趙 影，徐海燕，辛國(guó)芹，武香玉，谷 巍

（山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司，山東泰安271000）

產(chǎn)梓醇地黃內(nèi)生菌的分離鑒定及遺傳穩(wěn)定性研究

趙 影，徐海燕，辛國(guó)芹，武香玉，谷 巍

（山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司，山東泰安271000）

通過(guò)組織分離法從野生地黃組織中分離得到24株內(nèi)生菌，采用2，4－二硝基苯肼顯色法對(duì)所分離的菌株進(jìn)行產(chǎn)梓醇性能的測(cè)定，篩選得到一株產(chǎn)梓醇性能較好的菌株BLCC1－0148，研究其10代內(nèi)培養(yǎng)物產(chǎn)梓醇性能的遺傳穩(wěn)定性，結(jié)合菌落形態(tài)特征及菌株特異性序列分析等手段，最終將BLCC1－0148鑒定為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus Cereus）。利用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)高產(chǎn)菌株BLCC1－0148進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化，最佳發(fā)酵培養(yǎng)基如下：葡萄糖0.5%、蛋白胨0.5%、酵母膏0.75%、氯化鈉1%；發(fā)酵溫度37℃，搖床轉(zhuǎn)數(shù)180 rpm，發(fā)酵時(shí)間3 d，梓醇產(chǎn)量達(dá)到839μg·mL－1；

分離鑒定；地黃；內(nèi)生菌；遺傳穩(wěn)定性；系統(tǒng)發(fā)育分析

植物內(nèi)生菌［1，2］（plant entophytes）是指一類在其部分或全部生活史中存活于健康植物組織內(nèi)部，而不使宿主植物表現(xiàn)出明顯感染癥狀或利于宿主生長(zhǎng)的微生物。研究表明，植物尤其是中藥內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生與宿主相同或相似的藥用活性成分及多種全新的代謝產(chǎn)物［3］，其中的很多成分對(duì)人類疾病的防治和預(yù)防有很好的效果［4～6］。

地黃是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材，已證實(shí)梓醇是地黃的主要有效成分［7］，具有降血壓、利尿和緩瀉、抗炎、保肝及調(diào)節(jié)免疫功能的作用［8，9］。但是地黃體內(nèi)梓醇活性成分含量往往都很低，而且供應(yīng)還會(huì)收到季節(jié)性的限制。本研究從野生地黃組織中分離篩選產(chǎn)梓醇性能較好的菌株并研究其產(chǎn)梓醇的遺傳穩(wěn)定性，對(duì)于更好地開(kāi)發(fā)利用地黃內(nèi)生菌提供參考，并為開(kāi)發(fā)新的生物資源提供基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 材料 分離源：野生地黃葉片、塊莖、根等。

1.2 分離培養(yǎng)基 改良的MRS培養(yǎng)基：蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母膏0.5%、葡萄糖2%、磷酸氫二鉀0.2%、乙酸鈉0.5%、檸檬酸銨0.2%、硫酸鎂0.02%、硫酸錳0.05%、吐溫－80 0.1%、pH值6.5（分離乳酸菌）。

LB培養(yǎng)基：酵母膏0.5%、蛋白胨1%、NaCl 1%，pH值為7.0（分離芽孢菌等其他細(xì)菌）

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯20%（煮汁），葡萄糖20 g，瓊脂15 g，pH自然（分離真菌）。

1.3 發(fā)酵培養(yǎng)基 乳酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基為MRS液體培養(yǎng)基；芽孢等細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)基為L(zhǎng)B液體養(yǎng)基；真菌發(fā)酵培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB）；指示菌發(fā)酵培養(yǎng)基：同芽孢菌培養(yǎng)基。

2 試驗(yàn)方法

2.1 樣品采集與處理 采集泰安地區(qū)野生地黃葉片、塊莖、根等，置于無(wú)菌塑料袋中，盡快進(jìn)行表面消毒處理。

2.2 內(nèi)生菌的分離和純化 采用組織塊法對(duì)所采集的植物組織進(jìn)行內(nèi)生菌的分離。取采集的新鮮樣品，用蒸餾水將植物表面洗凈，稍干后取其根、莖、葉切成適宜大小的小段，在75%乙醇中浸泡lmin，無(wú)菌水漂洗3次后用2.5%NaClO，莖、葉消毒2 min，皮消毒3 min，最后再用無(wú)菌水沖洗3～4次，無(wú)菌濾紙吸干。去邊緣，切成約0.5 cm×0.5 cm的小塊貼放于分離培養(yǎng)基上，每皿4～6塊，置37℃和28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～7 d，待培養(yǎng)基上植物組織周圍長(zhǎng)出菌落后，挑取轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)基平板上劃線法純化，純化的單菌落保存至斜面4℃保存，或者甘油管及凍干粉保存。

