李雪梅，胡宇馳

（北京市藥品檢驗(yàn)所，北京100035）

·實(shí)驗(yàn)研究·

注射用香菇多糖的抗腫瘤效應(yīng)量效關(guān)系考察試驗(yàn)研究

李雪梅，胡宇馳

（北京市藥品檢驗(yàn)所，北京100035）

目的觀察不同濃度的注射用香菇多糖對(duì)皮下植入S180腹水瘤小鼠實(shí)體腫瘤抑制率及藥物濃度與抑瘤率的量效關(guān)系。方法小鼠腹股溝皮下植入3.6×106個(gè)S180腹水瘤細(xì)胞后，每只腹腔注射不同濃度注射用香菇多糖溶液（0.250 0、0.125 0、0.062 5、0.031 3、0.015 6、0.007 8 mg·mL－1）0.1 mL，連續(xù)注射5 d，然后停藥1 d，從給藥開始第7天起再連續(xù)注射5 d，腫瘤移植18 d后對(duì)腫瘤進(jìn)行稱量。結(jié)果注射用香菇多糖各劑量組小鼠腫瘤重量明顯低于模型對(duì)照組，差異有顯著性意義；注射用香菇多糖給藥濃度在0.007 8～0.250 0mg·mL－1范圍內(nèi)，其濃度對(duì)數(shù)－抑瘤率的回歸線性方程相關(guān)系數(shù)分別為：0.956、0.962、0.978。結(jié)論注射用香菇多糖具有明顯抗腫瘤作用，且給藥濃度對(duì)數(shù)－腫瘤抑制率有良好的線性關(guān)系。

注射用香菇多糖；腫瘤抑制率；量效關(guān)系

香菇多糖是從香菇中提取出來的有效部位，屬多糖組合體，其多糖類成分作為非特異性的免疫調(diào)節(jié)劑，通過激活免疫細(xì)胞，以及促進(jìn)細(xì)胞因子生成等方式，對(duì)免疫系統(tǒng)發(fā)揮多方面的調(diào)節(jié)作用，最終達(dá)到抑制和消滅腫瘤細(xì)胞的作用。從上世紀(jì)七、八十年代來一直在腫瘤的治療和預(yù)防方面得到廣泛關(guān)注和應(yīng)用。本文就注射用香菇多糖抗腫瘤作用及給藥濃度與腫瘤抑制率的關(guān)系進(jìn)行研究［1～4］。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法［5～8］

1.1 腫瘤系及其傳代與標(biāo)準(zhǔn)化 Sarcoma 180腹水腫瘤細(xì)胞由日本味之素制藥株式會(huì)社提供。本所進(jìn)行傳代培養(yǎng)。用于試驗(yàn)研究的腫瘤系需進(jìn)行實(shí)體瘤標(biāo)準(zhǔn)化處理，將腹水瘤腫瘤細(xì)胞接種在小鼠腰部皮下，待實(shí)體瘤生長(zhǎng)到8～10 g后，取下實(shí)體瘤，在培養(yǎng)皿內(nèi)用剪刀或手術(shù)刀收集中部濕潤(rùn)的部分，加入生理鹽水后，收集上清液中的細(xì)胞，然后注射至小鼠腹腔進(jìn)行傳代，移植傳代3次（每周一次）后供試驗(yàn)用。

1.2 試驗(yàn)藥物 注射用香菇多糖，批號(hào)：OY01L；OY02L；0Y03L。規(guī)格：1 mg／支，生產(chǎn)單位：日本味之素制藥株式會(huì)社。

1.3 試劑 滅菌注射用水，批號(hào)：1212111，生產(chǎn)單位：天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司。氯化鈉注射液，批號(hào)：130305405，生產(chǎn)單位：石家莊四藥有限公司。

1.4 儀器 Olympus光學(xué)顯微鏡；天平。

1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)，ICR小鼠，體重24～26 g，雌性，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（京）2010－0002。

