劉寶華，沙瑩，白光輝，李勇，鄔偉，商萍，王小同

（1．溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 康復(fù)中心，浙江 溫州 325027；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 干部病房，吉林長春 130021；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 影像科，浙江 溫州 325027；4.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，浙江 溫州 325027）

·論 著·

重組人粒細(xì)胞集落刺激因子對腦缺血再灌注大鼠大腦皮質(zhì)蛋白質(zhì)的影響

劉寶華1，沙瑩2，白光輝3，李勇4，鄔偉4，商萍1，王小同1

（1．溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 康復(fù)中心，浙江 溫州 325027；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 干部病房，吉林長春 130021；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 影像科，浙江 溫州 325027；4.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，浙江 溫州 325027）

目的：研究造血干細(xì)胞動員劑重組人粒細(xì)胞集落刺激因子（rhG-CSF）對腦缺血神經(jīng)系統(tǒng)具有保護作用的蛋白質(zhì)組學(xué)機制。方法：本實驗利用腦缺血再灌注大鼠模型（tMCAO模型）在再灌注2 h后頸部皮下注射rhG-CSF，在灌注后14 d提取大腦皮質(zhì)蛋白進(jìn)行雙向電泳。結(jié)果：缺血再灌注損傷（模型組）大鼠與假手術(shù)組大鼠比較，篩選到56個差異表達(dá)蛋白質(zhì)點，其中17個上調(diào)，39個下調(diào)，應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀（MALDI-TOF-MS）得到肽質(zhì)量指紋圖，輸入美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，并在Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫中進(jìn)一步驗證，鑒定出其中19個為已知蛋白質(zhì)。而經(jīng)過人粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）治療（G-CSF治療組）大鼠與模型組大鼠比較，篩選出35個蛋白質(zhì)點，其中16個下調(diào)，19個上調(diào)，其中鑒定為已知蛋白質(zhì)的有6個，分別為二氫嘧啶酶相關(guān)蛋白2、膠質(zhì)纖維酸性蛋白、內(nèi)皮黏蛋白、Rho GDP解離抑制因子、Rab GDP解離抑制因子、鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白。結(jié)論：腦缺血后大鼠腦組織蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生變化，G-CSF在腦缺血亞急性期可能通過調(diào)節(jié)多種神經(jīng)再生相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)，參與保護腦缺血的神經(jīng)元。

粒細(xì)胞集落刺激因子；腦缺血；蛋白質(zhì)組；神經(jīng)再生；大鼠

重組人粒細(xì)胞集落刺激因子（recombinate human granulocyte colony-stimulating factor，rhGCSF）具有促進(jìn)粒細(xì)胞增殖分化，增加外周血中粒細(xì)胞的數(shù)目和功能，動員造血干細(xì)胞進(jìn)入到外周循環(huán)的功能[1]，臨床已應(yīng)用于骨髓移植[2]、粒細(xì)胞減少癥[3]及感染性疾病[4]的治療。研究證實粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）可以保護缺血腦組織[5-6]，應(yīng)用G-CSF治療的局灶性腦缺血大鼠腦梗死面積明顯降低、存活率增加[7]，其可能通過抗凋亡、抗炎、促進(jìn)血管神經(jīng)發(fā)生、動員造血干細(xì)胞入腦等多種途徑發(fā)揮作用[8]，但具體作用機制尚未完全明確。因此，本實驗應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，進(jìn)一步在蛋白質(zhì)水平探索rhG-CSF保護腦缺血神經(jīng)組織的作用機制，為rhG-CSF更好地應(yīng)用于缺血性腦血管疾病的臨床治療，提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組 清潔級健康8～10周齡雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量220～250 g，由吉林大學(xué)實驗動物中心提供，室溫分籠飼養(yǎng)，自由攝食及飲水，隨機分為假手術(shù)大鼠（假手術(shù)組）8只，右側(cè)大腦缺血再灌注損傷大鼠（模型組）8只，腦缺血再灌注后經(jīng)rhG-CSF干預(yù)治療的大鼠（G-CSF治療組）8只，各組間暴露因素?zé)o差異。實驗對動物的處理方法符合中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。