挑取分離純化，油鏡觀察菌體形態(tài)和純度，據(jù)伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)初步對(duì)分離的菌株進(jìn)行鑒定。

2.3 產(chǎn)梓醇地黃內(nèi)生菌的分離篩選 將菌種接種在斜面培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)復(fù)壯，24 h后傳代到裝有50 mL液體種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)（180 rpm）24 h，然后接種到裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37℃恒溫振蕩（180 rpm）培養(yǎng)72 h，5 000 rpm離心分離菌體和上清液，上清液即為代謝產(chǎn)物，用于進(jìn)一步分析。

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 用移液槍準(zhǔn)確吸取2 501 μg·mL－1的梓醇標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液0.00、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00 mL，分別置于10 mL量瓶中，加20%乙醇至2 mL，分別加入2.5 mL 2，4－二硝基苯肼顯色劑，搖勻。加20%乙醇至刻度，反應(yīng)30 min后，照紫外－可見(jiàn)分光光度法，在波長(zhǎng)470 nm處測(cè)定其吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，以梓醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.2 測(cè)定 準(zhǔn)確吸取2.00 mL樣品分別置于10 mL量瓶中，分別加入2.5mL 2，4－二硝基苯肼顯色劑，搖勻。加20%乙醇至刻度，反應(yīng)30 min后，在波長(zhǎng)470 nm處測(cè)定各樣品吸光度值，以20%乙醇為空白對(duì)照。

2.4 產(chǎn)梓醇性能較好地黃內(nèi)生菌菌株遺傳穩(wěn)定性測(cè)定 將篩選出的產(chǎn)梓醇性能較好的菌株在LB斜面上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，并連續(xù)進(jìn)行至十代，觀察菌株各培養(yǎng)階段的生長(zhǎng)性能及形態(tài)差異，并將各代菌株活化培養(yǎng)同時(shí)測(cè)定產(chǎn)梓醇的性能。

2.5 產(chǎn)梓醇性能優(yōu)越地黃內(nèi)生菌發(fā)酵條件的優(yōu)化以LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在4因素3水平上做一下正交化試驗(yàn)。

2.6 菌株的鑒定

2.6.1 生理生化鑒定 根據(jù)分離菌的菌落和菌體形態(tài)，革蘭染色以及生理生化反應(yīng)，按《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行初步歸屬。

2.6.2 16S rDNA的擴(kuò)增與序列分析 目的菌株接種于新鮮的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 h，采用天根公司的試劑盒提取菌體DNA，并對(duì)其進(jìn)行16S rDNA序列擴(kuò)增。所用引物為通用引物：1492r：5′－ggttaccttgttacgactt－3′，27f：5′－agagttgatcctggctcag－3′，PCR反應(yīng)體系（50μL）為：Mixture 25μL（含Taq DNA聚合酶及dNTP等，天根生化科技有限公司），上下游引物各1μL，模板DNA 2μL，超純水21μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸2 min，25個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物送北京博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

2.6.3 系統(tǒng)發(fā)育分析 登錄GenBank（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov）對(duì)菌株16S rDNA測(cè)序結(jié)果利用Blast進(jìn)行檢索，并下載相關(guān)屬種的16S rDNA序列，采用DNAMAN、DNAclub、MEGA 3.1等軟件進(jìn)行同源性分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

3 結(jié)果

3.1 地黃內(nèi)生菌的分離 從泰安周邊野生的地黃組織中成功分離得到24株內(nèi)生菌，如表1所示。

表1 地黃內(nèi)生菌分離結(jié)果

續(xù)表1：

3.2 產(chǎn)梓醇地黃內(nèi)生菌的篩選

3.2.1 梓醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 見(jiàn)圖1。

圖1 梓醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

由標(biāo)準(zhǔn)曲線可得濃度計(jì)算公式為：Y＝0.533 7X－0.022 5，其中X：OD470，Y：樣品濃度（mg·mL－1）。

3.2.2 各菌株發(fā)酵液結(jié)果測(cè)定 采用分光光度法對(duì)所分離的菌株進(jìn)行產(chǎn)梓醇能力的測(cè)定，結(jié)果如表2所示。

