陶翠花, 劉瑩瑩, 趙麗媛, 許 敏,, 祝 茜,

(1. 國家海洋局 第三海洋研究所, 福建 廈門 361005; 2. 山東大學(xué)(威海) 海洋學(xué)院, 山東 威海 264209)

綠海龜α-actin基因的cDNA克隆與序列分析

陶翠花1, 劉瑩瑩2, 趙麗媛1, 許 敏1,2, 祝 茜1,2

(1. 國家海洋局 第三海洋研究所, 福建 廈門 361005; 2. 山東大學(xué)(威海) 海洋學(xué)院, 山東 威海 264209)

為探究綠海龜(Chelonia mydas)α-actin基因序列的相關(guān)信息, 作者利用RT-PCR和RACE方法從綠海龜肌肉組織中獲得了α-actin基因的cDNA全長序列, 共1347bp(GenBank登錄號為JX073650)。所得序列包含一個1134 bp的開放閱讀框, 編碼由377個氨基酸組成的蛋白, 該蛋白7～377位為Actin結(jié)構(gòu)域, 14～17位有一個糖基化位點, 無信號肽; 預(yù)測分子量為42.0 kDa, 理論等電點為5.23。將編碼區(qū)序列與 GenBank上同源序列進行比對發(fā)現(xiàn), 核苷酸序列相似性均在 85.4%以上, 氨基酸序列相似性均在98.9%以上, 說明α-actin基因作為編碼蛋白是高度保守的。

綠海龜(Chelonia mydas); α-actin基因; RACE技術(shù)

綠海龜(Chelonia mydas)隸屬于爬行綱(Reptilia),龜鱉目(Testudinata), 海龜科(Cheloniidae), 海龜屬(Chelonia), 是在中國沿海分布的 5種海龜之一, 也是中國二級重點保護野生動物[1-2]。近百年來, 由于人類對海龜進行了掠奪性地亂捕濫殺、盜挖龜卵, 加上對其生存環(huán)境的破壞和污染, 海龜?shù)臄?shù)量在全世界范圍內(nèi)急劇下降[3-7]。目前, 世界自然保護聯(lián)盟(IUCN)和瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約(CITES)均將其確定為瀕危物種[8-9]。

肌動蛋白(Actin)是一類存在于所有真核細胞中, 在進化過程中高度保守的蛋白質(zhì)超家族, 與細胞內(nèi)許多重要的功能活動有關(guān)。在高等動物細胞內(nèi), Actin大致分為6種, 其中4種具有肌肉組織特異性, 包括α-心肌型、α-骨骼肌型、α-血管平滑肌型和 γ-內(nèi)臟平滑肌型; 其余兩種廣泛分布于各個組織中, 包括 β和 γ亞型, 均為細胞質(zhì)型[10-11]。actin基因作為管家基因, 在生物體內(nèi)生理或病理狀態(tài)下都持續(xù)恒量表達, 因而在很多量化的試驗中, 被當作內(nèi)參(Internal control)基因。鑒于綠海龜分子方面的研究主要集中在種群遺傳結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系[12-23]方面, 蛋白編碼基因研究較少[24],肌動蛋白尤其是 α-actin基因的研究尚未見報道,因此, 作者對綠海龜?shù)?α-actin基因的序列及結(jié)構(gòu)進行了初步探究, 以期為今后進一步研究 actin基因結(jié)構(gòu)、功能和表達分析以及綠海龜?shù)倪z傳學(xué)研究積累基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗材料為采自中國南海的綠海龜?shù)募∪饨M織樣品, 液氮速凍后于-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩？?RNA提取試劑盒(PureLinkTMRNA Mini)購于Invitrogen公司, 反轉(zhuǎn)錄試劑(SuperScript Ⅱ Reverse Transcriptase)、pMD18-T載體購于Takara公司, 膠回收純化試劑盒(E.Z.N.A.?Gel Extraction Kit)購于Omega公司, 其余試劑為上海生工產(chǎn)品。