1.2 藥物及主要儀器 rhG-CSF（國藥準(zhǔn)字S2006 3034），由長春金磊藥業(yè)有限責(zé)任公司提供。等電聚焦儀（美國Amersham Biosciences公司），Image Scanner光學(xué)掃描儀（瑞典Pharmacia Biotech公司），Ettan picker斑點切膠儀（美國Amersham Biosciences公司，Pittsburgh，Pennsylvania），Ettan digester酶切儀（美國Amersham Biosciences公司），基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀（MALDI-TOFMS，美國Amersham Biosciences公司）。

1.3 模型制作方法 根據(jù)Hayashi等[9]的方法建立大鼠短暫性大腦中動脈栓塞（transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO）模型（腦缺血再灌注模型）。大鼠用10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）腹腔注射麻醉后，頸部腹側(cè)正中皮膚切口，分離出右側(cè)頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）及頸內(nèi)動脈（ICA），結(jié)扎ECA遠(yuǎn)端后，在近端插入直徑約0.5 mm鈍頭尼龍線，經(jīng)ICA到達(dá)大腦中動脈起始部。阻斷右側(cè)大腦中動脈，90 min后，把尼龍線拔出、ECA結(jié)扎，逐層縫合切口。模型建立后3 d內(nèi)給予慶大霉素20 000 U腹腔注射。大鼠清醒后參照Longa等[10]的方法進(jìn)行神經(jīng)功能評定：0分，無神經(jīng)缺損；1分，不能伸展對側(cè)前肢；2分，向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，行走時向偏癱側(cè)跌倒；4分，意識喪失，不能自發(fā)行走。0分和4分動物剔除出實驗。假手術(shù)組栓線僅進(jìn)入ICA起始處，其余步驟相同。C-CSF治療組在再灌注2 h后給予rhG-CSF 50μg·kg-1·d-1[11]，連續(xù)5 d，頸部皮下注射，假手術(shù)組與模型組予相同方法皮下注射同等劑量的0.9%氯化鈉溶液。各組均在再灌注后14 d時斷頭處死，冰上剝離缺血側(cè)（右側(cè)）大腦皮層。

1.4 蛋白質(zhì)樣本制備與定量 將各組右側(cè)大腦皮質(zhì)與液氮混合，在研缽中磨制成粉末，加入已預(yù)冷的玻璃勻漿器中，按1∶3.5比例加入樣品裂解液{2 mol/L硫脲、7 mol/L尿素、40 mmol/L Tris-base、二硫蘇糖醇、4% 3-[（3-膽酰胺丙基）-乙二胺]-1-丙磺酸CHAPS、10 mmol/L二硫蘇糖醇、1 mmol/L苯甲基磺酰氟、1 mmol/L EDTA}后放在4 ℃冰浴中勻漿，以150 000×g超速離心60 min；吸取上清液，再以40 000×g離心45 min，用Bradford[12]的方法測定蛋白質(zhì)濃度，分裝于-80 ℃保存。

1.5 蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳 第一向為固相pH等電聚焦電泳，選17 cm固相pH梯度干膠條（pH 3～10，NL），采用膠內(nèi)泡脹法，樣品和再水化液{8 mol/L尿素、2%（W/V）3-[（3-膽酰胺丙基）-乙二胺]-1-丙磺酸、20 mmol/L DTT（用前加）、2%固相pH梯度干膠條緩沖液、少量溴酚藍(lán)}共350μL，上樣1.2 mg。聚焦槽放于等電聚焦儀上，設(shè)置聚焦參數(shù)（30 V，12 h；200 V，1 h；500 V，1 h；1 000 V，1 h；5 000 V，1 h；8 000 V，10 h），總Vhrs為80 000[13]。等電聚焦電泳后，固相pH梯度干膠條取出，分別在SDS平衡液[6 mol/L尿素、2% SDS、50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.8）、30%甘油、少量溴酚藍(lán)，a∶10 mL平衡緩沖液加100 mg DTT；b∶10 mL平衡緩沖液加250 mg碘乙酰胺]中平衡1次，約15 min。后轉(zhuǎn)入SDS-PAGE膠上，進(jìn)行第二向電泳，參數(shù)設(shè)置（恒流20 mA，40 min；30 mA，4 h），溴酚藍(lán)前沿至陽極約5 mm時停止電泳[14]。