表2 各地黃內(nèi)生菌產(chǎn)梓醇能力測(cè)定結(jié)果

由表2可知分離篩選得到的BLCC1－0148菌株經(jīng)過(guò)液體發(fā)酵后梓醇的產(chǎn)量最高，達(dá)到了247.367μg·mL－1。故選取BLCC1－0148菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

3.3 BLCC1－0148菌株遺傳穩(wěn)定性測(cè)定 將篩選出BLCC1－0148菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性測(cè)定，結(jié)果如表3所示。

表3 BLCC1－0148菌株遺傳穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果

由表3可以看出菌株BLCC1－0148的10代內(nèi)培養(yǎng)物在37℃、180 rpm條件下發(fā)酵72 h產(chǎn)梓醇性能比較穩(wěn)定，發(fā)酵液中梓醇含量分別維持在270μg·mL－1水平上左右，說(shuō)明所分離篩選的地黃內(nèi)生菌BLCC1－0148在10代以內(nèi)產(chǎn)梓醇的性能比較穩(wěn)定，其遺傳穩(wěn)定性較好。

3.4 BLCC1－0148菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化 以LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在4因素3水平上做正交試驗(yàn)，結(jié)果如表4所示。

表4 BLCC1－0148菌株培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果

由表4結(jié)果篩選出了BLCC1－0148菌株發(fā)酵產(chǎn)梓醇培養(yǎng)基最佳配方：葡萄糖0.5%、蛋白胨0.5%、酵母膏0.75%、氯化鈉1%，梓醇產(chǎn)量達(dá)到839μg·mL－1。

3.5 菌株BLCC1－0148的鑒定 挑取菌株BLCC1－0148純培養(yǎng)物接種于LB培養(yǎng)基平皿，37℃培養(yǎng)20 h，形成灰白色菌落，不透明，表面較粗糙，似毛玻璃狀或融蠟狀（如圖2）。光學(xué)顯微鏡下觀察，革蘭陽(yáng)性，桿狀（如圖3）。

菌株BLCC1－0148的16S rDNA PCR條帶在1 000～2 000 bp之間，約為1.5kb的單一擴(kuò)增產(chǎn)物（如圖4）。將該序列與GenBank的核酸數(shù)據(jù)作同源性比對(duì)。結(jié)果表明，與已知蠟樣芽孢桿菌EF473128等16S rDNA序列的同源率為100%，菌株BLCC1－0148鑒定為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus Cereus）（如圖5）。

圖2 BLCC1－0148的菌落培養(yǎng)性狀

圖3 BLCC1－0148的菌體形態(tài)（油鏡觀察）

圖4 菌株BLCC1－0148 16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增電泳圖M.Marker；1.BLCC1－0148

圖5 菌株BLCC1－0148的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化

4 討論

從中藥材的根莖葉中可以分離到內(nèi)生菌，且可以通過(guò)改良的培養(yǎng)基篩選出產(chǎn)與宿主相同或相似的藥用活性成分的菌株，然后將菌株接種在適宜的培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，之后將活性成分從培養(yǎng)基中分離純化出來(lái)，這樣就可以緩解中藥材的供應(yīng)緊張問(wèn)題［10］。利用中藥材內(nèi)生菌進(jìn)行工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)重要的藥物具有極大的應(yīng)用價(jià)值和開(kāi)發(fā)潛力。分離出與寄主共生的內(nèi)生菌，并利用內(nèi)生菌來(lái)發(fā)酵產(chǎn)生與寄主相似藥效成分的構(gòu)思，這樣既可以節(jié)約藥材，降低生產(chǎn)成本還可以彌補(bǔ)季節(jié)性的缺陷，實(shí)現(xiàn)循環(huán)可持續(xù)地生產(chǎn)。因此，對(duì)植物尤其是中藥內(nèi)生菌資源的開(kāi)發(fā)和利用可以緩解中藥材的供應(yīng)緊張問(wèn)題，有很好的應(yīng)用前景和實(shí)際意義。