1.2 總RNA提取

將超低溫保存的樣品放入組織勻漿器, 加入Trizol reagent冰浴勻漿。其余步驟參照Invitrogen公司試劑盒說明書進行組織總 RNA的提取。用 0.8%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA, 用英國Picodrop公司Pico100型超微量紫外分光光度計測定總RNA的濃度及純度。

1.3 cDNA的合成

根據(jù)CLONTECH公司SMART(Switching mec-hanism at 5’ end of RNA transcript)技術(shù)略加改動, 合成 cDNA。第一鏈 cDNA 合成所用引物為: Oligo-anchor R: 5’-GACCACGCGTATCGATGTCGA CT16(A/C/G)-3’和Smart F: 5’-TACGGCTGCGAGAA GACGACAGAAGGG-3’。取總RNA(1-5 μg)4 μL加入Smart F和Oligo anchor R引物各100 μmol/L, 混勻; 70℃水浴5 min, 立即置于冰上冷卻2 min; 瞬時離心, 使各成分集合于管底; 再于冰盒中加入以下試劑: 5×反應(yīng)緩沖液5 μL, RNA酶抑制劑25 U, 10 mmol/L dNTP混合物1.25 μL; 反轉(zhuǎn)錄酶1 μL(200 U/μL); 最后加DEPC水至25 μL, 42℃水浴60 min; 然后70℃溫浴15 min, 冰浴10 min, 然后分裝保存于-20℃。

1.4 綠海龜α-actin基因片段的克隆

根據(jù) GenBank上的相關(guān)序列(登錄號分別為AF416707, NM_203763, NM_001086591, AY986486), 采用Primer premier 5.0軟件輔以人工方法設(shè)計兼并引物, 委托Invitrogen公司進行合成。引物序列為P1: 5’ATRCCAGCAGAYTCCATACC 3’, P2: 5’ CTGTSTT GTCCCTRTACGC 3’。

取2 μL 1.3中的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行PCR擴增, 反應(yīng)體系為: PCR mix kit 12.5 μL, Taq 酶0.2 μL(5 U/μL), cDNA模板1 μL, Primer P1/P2(10 μmol/L)各1 μL,滅菌蒸餾水9.3 μL。反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性10 min; 94℃變性40 s, 52℃退火40 s, 72℃延伸1 min, 30個循環(huán); 最后72℃延伸10 min。PCR反應(yīng)在Bio-Rad C1000型梯度PCR儀上進行。PCR產(chǎn)物使用DNA快速純化回收試劑盒(Omega公司)經(jīng) 1.5%瓊脂糖凝膠進行回收、純化, 純化產(chǎn)物與pMD18-T載體(TaKaRa公司)連接, 轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌, 用含有氨芐青霉素的LB固定培養(yǎng)基進行藍白斑篩選, 挑取陽性克隆進行鑒定后, 送至上海生工生物技術(shù)有限公司測序。

1.5 5’和3’RACE擴增

根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計 RACE 引物: GSP1: 5’AGCGTGGCTACTCCTTTGT3’, GSP2: 5’AATG AAGGATGGCTGGAAG3’, 分別與通用引物 3’anchorR: 5’GACCACGCGTATCGATGTCGAC3’和 5’primer: 5’TACGGCTGCGAGAAGACGACAG AA3’配對。PCR擴增反應(yīng)條件均為: 94℃預(yù)變性10 min; 94℃變性40 s, 55℃退火40 s, 72℃延伸1 min, 30個循環(huán); 最后72℃延伸10 min。5’和3’端獲得的片段按照克隆部分片段的方法進行克隆測序。

