中5種主要活性組分含量的快速測定。高速逆流色譜（HSCCC)技術(shù)則適用于天然生物活性成分的分離，如Yin等[57]采用HSCCC法對黃芩水提物中多糖進(jìn)行了分離提純，產(chǎn)率為2.57%，所分離的多糖組分平均分子質(zhì)量為1.095×106，包含半乳糖醛酸（76.5%）、半乳糖（7.7%）、阿拉伯糖（4.2%）和葡萄糖（5.5%）；且甲基化分析顯示，單糖組分中，1,4-葡萄糖占58.4%，T-阿拉伯糖占11.8%,T-葡萄糖占11.8%，1,4,6-半乳糖占9.1%，1,3,6-半乳糖占5.1%，表明HSCCC技術(shù)的應(yīng)用可最大限度地減少多糖在分離純化過程中發(fā)生化學(xué)變化。全二維氣相色譜（GC×GC）技術(shù)目前也是復(fù)雜物分析應(yīng)用的熱點(diǎn)，具有峰容量大、分析速度快、分辨率高、族分離和瓦片效應(yīng)等特點(diǎn)，在對復(fù)雜體系的檢測分析方面具有較大優(yōu)勢。如Cao等[58]采用GC×GC-TOF/MS技術(shù)分析了菊花曬干和硫熏藥材中揮發(fā)性組分的變化，分別檢出209個(gè)和111個(gè)揮發(fā)性組分，提示，與曬干方式相比，藥材經(jīng)硫熏后其揮發(fā)性成分損失更多。

柱切換技術(shù)也是中藥組分分離分析方法的研究方向之一。Qian等[59]構(gòu)建了3種不同類型色譜系統(tǒng)的分析體系——分子排阻色譜、親水色譜和反相色譜，并連接不同的檢測器，如DAD、蒸發(fā)光散射檢測器和MS檢測器，用于靈芝中大分子（多糖）、極性（核苷和糖）和非極性（三萜類）小分子組分的定性研究。結(jié)果，在不同種類靈芝中共鑒別出1個(gè)大分子組分、23個(gè)小分子組分、4個(gè)糖類組分、5個(gè)核苷類組分和14個(gè)三萜類組分。

6.2 中藥指紋圖譜

中藥指紋圖譜是通過聯(lián)用技術(shù)對中藥組分進(jìn)行檢測分析而提供更準(zhǔn)確的組分含量數(shù)據(jù)和豐富的鑒別信息。Shi等[60]采用UPLC-光電二極管陣列檢測器（PDA）技術(shù)建立了板藍(lán)根（Radix Isatidis）水提物的指紋圖譜，鑒定出10個(gè)共有峰，并對其中8個(gè)特征峰進(jìn)行了定量研究。Jiao等[61]采用GC-MS技術(shù)分析了10批異型南五味子（Kadsura heteroclita）中揮發(fā)油的指紋圖譜，確認(rèn)了23個(gè)主要色譜峰，并通過聚類分析將其分為3類。

6.3 中藥品質(zhì)控制和鑒別

建立適宜的中藥品質(zhì)控制和鑒別方法，是實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化的重要環(huán)節(jié)。除了常見的HPLC、GC、HPCE及相應(yīng)的聯(lián)用技術(shù)之外，光譜法、整體柱和實(shí)時(shí)直接分析質(zhì)譜（DART MS）等新技術(shù)的發(fā)展，也為中藥品質(zhì)控制和鑒別提供了高效快速的分析手段。Chunnian等[62]采用整體柱對白芍（Radix Paeoniae Alba）、赤芍（Radix Paeoniae Rubra）和牡丹皮（Cortex Moutan）進(jìn)行了組分的鑒別和比較，整個(gè)分析過程在10 min內(nèi)完成，并在這3種藥材的色譜圖中分別發(fā)現(xiàn)了15、45和21個(gè)色譜峰，并對其中的11個(gè)色譜峰進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明，所建立的分析方法能有效區(qū)分這3種藥材。DART MS技術(shù)由Cody等人于2005年首次提出，可實(shí)現(xiàn)對藥材的實(shí)時(shí)無接觸、無損耗分析檢測。Zhu等[63]采用DART MS技術(shù)鑒定了制川烏（Radix Aconiti Preparata）品質(zhì)控制的標(biāo)志物，共鑒定出9個(gè)單酯二萜和雙酯二萜烏頭堿類標(biāo)志物，這些標(biāo)志物可有效用于鑒別合格樣品。Yang等[64]采用NIR光譜法對中藥柱層析過程中的組分變化進(jìn)行實(shí)時(shí)在線監(jiān)測，這個(gè)方法是基于光譜的相似度和相異度2個(gè)對立互補(bǔ)的角度而提出的自適應(yīng)移動(dòng)窗口標(biāo)準(zhǔn)差法和過程光譜相似度法，并采用HPLC法進(jìn)行驗(yàn)證，表明該方法在中藥品質(zhì)控制和鑒別中具有廣泛的應(yīng)用前景。

