馮寧寧 , 孫玉苗 , 溫 榮 , 張成松 , 李富花

(1. 中國科學(xué)院 海洋研究所 實驗海洋生物學(xué)重點實驗室, 山東 青島, 266071; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京, 100049)

脊尾白蝦白斑綜合征病毒耐受群體重要免疫相關(guān)酶的活性分析

馮寧寧1,2, 孫玉苗1, 溫 榮1,2, 張成松1, 李富花1

(1. 中國科學(xué)院 海洋研究所 實驗海洋生物學(xué)重點實驗室, 山東 青島, 266071; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京, 100049)

白斑綜合征(white spot syndrome, WSS)的爆發(fā)已給蝦類養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟損失, 尋找能夠指示蝦類群體抗白斑病能力的指標(biāo)對蝦類養(yǎng)殖業(yè)具有重要意義。本研究以脊尾白蝦(Exopalaemon carinicaudaHolthuis)為實驗材料, 以人工注射白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)攻毒后穩(wěn)定存活的脊尾白蝦作為WSSV耐受群體(命名為Rm), 以注射PBS的蝦作為對照群體(命名為Vm),分析比較了Rm群體和Vm群體的酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)活性差異以探討篩選對蝦抗病免疫指標(biāo)的可行性。Rm群體的ACP和AKP活性均顯著低于Vm群體(P＜0.05),而兩群體在SOD活性上無顯著差異。為進一步檢驗WSSV耐受群體是否比未經(jīng)歷過病毒感染的蝦具有更高的抗WSSV的能力, 作者以實驗室養(yǎng)殖過程中經(jīng)過WSSV自然感染后存活的脊尾白蝦作為抗性群體(命名為 Rn), 以未經(jīng)歷過 WSSV感染的脊尾白蝦作為普通群體(Vn), 進行 WSSV人工注射攻毒,觀察它們在WSSV感染后的存活率, 結(jié)果顯示Rn群體攻毒后存活率為33.2%, 顯著高于Vn群體的存活率15.1%(P＜0.05), 說明ACP和AKP有可能作為蝦類抗WSSV能力的評價指標(biāo)。

脊尾白蝦(Exopalaemon carinicaudaHolthuis); 白斑綜合征病毒(WSSV); 酸性磷酸酶ACP; 堿性磷酸酶AKP; 超氧化物歧化酶SOD

蝦類養(yǎng)殖是中國水產(chǎn)養(yǎng)殖的支柱產(chǎn)業(yè), 但隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展, 養(yǎng)殖密度的增高, 養(yǎng)殖環(huán)境的惡化以及種苗的退化, 蝦類的病害問題越來越突出。其中, 白斑綜合征(white spot syndrome, WSS)的爆發(fā)已給蝦類養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失[1]。白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)主要感染十足目(Decapoda)甲殼動物, 其在蝦類中的感染率和致死率極高, 自然感染的對蝦在3～9 d即可達到100%的死亡率[2-3]。因此篩選能夠指示蝦類抗白斑綜合征病毒能力的免疫指標(biāo),在蝦類養(yǎng)殖和苗種的抗性選育中具有重要意義。

蝦類依靠由細胞免疫和體液免疫組成的非特異性免疫系統(tǒng)來實現(xiàn)自身的免疫防御。酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)和超氧化物歧化酶(SOD)都是蝦類重要的體液免疫因子[4]。ACP和AKP是甲殼動物細胞內(nèi)溶酶體的重要組分, 參與血細胞的吞噬和包囊反應(yīng)[5]。SOD是生物體重要的抗氧化物酶,能夠清除超氧陰離子自由基, 保護大分子不被氧化破壞[6-7]。這3種酶常被認為可以作為衡量蝦類免疫狀態(tài)的指標(biāo), 用于評估蝦類的健康狀態(tài)、診斷病原感染階段、評價免疫增強劑或其他抗病物質(zhì)的免疫效果以及篩選抗病家系等[4,8-9]。然而, 大多相關(guān)報道著重于研究病原感染狀態(tài)下, 相關(guān)免疫酶類活性隨時間的表達變化特征, 這些研究雖然一定程度上能反映蝦的健康狀況, 但是不能指示蝦的抗病能力。另外,雖然這些酶類被用來指示蝦的免疫狀態(tài), 但是不同研究選取的酶的種類不同, 且對哪種酶更適合作為蝦類免疫指標(biāo)存在意見上的分歧。因此, 篩選能夠指示蝦類抗病能力的指標(biāo)亟待進行。