1.6 凝膠染色 采用硝酸銀染色方法，固定2 h（冰醋酸30 mL、甲醇150 mL、甲醛0.15 mL，并加入超純水使容積達(dá)300 mL），硫代硫酸鈉敏化2 min，超純水漂洗3×5 min，銀染25 min，漂洗3×1 min，Na2CO3顯色0～8 min，甲醇冰醋酸混合液終止10 min。

1.7 圖像分析 每組樣品常規(guī)進(jìn)行3次二維電泳，染色的凝膠利用Image Scanner光學(xué)掃描儀掃描并備份凝膠圖像，用ImageMaster 2D Labscan V3.1軟件（GE，Ann Arbor，Michigan，USA）進(jìn)行圖像分析，采用假手術(shù)組作為參考標(biāo)準(zhǔn)，其他組凝膠與之匹配，以蛋白表達(dá)水平上調(diào)或下調(diào)150%為目標(biāo)點，尋找差異蛋白質(zhì)點并進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

1.8 蛋白質(zhì)鑒定 采用斑點切膠儀切取制備膠上匹配的差異蛋白點。r酶切儀對切取的膠塊進(jìn)行胰蛋白酶酶切，37 ℃下作用2 h，用50%乙腈-0.1%三氟乙酸溶液60μL溶解并提取肽段。Ettan spotter吸取0.3μL多肽樣品與等體積a-氰基-4-羥基肉桂酸混勻后點樣。應(yīng)用MALDI-TOF-MS計算肽質(zhì)量指紋圖譜。將所得到的肽質(zhì)量指紋譜輸入美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（http∶//www. ncbi.nlm.nih.gov/protein）進(jìn)行檢索，鑒定的基本條件是覆蓋率＞20%，期望值＜0.05。所得的肽段質(zhì)量數(shù)在Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫（http∶//us.expasy. org/sprot）中檢索，進(jìn)行驗證。

2 結(jié)果

2.1 蛋白質(zhì)定量 Bradford法測得蛋白線性方程為y=0.0098x+0.2666，相關(guān)系數(shù)R2=0.7857，在595 nm處測定各組樣品的吸光度，求出蛋白質(zhì)濃度：假手術(shù)組15.6μg/μL，模型組14.3μg/μL，G-CSF治療組16.1μg/μL。

2.2 雙向凝膠電泳圖譜 取等量假手術(shù)組、模型組及G-CSF治療組大鼠缺血側(cè)（右側(cè)）大腦皮質(zhì)蛋白質(zhì)分別行雙向電泳分離，經(jīng)過圖像分析，可以分辨出1 000個左右的蛋白質(zhì)點（見圖1）。

圖1 大鼠大腦皮質(zhì)蛋白質(zhì)雙向電泳凝膠圖譜（硝酸銀染色）

G-CSF治療組與模型組比較有35個差異蛋白點，表達(dá)下調(diào)16個，表達(dá)上調(diào)19個；模型組和假手術(shù)組比較有56個差異蛋白質(zhì)點，表達(dá)下調(diào)39個，表達(dá)上調(diào)17個（見圖2）。具有代表性的差異蛋白質(zhì)點局部見圖3。