2 試驗(yàn)方法

2.1 腫瘤接種 將已接種7 d，腫瘤生長(zhǎng)良好的Sarcoma－180腹水型小鼠，脫臼處死后，把腹部皮膚撕開，暴露腹壁用無菌注射器從腹腔內(nèi)吸取乳白色的濃稠腹水以氯化鈉注射液稀釋后，用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞數(shù)為3.6×107個(gè)·mL－1，制成腫瘤細(xì)胞懸液（活細(xì)胞率＞95%）。再將腹水瘤移植到雌性小鼠右側(cè)腰部皮下（腹股溝淋巴結(jié)左上方），每只皮下植入0.1 mL，即3.6×106個(gè)（細(xì)胞計(jì)數(shù)）。

2.2 動(dòng)物分組及給藥 腫瘤植入后小鼠隨機(jī)分為7組：模型對(duì)照組（同體積滅菌注射用水）、注射用香菇多糖各劑量組（0.250 0、0.125 0、0.062 5、0.0313、0.015 6、0.007 8 mg·mL－1），每組10只。從移植癌細(xì)胞第2天開始，每日動(dòng)物腹腔注射不同濃度香菇多糖溶液0.1 mL，連續(xù)注射5 d。然后停藥1 d，從給藥開始第7天起再連續(xù)注射5 d。對(duì)照組腹腔同法注射滅菌注射用水0.1 mL。

2.3 檢測(cè)指標(biāo) 腫瘤移植18 d后殺死全部動(dòng)物，每只小鼠取出腫瘤、脾臟、胸腺，測(cè)定重量。計(jì)算出對(duì)照組動(dòng)物腫瘤的平均重量（Wc）與給藥組的平均腫瘤重量（Wt），并按照下面公式求得各組動(dòng)物腫瘤抑制率。

腫瘤抑制率（%）＝（Wc－Wt）／Wc×100%；

上式中Wc為對(duì)照組腫瘤平均重量，Wt為給藥組各劑量組的腫瘤平均重量。

各給藥組對(duì)給藥濃度對(duì)數(shù)－腫瘤抑制率進(jìn)行回歸分析，計(jì)算濃度對(duì)數(shù)－抑瘤率的回歸線性方程及相關(guān)系數(shù)。

2.4 統(tǒng)計(jì)方法 用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，采用方差分析方法，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表1試驗(yàn)結(jié)果可見，批號(hào)為0Y01L的注射用香菇多糖濃度在0.031 3mg·mL－1以上時(shí)，小鼠腫瘤重量明顯低于模型對(duì)照組小鼠腫瘤重量（P＜0.01）；注射用香菇多糖濃度在0.062 5 mg·mL－1以上時(shí)，其腫瘤抑制率在85.01%以上。注射用香菇多糖在給藥濃度從0.007 8 mg·mL－1到0.25 mg·mL－1時(shí)，其抑瘤率從26.66上升至98.31%；小鼠胸腺重量、脾臟重量與模型對(duì)照組比較差異無顯著性意義。

批號(hào)為0Y02L的注射用香菇多糖濃度在0.125 mg·mL－1以上時(shí)，腫瘤重量明顯低于模型對(duì)照組，差異有顯著性意義（P＜0.05）；注射用香菇多糖濃度在0.062 5 mg·mL－1以上時(shí)，其腫瘤抑制率大于86.68%，且注射用香菇多糖給藥濃度從0.007 8到0.25 mg·mL－1時(shí)，其腫瘤抑制率從4.76%升至94.25%；小鼠胸腺重量、脾臟重量與模型對(duì)照組比較差異無顯著性意義。

批號(hào)為0Y03L注射用香菇多糖濃度在0.015 6 mg·mL－1以上時(shí)，注射用香菇多糖組小鼠腫瘤重量明顯低于模型對(duì)照組，差異有顯著性意義（P＜0.001）；注射用香菇多糖濃度在0.062 5 mg·mL－1以上時(shí)，其腫瘤抑制率大于87.72%。注射用香菇多糖給藥濃度從0.007 8到0.25mg·mL－1時(shí)，其腫瘤抑制率從24.79%升至98.64%。注射用香菇多糖濃度在0.25 mg·mL－1時(shí)，小鼠脾臟重量明顯低于模型對(duì)照組，差異有顯著性意義（P＜0.001）。