脊尾白蝦(Exopalaemon carinicaudaHolthuis), 屬于甲殼亞門(Crustacea), 十足目(Decapoda), 長臂蝦科(Palaemonidae), 白蝦屬(Exopalaemon), 是中國的養(yǎng)殖經(jīng)濟物種之一。由于其味道鮮美, 繁殖能力強, 因而具有廣闊的養(yǎng)殖前景。同時, 基于脊尾白蝦自身的一些生物學(xué)特點, 如環(huán)境適應(yīng)力強, 易于養(yǎng)殖; 體型適中, 易于操作;世代周期短, 可在人工條件下進行周年繁殖; 對 WSSV敏感, 是 WSSV的重要宿主[10], 因而其具備作為甲殼動物的實驗動物進行研究的潛力。作者以脊尾白蝦作為實驗動物, 通過WSSV感染實驗獲得了對WSSV耐受的群體, 分析了酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性, 探討篩選蝦類抗WSSV的免疫指標(biāo), 可為抗白斑綜合征病毒苗種的選育提供參考,促進蝦類養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和病毒的來源

實驗所用脊尾白蝦為連續(xù)多代在中科院海洋所水族樓實驗室孵化養(yǎng)殖獲得的, 平均體長(5.1± 0.7)cm, 體質(zhì)量平均為(2.0±0.5)g, 實驗前經(jīng) realtime 定量PCR檢測WSSV病毒含量, 證明其攜帶一定量的WSSV, 為WSSV潛伏感染的蝦。在飼養(yǎng)過程中未出現(xiàn)WSSV爆發(fā)的癥狀。

實驗所用WSSV的制備按照Sun等[10]描述的方法進行。所提取的病毒原液的濃度約為 1×105拷貝/μL,使用時用PBS緩沖液稀釋至所需濃度。

1.2 WSSV攻毒實驗

1.2.1 WSSV耐受群體的獲得

將病毒原液用PBS稀釋至80 拷貝/μL作為工作液備用。將脊尾白蝦分為攻毒組和對照組兩組, 攻毒組1 200尾, 對照組200尾。攻毒組采用人工肌肉注射的方式, 在每只蝦最后一腹節(jié)的腹部注射 WSSV懸液10 μL (約800 拷貝), 對照組注射PBS 10 μL,注射后按正常的管理方法進行換水投餌, 養(yǎng)殖溫度控制在 23℃左右。每天觀察蝦的存活情況, 及時將死亡蝦從養(yǎng)殖池內(nèi)移走。為了解死亡的蝦是否由于WSSV的感染引起, 分別采用一步 PCR的方法, 使用引物對 VP28F(5’GGCCATATGATGGATCTTTC TTTCACTCTTTC3’) 和 VP28R(5’CTCGAGCTCGG TCTCAGTGCCAG3’)對對照組死亡的蝦和攻毒組死亡的蝦進行檢測。至攻毒后第9天, 攻毒組剩余的脊尾白蝦存活情況穩(wěn)定。

以攻毒組存活下來的脊尾白蝦作為WSSV耐受群體(命名為Rm群體), 隨機從對照組中取與Rm相同數(shù)目的存活蝦作為對照群體(命名為Vm群體)。取Rm群體和Vm群體的頭胸部和游泳足樣品按個體進行標(biāo)記后分別在液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 WSSV耐受群體的攻毒實驗