圖2 不同組差異蛋白的分布

2.3 質(zhì)譜鑒定 將所得到的肽質(zhì)量指紋譜，輸入NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，并在Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫中驗證，模型組與假手術(shù)組比較差異蛋白質(zhì)點19個，表達(dá)上調(diào)12個，表達(dá)下調(diào)7個。表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)為14-3-3蛋白、蘋果酸脫氫酶、抑制素、異檸檬酸脫氫酶、熱休克蛋白5前體、烯醇（化）酶、腦型肌酸激酶同功酶、泛醌-細(xì)胞色素C還原酶、膠質(zhì)纖維酸性蛋白、ATP合酶、琥珀酸脫氫酶復(fù)合體亞單位A、熱休克蛋白72。表達(dá)下調(diào)的蛋白質(zhì)包括：Rho GDP解離抑制因子、肌動蛋白、Rab GDP解離抑制因子、內(nèi)皮黏蛋白前體、內(nèi)皮黏蛋白、鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白、二氫嘧啶酶相關(guān)蛋白2。G-CSF治療組與模型組比較鑒定保護差異蛋白質(zhì)6個，均表達(dá)上調(diào)（見圖4）。差異蛋白質(zhì)為Rho GDP解離抑制因子、二氫嘧啶酶相關(guān)蛋白2、Rab GDP解離抑制因子、內(nèi)皮黏蛋白、膠質(zhì)纖維酸性蛋白、鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白。

圖3 各組間二氫嘧啶酶相關(guān)蛋白2（503號蛋白點）的差異表達(dá)

圖4 肽質(zhì)量指紋譜圖（鑒定成功的6種G-CSF治療組與模型組差異蛋白質(zhì)）

3 討論

G-CSF是骨髓造血細(xì)胞生長因子，存在于神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞上，后者有粒細(xì)胞集落刺激因子受體（GCSFR）表達(dá)，外源性G-CSF可以通過血腦屏障，與神經(jīng)細(xì)胞膜上的G-CSFR結(jié)合，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮重要作用，與許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病有密切關(guān)系[15]。腦缺血時，G-CSF能提高外周血干細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)缺血環(huán)境中干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化，修復(fù)受損缺血低氧神經(jīng)細(xì)胞，并有抗炎癥及抗凋亡作用，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)[16]。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展成熟，蛋白質(zhì)水平的實驗研究在揭示神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制、診療用藥方面體現(xiàn)出巨大潛力。由于G-CSF生物活性在體內(nèi)外有很大區(qū)別，穩(wěn)定性差，因此，本實驗利用基因重組技術(shù)生產(chǎn)的rhG-CSF為實驗用藥，將蛋白質(zhì)組技術(shù)應(yīng)用于G-CSF腦保護機制研究中，為G-CSF應(yīng)用于缺血性腦血管病提供蛋白質(zhì)組學(xué)資料。

本實驗建立正常SD大鼠腦組織蛋白質(zhì)組蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳圖像，通過圖像分析技術(shù)和計算機軟件對蛋白質(zhì)圖像進(jìn)行分析，模型組與假手術(shù)組比較表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)為14-3-3蛋白、蘋果酸脫氫酶、抑制素、異檸檬酸脫氫酶、熱休克蛋白5前體、烯醇（化）酶、腦型肌酸激酶同功酶、泛醌-細(xì)胞色素C還原酶、膠質(zhì)纖維酸性蛋白、ATP合酶、琥珀酸脫氫酶復(fù)合體亞單位A、熱休克蛋白72。模型組大鼠中間代謝酶類蘋果酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶復(fù)合體亞蛋白A、ATP合酶β亞基、烯醇化酶均表達(dá)上調(diào)，提示腦缺血能量代謝發(fā)生障礙，腦組織中ATP合酶活性的改變是神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)膜損害的標(biāo)志，也是神經(jīng)元繼發(fā)損傷的重要環(huán)節(jié)[17]。腦肌酸激酶是在腦內(nèi)催化ATP和肌酸轉(zhuǎn)化為ADP和磷酸肌酸的特殊同工酶，腦缺血再灌注損傷后腦肌酸激酶釋放增加可能是自體保護增加能量釋放的體現(xiàn)。腦缺血再灌注損傷后可出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，泛醌-細(xì)胞色素C還原酶是電化學(xué)潛能的呼吸鏈的組成成分。14-3-3蛋白參與神經(jīng)細(xì)胞生長、分裂、分化、凋亡等生理病理過程[18]，14-3-3蛋白及熱休克蛋白72在腦缺血后表達(dá)上調(diào)，可能是腦缺血再灌損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡及再生的表現(xiàn)，提示缺血后氧化應(yīng)激反應(yīng)增強，腦缺血保護機制啟動。二氫嘧啶酶相關(guān)蛋白可以通過調(diào)節(jié)微管的生成促進(jìn)軸突生長和髓鞘穩(wěn)定[19]，內(nèi)皮黏蛋白在腫瘤的血管發(fā)生中發(fā)揮作用[20]，二者在模型組表達(dá)下調(diào)，G-CSF治療組表達(dá)上調(diào)，提示G-CSF治療后可能新生血管增多，軸突生長，從而起到促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的作用。鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白、Rab GDP解離抑制因子、Rho GDP解離抑制因子在腦缺血發(fā)生后均表達(dá)變少，而在GCSF治療組均有增多，但是由于它們具有多種生物學(xué)效應(yīng)，推測這三種蛋白質(zhì)可能在G-CSF治療后能促進(jìn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