由圖1中可見，批號(hào)為0Y01L注射用香菇多糖其濃度對(duì)數(shù)－抑瘤率的回歸線性方程為Y＝44.82 ln（X）＋19.79，相關(guān)系數(shù)為0.956；批號(hào)為0Y02L注射用香菇多糖其濃度對(duì)數(shù)－抑瘤率的回歸線性方程為Y＝56.26ln（X）＋0.584，相關(guān)系數(shù)為0.962；批號(hào)為0Y03L注射用香菇多糖其濃度對(duì)數(shù)－抑瘤率的回歸線性方程為Y＝40.44ln（X）＋31.01，相關(guān)系數(shù)r值為0.978。

4 討論

惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類生命的疾病，其死亡率僅次于心腦血管疾病，且發(fā)生率呈逐年上升的趨勢(shì)。惡性腫瘤患者特別是晚期腫瘤患者可能出現(xiàn)令人無法忍受的疼痛、消瘦、水腫等癥狀并最終導(dǎo)致生命終結(jié)?，F(xiàn)在世界醫(yī)藥界正在致力于癌癥的治療和預(yù)防工作。而香菇多糖作為抗腫瘤輔助治療作用藥物越來越受到人們的重視。香菇多糖是天然的多糖類成分，它主要通過提高機(jī)體非特異性免疫功能如誘導(dǎo)IL－2的產(chǎn)生，增強(qiáng)NK細(xì)胞及巨噬細(xì)胞活性等而起到對(duì)腫瘤細(xì)胞防御與殺傷作用。與其他抗癌藥相比，香菇多糖具有毒副作用小，療效顯著，因此其具有廣闊的應(yīng)用前景。

表1 注射用香菇多糖腫瘤抑制率－濃度考察結(jié)果（n＝10）

圖1 注射用香菇多糖腫瘤抑制率－濃度考察結(jié)果

但香菇多糖為多組分生化藥物，不同生產(chǎn)工藝甚至不同批次香菇以及一些其他誤差，得到的產(chǎn)品具有不同的多糖組分比例以及不同的活性構(gòu)型等，可能導(dǎo)致臨床中使用的香菇多糖制劑生物活性出現(xiàn)很大差異。因此，我們有必要對(duì)香菇多糖抗腫瘤活性的質(zhì)量控制方法進(jìn)行研究，建立可以證明香菇多糖抗腫瘤活性的方法，甚至進(jìn)而建立可以比較不同工藝、不同生產(chǎn)單位和制劑活性的方法，或者證明已建立的化學(xué)檢定與其生物活性控制具有一致性，以更加科學(xué)地綜合評(píng)價(jià)香菇多糖制劑的質(zhì)量，保證其臨床使用的抗腫瘤效果。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，3批次（0Y01L、0Y02L、0Y03L）注射用香菇多糖的一系列濃度（0.250 0、0.125 0、0.062 5、0.031 3、0.015 6、0.007 8 mg·mL－1）對(duì)皮下植入Sarcoma－180腹水腫瘤細(xì)胞小鼠有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，腫瘤重量低于模型對(duì)照組，其腫瘤抑制率為4.76%～98.64%。3批次注射用香菇多糖給藥濃度在0.062 5mg·mL－1和0.031 3mg·mL－1以上時(shí)，其腫瘤抑制率在80%以上，說明注射用香菇多糖具有很強(qiáng)的抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。

另外，此次試驗(yàn)結(jié)果可見3個(gè)批次（0Y01L、0Y02L、0Y03L）注射用香菇多糖隨著給藥濃度的升高，其腫瘤重量隨之降低，腫瘤抑制率隨之升高。3個(gè)批次注射用香菇多糖給藥濃度在0.007 8～0.250 0 mg·mL－1范圍內(nèi)，其濃度對(duì)數(shù)與抑瘤率的回歸線性方程相關(guān)系數(shù)分別為：0.956、0.962、0.978?；貧w方程的相關(guān)系均大于0.95，由此可見，注射用香菇多糖的抗腫瘤活性與其劑量存在良好的量效關(guān)系。