1.6 序列分析

使用DNAman、Clustal W、Bioedit軟件并結(jié)合人工校對將部分片段、5’端和3’端進行序列拼接, 獲得全長 cDNA 序列, 并設(shè)計引物(F1: 5’CTGA ACCCTAAAGCTAACCG3’, R1: 5’CTTGCGATGGA CAATGGATG3)進行序列驗證。通過NCBI的ORF程序獲得開放閱讀框(ORF)信息, 利用ExPASy在線軟件獲得其相應(yīng)的氨基酸序列, 并對氨基酸進行性質(zhì)(分子量、等電點)預(yù)測。利用SignalP 3.0(http://www. cbs.dtu.dk/services /SignalP/)進行信號肽的預(yù)測。利用SMART (http://smart. embl heidelberg.de/)進行結(jié)構(gòu)域的預(yù)測。蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測在 SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/)上進行, 利用PyMol軟件進行三維結(jié)構(gòu)的建構(gòu)與標注。

2 結(jié)果

2.1 綠海龜α-actin基因擴增結(jié)果

經(jīng)過序列的拼接、整理后, 獲得 α-actin基因全長 cDNA序列, 共 1347 bp(GenBank登錄號為JX073650)。該序列包含8 bp的5’端非編碼區(qū)序列, 205bp的3’端非編碼區(qū)序列, 以及1134 bp的完整開放閱讀框序列。序列 3’端有一典型加尾信號(AATAAA), 其后24 bp處找到poly(A)尾巴。該基因共編碼377個氨基酸, 其中第14-17位為糖基化位點NGSG(圖1)。

2.2 綠海龜α-actin結(jié)構(gòu)預(yù)測

根據(jù)在線軟件分析, 該基因編碼的蛋白分子量為42.0 kDa, 理論等電點(pI)為5.23。經(jīng)預(yù)測, 該蛋白第7-377位氨基酸為Actin的結(jié)構(gòu)域(圖2), 高保守,無信號肽。

將推定的氨基酸序列進行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測, 獲得的三級結(jié)構(gòu)模型如圖3所示, 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 綠海龜?shù)摩?actin蛋白與人(Homo sapiens)的α-actin 蛋白結(jié)構(gòu)[25-27]很吻合, 主要由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、隨機卷曲和延伸鏈組成。

2.3 核苷酸及氨基酸序列相似性比對

將該片段在 GenBank上進行比較, 結(jié)果顯示:與熱帶爪蟾(Xenopus tropicalis)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)、牛蛙(Rana catesbeiana)、牛(Bos taurus)等的α-actin基因核苷酸序列的同源性在 85.4%以上; 與熱帶爪蟾、牛蛙、牛、人(H. sapiens)、野豬(Sus scrofa)、小白鼠(Mus musculus)等物種氨基酸序列的同源性達100.0%, 與其他物種氨基酸序列的同源性達 98.9%以上(表1)。總體上, 綠海龜α-actin的保守性非常高。

圖1 綠海龜α-actin基因的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列Fig. 1 The nucleotide and deduced amino acid sequences of α-actin gene from C. mydas

表1 綠海龜與其他動物α-actin基因全長cDNA序列的相似性比較Tab.1 Similarity comparisons of full-length cDNA of α-actin gene between C. mydas and other species

圖4 根據(jù)α-actin基因核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig. 4 Phylogenetic tree of α-actin gene based on nucleotide sequences

圖2 α-actin蛋白結(jié)構(gòu)域Fig. 2 Structural domain of C. mydas α-actin

圖3 理論預(yù)測的綠海龜α-actin蛋白及與人α-actin蛋白(3dawA)的結(jié)構(gòu)疊合Fig. 3 Three-dimensional structure of modeled α-actin protein from C.mydas and its structural superposition of α-actin protein with H. sapiens (3dawA)

2.4 系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

利用Clustal W程序?qū)Ρ?中物種的α-actin基因核苷酸序列進行多序列比對, 并將比對結(jié)果用MEGA4.0生成系統(tǒng)進化樹(Neighbor-Joining method),結(jié)果表明(圖4), 綠海龜?shù)摩?actin基因序列先與熱帶爪蟾、非洲爪蟾和牛蛙聚類在一起, 再與牛、野豬、人和小白鼠聚類, 而與魚類親緣關(guān)系較遠, 基本與傳統(tǒng)分類相一致。