6.4 中藥組分體內(nèi)過程及藥動(dòng)學(xué)評價(jià)

對中藥組分的體內(nèi)過程和藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行評價(jià)時(shí)，大多采用色譜及其聯(lián)用技術(shù)，如HPLC、UPLC-MS、HPLCMS和GC-MS等，建立靈敏、準(zhǔn)確的分析方法。顏娟等[65]以新西蘭白兔為實(shí)驗(yàn)對象，分別通過靜脈、腹腔和肌肉注射等3種不同給藥方式，并采用HPLC技術(shù)對中藥金蓮花中有效成分牡荊苷在體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)及組織分布規(guī)律進(jìn)行了研究。Lv等[66]建立了液-液萃取結(jié)合靈敏的反相HPLC(RP-HPLC)方法，對小鼠經(jīng)口給予何首烏提取物后的血漿中2,3,5,4'-四羥基-2-O-β-D-葡萄糖苷進(jìn)行檢測分析，為從中藥中提取的生物活性物質(zhì)的臨床研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。Sun等[67]將傳統(tǒng)抗抑郁的中藥梔子厚樸湯中提取的4種主要成分分別給大鼠灌胃使用，然后采用HPLC法測定4種成分的血藥濃度，考察了其中京尼平苷成分的藥動(dòng)學(xué)以及各成分的相互作用對京尼平苷藥動(dòng)學(xué)的影響。

7 生化藥物分析技術(shù)

7.1 多肽類藥物分析

近年來，多肽類藥物由于毒副作用較低、生物活性強(qiáng)、無代謝異化、用量少等特點(diǎn)，在醫(yī)藥領(lǐng)域愈發(fā)受到重視。侯江濤等[68]研究了胎盤多肽注射液對重癥肌無力患者免疫指標(biāo)的影響，發(fā)現(xiàn)胎盤多肽能提高患者的T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，從而在一定程度上增強(qiáng)了患者的免疫功能和抵抗力。黃立峰等[69]采用色譜技術(shù)對舟山眼鏡蛇毒蕈堿樣多肽成分進(jìn)行純化，并利用質(zhì)譜儀和Edman降解法發(fā)現(xiàn)其N端16個(gè)氨基酸的部分序列與已知蛇毒磷脂酶A2基本一致，且發(fā)現(xiàn)該多肽成分具有較強(qiáng)的磷脂酶A2活性，故判斷其為一種眼鏡蛇毒磷脂酶A2，具有治療神經(jīng)退行性疾病的潛力。

在現(xiàn)代多肽類藥物合成工藝中，F(xiàn)moc固相合成法占主導(dǎo)地位，然而在合成過程中，易產(chǎn)生缺失肽、斷裂肽、氧化肽等工藝雜質(zhì)以及氧化、水解、降解、二硫鍵錯(cuò)配、消旋、聚合等因素引入的雜質(zhì)。因此，建立可對多肽類藥物中各類雜質(zhì)進(jìn)行可靠、準(zhǔn)確、高效檢測的方法，是多肽類藥物質(zhì)量控制的關(guān)鍵。

7.2 海洋藥物分析

如今，醫(yī)藥研究領(lǐng)域已將尋找天然抗腫瘤藥物的資源從陸地?cái)U(kuò)展到海洋，發(fā)現(xiàn)了許多活性高、毒副作用小且作用機(jī)制新穎的海洋抗腫瘤藥物。王翠翠等[70]在實(shí)驗(yàn)研究中，發(fā)現(xiàn)文蛤多肽Mere15具有抑制人肺癌A549細(xì)胞增殖作用，并探討了其抑制微管蛋白聚合的作用機(jī)制。Cheng等[71]結(jié)合丙酮沉淀、超濾截留、DEAE Sepharose Fast Flow離子交換、Superdex75凝膠層析和C18反相柱層析等多種分離分析手段，采用活性追蹤的方法，從玻璃海鞘（Ciona savignyi）中分離純化出一種能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的多肽CS5931，其有可能成為一類新型抗腫瘤藥物。

7.3 單克隆抗體藥物分析

單克隆抗體（簡稱單抗）藥物分析較多肽類藥物更為復(fù)雜，因此需要系統(tǒng)的、完善的、多方位的分析研究方法。畢華等[72]建立了重組人源化兔抗血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）單抗的質(zhì)控方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，其中分析方法主要包括：采用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）增殖抑制試驗(yàn)，測定單抗的生物學(xué)活性；采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和體積排阻HPLC（SEC-HPLC）方法，測定單抗純度；采用胰酶酶切和HPLC法，測定單抗肽圖；采用定量PCR技術(shù)，實(shí)時(shí)檢測CHO宿主細(xì)胞DNA殘留量；采用ELISA法，分別測定單抗與VEGF的結(jié)合力、殘留蛋白A（ProA）含量和殘留菌體蛋白含量；采用水平等電聚焦電泳法，測定單抗等電點(diǎn)。張梅等[73]制備了抗人呼吸道合胞病毒融合糖蛋白單抗，測定了單抗與抗原的相對親和力，并進(jìn)行了單抗的抗原識別表位分析、中和試驗(yàn)及融合抑制試驗(yàn)，建立了體外鑒定單抗生物學(xué)特性的方法。