脾臟為免疫器官，批號(hào)為0Y03L注射用香菇多糖在藥物濃度為0.25 mg·mL－1時(shí)，其脾臟重量顯著低于模型對(duì)照組。批號(hào)為0Y01L、0Y02L注射用香菇多糖，雖然脾臟重量與模型對(duì)照組比較差異無顯著性意義。但由數(shù)據(jù)我們可以看出，注射用香菇多糖各給藥組動(dòng)物脾臟重量均低于模型對(duì)照組。由此我們推斷，注射用香菇多糖增強(qiáng)腫瘤小鼠免疫功能的作用［7］。

由此可見，注射用香菇多糖對(duì)Sarcoma－180腹水腫瘤細(xì)胞小鼠有明顯抑制腫瘤的作用，其腫瘤抑制率最高可以達(dá)到95%以上，且給藥濃度的對(duì)數(shù)－腫瘤抑制率成良好的線性關(guān)系，這樣就為我們對(duì)注射用香菇多糖抗腫瘤活性質(zhì)量控制提供依據(jù)，為下一步建立注射用香菇多糖抗腫瘤活性生物效價(jià)檢定法奠定基礎(chǔ)。

［1］金虹.香菇多糖抗腫瘤作用機(jī)理及臨床應(yīng)用［J］.青海大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2009，27（3）：70－72.

［2］林卡莉，呂軍華，徐鷹，等.香菇多糖調(diào)節(jié)荷瘤小鼠的免疫功能［J］.解剖學(xué)雜志，2009，32（2）：166－169.

［3］吳菲，林國(guó)楨，張晉昕.我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病現(xiàn)狀及趨勢(shì)［J］.中國(guó)腫瘤，2012，21（2）：81－85.

［4］張昕，張強(qiáng)，梁彥龍.香菇多糖的抗腫瘤和降糖作用機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)藥事，2008，22（2）：149－154.

［5］郭玉東，王志斌，周建平，等.中藥生物活性測(cè)定法中標(biāo)準(zhǔn)品建立的研究［J］.藥物分析雜志，2013，33（4）：706－708，715.

［6］鄧旭坤，蔡寶昌，殷武，等.馬錢子堿對(duì)小鼠腫瘤的抑制作用［J］.中國(guó)天然藥物，2005，3（6）：392－395.

［7］凌昌全.“癌毒”是惡性腫瘤之根本［J］.中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2008，6（2）：111－114.

［8］石來寶，陳靜，殷霞.香菇多糖提取方法的研究［J］.藥學(xué)研究，2014，33（4）：200－202.

The study on dose－effect relationship about anti－tumor activity of Lentinan for Injection

LIXue-mei，HU Yu-chi
（Beijing Institute for Drug Control，Beijing 100035，China）

ObjectiveTo observe the effect about different concentration of Lentinan for Injection on mouse tumor inhibitory which was implant sarcoma 180 cells by subcutaneous administration and dose－effect relationship.M ethodsICR mice were implant3.6×106sarcoma 180 cells by subcutaneous groin，then eachmouse was injected 0.1 mL different concentration solution of Lentinan for Injection（0.250 0，0.125 0，0.062 5，0.031 3，0.015 6，0.007 8 mg·mL－1）by intraperitoneal administration.Themice were injected Lentinan Solution for Injection 5 days continually，then stop 1 day，mice were injected again for 5days continually.Mice were killed who was implanted sarcoma 180 cells after 18 days，tumour was weighted.ResultsThe mice′s tumour weight in Lentinan for Injection groups significantly lower than model control group.When the concentration between 0.007 8 mg·mL－1and 0.250 0 mg·mL－1，the correlation coefficient of linear regression equations between logarithm of concentrations and tumor inhibitory rate were 0.956，0.962，0.978，respectively.ConclusionLentinan for Injection had antitumor action.Therewere linear relationships between logarithm of concentrations and tumor inhibitory rate.

Lentinan for Injection；Tumor inhibitory rate；Dose－effect relationship

R965

A

2095－5375（2014）10－0564－004

李雪梅，女，主管藥師，研究方向：藥物安全評(píng)價(jià)臨床前研究，E－mail：lixuemei＠bidc.org.cn

胡宇馳，男，副主任藥師，研究方向：藥物安全評(píng)價(jià)臨床前研究，Tel：010－83229474，E－mail：yuchihu＠163.com