3 討論

Actin普遍存在于真核生物中, 在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA的加工和運輸、維持細胞結(jié)構(gòu)和細胞內(nèi)運動等過程中發(fā)揮著重要作用, 是在進化中高度保守的蛋白質(zhì)家族[28]。作者所獲得的綠海龜α-actin基因核苷酸序列與熱帶爪蟾、非洲爪蟾、牛蛙等物種的同源性為 85.4%以上, 其所編碼的氨基酸序列與其他物種的同源性達 98.9%以上, 表明 α-actin基因的核苷酸序列雖然在不同物種中存在較大變異, 但氨基酸序列卻保持了高度的穩(wěn)定性和一致性。蛋白質(zhì)的進化速率主要取決于功能上的需要或選擇壓力[29], Actin蛋白的高度保守性暗示著其在進化過程中承受著較大的選擇壓力, 在生物體內(nèi)執(zhí)行著重要的生物學(xué)功能。在脊椎動物中, 存在于肌肉組織中的 Actin蛋白是可收縮器官的重要組成[30], 綠海龜?shù)腁ctin蛋白對其生長發(fā)育的具體作用目前還沒有報道, 需要進一步的研究。

脊椎動物的 actin基因在很多物種中已被克隆,如人、斑馬魚、原雞、非洲爪蟾等, 也有學(xué)者克隆了綠海龜?shù)摩?actin基因片段, 但α-actin基因目前尚未見公開報道。本文利用RT-PCR和RACE方法首次克隆出綠海龜?shù)摩?actin基因全長cDNA序列, 豐富了 actin基因的資料庫, 并對該基因的結(jié)構(gòu)進行了初步探究, 為進一步研究相關(guān)基因的表達及功能奠定了基礎(chǔ)。

致謝: 感謝海南師范大學(xué)陳忠教授、山東大學(xué)威海分校海洋學(xué)院李玉春教授及孔令明在收集樣品過程中提供的幫助, 感謝山東大學(xué)威海分校海洋學(xué)院楊慧在軟件分析中提供的幫助。

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(本文編輯: 譚雪靜)

Cloning and sequence analysis of full-length cDNA of α-actin gene fromChelonia mydas

TAO Cui-hua1, LIU Ying-ying2, ZHAO Li-yuan1, XU Min1,2, ZHU Qian1,2
(1. Third Institute of Oceanography, State Oceanic Administration, Xiamen 361005, China; 2. Ocean College, Shandong University (Weihai), Weihai 264209, China)

Oct., 6, 2012

Chelonia mydas; α-actin gene; RACE

To explore the sequence and characteristic of α-actin gene fromChelonia mydas, the full-length cDNA sequence of α-actin gene was cloned using RT-PCR and RACE technique, which was consisted of 1347 bp nucleotides (GenBank accession number: JX073650), with a putative open reading frame (ORF) of 1134 bp encoding a deduced 377 amino acid protein containing a glycosylation site (from 14 to 17) and an Actin domain (from 7 to 377). The molecular weight of the protein was 42.0 kDa and the isoelectric point (pI) was 5.23. The nucleotide sequence similarity of α-actin gene betweenC. mydasand other species was above 85.4%, while the similarity of amino acid sequence was more than 98.9%, suggesting that α-actin gene was highly conserved. This study has enriched the Actin gene database and provided basic data for further studies on expression and function of relevant genes.

Q781

A

1000-3096(2014)03-0098-06

10.11759/hykx20121006001

2012-10-06;

2013-04-10

國家海洋局第三海洋研究所基本科研業(yè)務(wù)費專項資金項目(2010006); 國家海洋公益性行業(yè)科研專項(201105011)

陶翠花(1984-), 女, 新疆阜康人, 助理研究員, 碩士, 主要從事海洋生物學(xué)研究, 電話: 0592-2195211, E-mail: taocuihua@163.com祝茜, 通信作者, 電話: 0592-2191907, E-mail: qianzhu@sdu.edu.cn