為檢驗經(jīng)歷WSSV感染后的幸存蝦是否比未經(jīng)歷病毒感染的蝦抗病能力較高, 并檢驗基于 Rm和Vm所篩選的抗病指標(biāo)的可靠性, 以實驗室養(yǎng)殖的一批自然感染過WSSV并存活的脊尾白蝦作為耐受群體(命名為Rn), 以未經(jīng)歷過WSSV感染的脊尾白蝦作為易感群體(Vn), 進行攻毒實驗如下:

Rn和Vn脊尾白蝦各取120只, 分別放于8個40L左右的塑料缸中養(yǎng)殖, 每缸 30只, 每只蝦注射等量的WSSV提取液(約500拷貝)。每個群體中的3缸用于記錄死亡率, 另外1缸于感染前(0 h)、感染后6 h各取10只蝦的頭胸部樣品于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 總蛋白的提取及酶活檢測

將所取脊尾白蝦的頭胸部樣品分別在液氮中進行研磨, 相同群體中每 3尾脊尾白蝦的研磨粉末合為一組樣品, 用于酶活性指標(biāo)的檢測。

蛋白提取試劑盒購于貝博生物技術(shù)有限公司。按照試劑盒提供的提取方法提取脊尾白蝦的頭胸部研磨樣品的總蛋白, Bradford法測定提取的總蛋白的濃度[11]。

酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)和超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。分別按照試劑盒提供的說明書檢測脊尾白蝦中酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、超氧化物歧化酶的活性。

1.4 DNA提取及病毒拷貝數(shù)檢測

為比較Rm群體和Vm群體中WSSV的攜帶情況, 使用植物基因組 DNA提取試劑盒(天根生物科技有限公司)提取所保存的部分個體的游泳足樣品的DNA, DNA樣品的提取按照說明書進行。病毒拷貝數(shù)的檢測按照Sun等[10]描述的方法進行。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 17.0軟件、采用t檢驗(以P＜0.05 為顯著性水平)對不同組樣品的酶活差異進行顯著性檢驗。

表1 本研究中所用的引物Tab.1 Primers used in this study

2 結(jié)果

2.1 脊尾白蝦WSSV耐受群體的獲得

攻毒組脊尾白蝦于攻毒后18 h開始有蝦出現(xiàn)死亡, 36 h后出現(xiàn)大規(guī)模死亡, 96 h后存活情況趨于穩(wěn)定。至攻毒后第9天, 攻毒組脊尾白蝦存活45只, 存活率約為4%。使用一步PCR對死亡蝦做WSSV檢測, 結(jié)果表明, 攻毒組死亡的脊尾白蝦隨機抽取的20只蝦進行檢測都擴增到WSSV陽性條帶, 對照組中有20只脊尾白蝦在實驗期間死亡, 病毒檢測結(jié)果表明未檢測到陽性條帶, 說明其死亡原因并非WSSV感染。

2.2 Rm和Vm群體WSSV載量的檢測

使用real-time PCR方法, 檢測Vm群體游泳足中攜帶WSSV的量為(297±163)拷貝/ng DNA。攻毒組攻毒后第9天, 存活的Rm群體脊尾白蝦游泳足中的病毒含量為(296±82)拷貝/ng DNA, 二者在統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異。

2.3 Rm和Vm群體免疫相關(guān)酶類的酶活比較

利用酶活檢測試劑盒對 Rm群體和 Vm群體的ACP、AKP、SOD的活性進行了檢測, Rm群體每克總蛋白中ACP的酶活為(18.94±11.62)U, Vm群體每克總蛋白中ACP的酶活為(33.97±19.21)U, Rm群體的酶活顯著低于Vm(P＜0.05)(圖1a)。Rm群體每克總蛋白中AKP的酶活為(123.21± 43.44)U, 顯著低于 Vm群體AKP的酶活(158.65± 43.14)U(P＜0.05)(圖1b)。Rm群體每克總蛋白SOD的酶活為(71.69± 21.04)U, Vm群體為(80.11± 29.48)U, 二者無顯著差異(P＞0.05)(圖1c)。