綜上所述，本實驗將蛋白組技術(shù)應(yīng)用于腦缺血再灌注損傷，發(fā)現(xiàn)經(jīng)G-CSF治療后缺血再灌注損傷大鼠大腦皮層相關(guān)蛋白質(zhì)改變，提示G-CSF對缺血性腦血管治療作用與其能調(diào)節(jié)多種神經(jīng)再生相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)有關(guān)，但具體調(diào)節(jié)機制尚需進(jìn)一步研究。

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（本文編輯：丁敏嬌）

Effect of recombined granulocyte colony-stimulating factor on cerebral cortical proteins of ischemia-reperfusion injury rats

LIU Baohua1, SHA Ying2, BAI Guanghui3, LI Yong4, WU Wei4, SHANG Ping1, WANG Xiaotong1.
1.Department of Rehabilitation, the Second Affliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027; 2.Department of Gerontology, the First Hospital of Jilin University, Changchun, 130021; 3.Department of Radiology, the Second Affliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027; 4.Department of Neurology, the Second Affliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective: To research the relation between difference protein with neuron protective effect of G-CSF in ischemia-reperfusion rats brain by using proteomics.Methods: Twenty-four experimental Wistar rats were divide into 3 groups, control group, rats cured by G-CSF group (G-CSF group), ischemia-reperfusion injured rats group (I/R group). Ischemia-reperfusion injury rats model was generated by using Koizumi's way in G group and I/R group, one nylon thread was used to block the rats middle cerebral artery and reperfused after 2 hours. G-CSF (50 μg/kg/d) was injected subcutaneously on rats' backs for successive 5 days in G-CSF group. Rats were executed and decapitated after 14 days after reperfusion to get the brain respectively. Sodium chloride injection was used in I/R group and control group. Cortex proteins were extracted in the 3 groups of rats. Then the maps of the proteins were established by DIGE (differential gel electrophoresis, DIGE). The altered protein spots were identifed with MALDI-TOF-MS and database searching.Results: Compared with the contrl group, the I/R group gained 56 differential protein spots, 39 spots expressed lowly, and 17 spots high. Compared with I/R group, the G-SCF group gained 35 differential protein spots, 16 spots expressed lowly, and 19 spots high, identifed 6 protein spots, including dihydropyrimidinase-associated protein 2, glial fbrillary acidic protein, endomucin, Rho GDP dissociation inhibitor, Rab GDP dissociation inhibitor and guanine-nucleotide-binding protein.Conclusion: G-CSF is involved in neuroprotection after brain ischemia, possibly by regulating the expression of various neural regeneration-associated proteins at the subacute stage.

granulocyte-colony stimulating factor; brain ischemia; proteome; neural regeneration; rats

R743

： A

： 1000-2138（2014）05-0329-06

2014-03-31

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生平臺骨干人才計劃項目（2013RCA036）。

劉寶華（1976-），男，陜西丹鳳人，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士。

王小同，主任醫(yī)師，教授，Email：wangxt22@163.com。