7.4 其他生物大分子分析

劉永福等[74]構(gòu)建了Tricine-SDS-PAGE和LC-MS多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）分析方法，用于定量測定多肽和蛋白質(zhì)，并通過比較超濾法、有機(jī)溶劑沉淀法和固相萃取法，確認(rèn)乙腈沉淀法用于血漿內(nèi)源性多肽提取的效果最佳。安鑫等[75]基于在模擬人體生理?xiàng)l件下，1，4-二羥基-9-10-蒽醌-2-醛縮-4-氟苯基氨基硫脲（EDMHT）可與人血清白蛋白（HSA）相互作用而生成復(fù)合物， 導(dǎo)致HSA的內(nèi)源熒光產(chǎn)生特異性變化，且體系的同步熒光強(qiáng)度與溶液中HSA的濃度呈良好的線性關(guān)系， 從而建立了以EDMHT為分子探針、用固定波長同步熒光光譜分析測定蛋白質(zhì)含量的新方法。

8 其他

8.1 生物發(fā)光焦磷酸測序分析技術(shù)

遺傳變異可導(dǎo)致病人出現(xiàn)對藥物反應(yīng)的個(gè)體差異，而利用基因檢測技術(shù)確定病人基因突變位點(diǎn)，則有助于實(shí)現(xiàn)基因?qū)蛐缘膫€(gè)體化用藥。焦磷酸測序是一種基于生物發(fā)光反應(yīng)的實(shí)時(shí)DNA序列測定技術(shù),其反應(yīng)體系中的熒光素酶決定測序反應(yīng)的靈敏度，而傳統(tǒng)焦磷酸測序反應(yīng)使用的是野生型北美熒光素酶Photinus pyralis luciferase,該酶熱穩(wěn)定性較差,因此由該酶配制的焦磷酸測序反應(yīng)體系對熱不穩(wěn)定,影響焦磷酸測序的靈敏度。為了建立熱穩(wěn)定的焦磷酸測序反應(yīng)體系, 有研究者全合成了耐熱突變?nèi)毡疚灮鹣x熒光素酶的編碼序列,并將其插入到表達(dá)載體pET28a(+)中構(gòu)建重組質(zhì)粒,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中,篩選得到的陽性重組菌成功表達(dá)了N端帶有6×His(組氨酸)標(biāo)簽的耐熱突變?nèi)毡疚灮鹣x熒光素酶。熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，與傳統(tǒng)焦磷酸測序反應(yīng)體系相比，由該重組耐熱日本螢火蟲熒光素酶配制的測序反應(yīng)體系對熱穩(wěn)定性有了極大的提高,該測序反應(yīng)液在37 ℃放置1 h后仍能得到正確的測序結(jié)果。這一研究成果為建立穩(wěn)定可靠的現(xiàn)場及時(shí)快速焦磷酸測序反應(yīng)體系奠定了基礎(chǔ)[76]。劉云龍等[77]則建立了一種基于全血直接PCR的焦磷酸測序法，用于檢測亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性，結(jié)果，僅需1μL全血樣本，即可對2個(gè)亞甲基四氫葉酸還原酶基因位點(diǎn)677CT和1298AC進(jìn)行高效擴(kuò)增。

8.2 時(shí)間分辨熒光分析法

時(shí)間分辨熒光分析法（time resolved fluorescence assay，TR-FA）是近年發(fā)展起來的非同位素免疫分析技術(shù)，是目前最靈敏的微量分析技術(shù)，被公認(rèn)為是最有發(fā)展前途的一種非同位素標(biāo)記分析技術(shù)。李麗華等[78]建立了環(huán)丙沙星時(shí)間分辨熒光免疫分析法（CPF-TRFIA），該法具有靈敏度高、特異性好的優(yōu)點(diǎn)，適用于高通量篩查。溫柏平等[79]建立釤(Sm3+)標(biāo)記抗甲胎蛋白(AFP)單抗和銪(Eu3+)標(biāo)記抗糖類抗原19-9(CA19-9)單抗的雙標(biāo)記TRFIA，此法靈敏、簡便、準(zhǔn)確,有助于消化道腫瘤和睪丸癌等的輔助診斷。

9 結(jié)語

藥物分析技術(shù)水平的不斷提高帶動(dòng)了藥物分析學(xué)科的飛速發(fā)展，現(xiàn)代藥物分析方法已經(jīng)歷革命性的變化，正朝著高靈敏、高通量、高專屬和高自動(dòng)化的方向邁進(jìn)。藥物分析學(xué)科的發(fā)展為創(chuàng)新藥物的研究、開發(fā)與制備以及藥物有效性和安全性的動(dòng)態(tài)監(jiān)控提供了更強(qiáng)大的技術(shù)保障，并促進(jìn)藥物科學(xué)研究取得新的進(jìn)步。

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