綜上所述，從泰安野生地黃組織中分離得到24株內(nèi)生菌，并對(duì)其產(chǎn)梓醇性能進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果篩選出1株產(chǎn)梓醇性能優(yōu)越的菌株BLCC1－0148，經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育分析所分離的菌BLCC1－0148鑒定為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus Cereus）。通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)得到了BLCC1－0148菌株發(fā)酵產(chǎn)梓醇培養(yǎng)基最佳配方：葡萄糖0.5%、蛋白胨0.5%、酵母膏0.75%、氯化鈉1%，梓醇產(chǎn)量達(dá)到839μg·mL－1；研究發(fā)現(xiàn)所篩選的地黃內(nèi)生菌BLCC1－0148在10代內(nèi)產(chǎn)梓醇的遺傳穩(wěn)定性較好，由此可以說(shuō)明內(nèi)生菌的分離篩選為中藥活性成分的供給提供一種新思路，而且通過(guò)內(nèi)生菌的發(fā)酵代謝產(chǎn)生地黃藥效成分及其他活性物質(zhì)，既可以用在相關(guān)藥物領(lǐng)域中的有效成分的添加也可以部分替代地黃的種植，減少季節(jié)性供應(yīng)的限制，提高產(chǎn)量，大大降低生產(chǎn)成本。有希望解決藥材供需嚴(yán)重失衡的問(wèn)題，有可能從根本上解決藥用植物的供應(yīng)問(wèn)題。

［1］王金濤.淺談植物內(nèi)生菌［J］.光明中醫(yī)，2008，23（7）：1020－1021.

［2］Sati SC，Pargaein N，Belwal M.Diversity of Aquatic Hyphomycetes as Root Endophytes on Pteridophytic Plants in Kumaun Himalaya［J］.J Amer Sci，2009，5（4）：179－182.

［3］陳雪英，都曉偉，李濱.內(nèi)生菌與藥用植物活性成分相關(guān)性研究進(jìn)展［J］.國(guó)外醫(yī)藥（植物藥分冊(cè)），2008，23（2）：47－51.

［4］Strobel GA.Rainforest endophytes and bioactive products［J］.Crit Rev Biotechnol，2002，22（4）：315－333.

［5］Wagenaar MM，Clardy J.Dicerandrols，new antibiotic and cytotoxic dimmers produced by the fungus Phomopsis longicolla isolated from an endangered mint［J］.J Nat Prod，2001，64（8）：1006－1009.

［6］Prakamhang J，Minamisawa K，Teamtaisong K，et al.The communities of endophytic diazot rophic bacteria in cultivated rice（Oryza sativa L.）［J］.Applied Soil Ecology，2009，42（2）：141－149. ［7］倪慕云，邊寶林.地黃化學(xué)成分的研究概況［J］.中國(guó)中藥雜志，1989，14（7）：41－43.

［8］郭融，劉沖，王賀，等.地黃活性成分梓醇的研究概述［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工（學(xué)刊），2009，11：89－91.

［9］劉彥飛，趙宇，溫學(xué)森，等.梓醇的藥效學(xué)及化學(xué)轉(zhuǎn)化研究現(xiàn)狀［J］.中國(guó)中藥雜志，2007，32（12）：1128－1130.

［10］張庭靜，蔣瑾，徐淑霞，等.一株產(chǎn)梓醇的地黃內(nèi)生細(xì)菌的鑒定［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，2：395－399.

Isolation and identification of endophytic bacteria produced catalpol from rehmannia and studies on genetic stability

ZHAO Ying，XU Hai-yan，XIN Guo-qin，WU Xiang-yu，GUWei
（Shandong Baolai－leelai Bioengineering Co.，Ltd.，Taian 271000，China）

24 strains of entophyte were isolated from Rehmannia by tissue isolation.The2，4－dinitrobenzene hydrazine chromogenicmethod were used to determing the performance of catalpa alcohol from separated strains.The strain BLCC1－0148 with better performance production of catalpol and good genetic stability were screened and had been identified as Bacillus Cereus by based on physiological，biochemical characteristics and 16S rDNA sequence phylogeny analysis.The cultural conditions of BLCC1－0148 strain was optimized by the orthogonal design experiment.The optimum medium composition of fermentation conditions was as follows：glucose 0.5%，tryptone 0.5%，yeast extract 0.75%，NaCl 1%.The fermentation conditions included cultural temperature 37℃，rotational speed of rocking bed 180 rpm，fermentation time 3d.The production of catalpol reached 839μg·mL－1.

Isolation and identification；Rehmannia；Endophyte；Genetic stability；Phylogenetic analysis

Q93－331

A

2095－5375（2014）10－0567－005

趙影，女，研究方向：動(dòng)物微生態(tài)，E－mail：zy198709050025＠163.com

徐海燕，女，研究方向：動(dòng)物微生態(tài)，Tel：13695385458，E－mail：xucaoyichuan＠163.com