圖1 Vm群體和Rm群體酸性磷酸酶、堿性磷酸酶及超氧化物歧化酶活性的比較Fig.1 Comparation of ACP、AKP and SOD activity between group Vm and Rm(圖2同)

2.4 Rn群體和Vn群體WSSV攻毒后存活率的比較

為驗證WSSV耐受群體與未經(jīng)歷過病毒感染的蝦是否在對WSSV的抗性上存在差異, 我們對Rn群體和Vn群體重新進行攻毒實驗。攻毒后Rn群體和Vn群體的存活率如圖 2所示。 Rn群體攻毒后存活率為33.2%顯著高于Vn群體的存活率15.1% (P＜0.05)。

2.5 Rn群體和Vn群體ACP和AKP酶活的比較

對Rn和Vn群體在WSSV感染后6 h的ACP和AKP的酶活進行分析的結(jié)果表明, 在WSSV感染后6 h, Rn群體ACP的酶活為(78.85±24.60)U/g蛋白,顯著低于Vn群體ACP的酶活(126.67±34.41)U/g蛋白(P＜0.05); Rn 群體 AKP 的酶活為(854.39± 533.01)U/g蛋白, 顯著低于 Vn群體 AKP的酶活(1705.56±991.77)U/g蛋白(P＜0.05)(圖3a和圖3b)。

3 討論

圖2 Vn群體和Rn群體在WSSV感染后的存活率比較Fig.2 Comparation of survival rate between group Rn and Vn

本研究以人工感染的方式將易感WSSV的個體淘汰, 剩余存活的個體被認為對 WSSV有耐受性,通過此種方法獲得了脊尾白蝦WSSV耐受群體。盡管口服感染是 WSSV感染的最佳方式, 但是考慮到口服感染難以控制每尾蝦感染的劑量, 因而本研究采用了人工注射感染的方式。人工注射可以保證存活蝦確實都經(jīng)歷過和死亡蝦同等劑量 WSSV的感染。Rm群體中病毒含量和 Vm群體沒有顯著差異,提示Rm群體中動物體反應(yīng)已經(jīng)恢復(fù)到感染前狀態(tài),相關(guān)酶活能夠反映脊尾白蝦的正常生理水平。Rm群體的ACP和AKP酶活均顯著低于Vm群體, 而兩者在SOD酶活上無顯著差異, 說明ACP和AKP酶活的差異有可能作為評價蝦類對 WSSV耐受性的指標(biāo)。在哺乳動物中, ACP、AKP可以被用作早期檢測山羊急性腎損傷的指標(biāo)[12], 牛乳液中的ACP和AKP酶能夠作為乳腺細胞被細菌感染的潛在指標(biāo)[13]。在無脊椎動物, 如扇貝、蝦和蟹類中, ACP和AKP曾被用作潛在的免疫能力相關(guān)指標(biāo)[14-17]。在日本對蝦抗病子三代與對照組的WSSV攻毒實驗中, 0～24 h子三代和對照組的ACP活力都是上升的, 但對照組增長較快, 而 AKP在攻毒之后先上升后下降, 且子三代酶活最終低于對照組, 該結(jié)果暗示抗病子三代能夠更好地平衡機體內(nèi)ACP和AKP的代謝水平, ACP和AKP酶活的穩(wěn)定可能是蝦具有更高的WSSV耐受性的一個代表[9]。投喂鐵線草(Cyanodon dactylon)的提取物能夠增強斑節(jié)對蝦抵抗 WSSV的能力, 但是投喂過該提取物的蝦和不投喂該提取物的蝦在SOD活力上并無顯著差異[18]。日本囊對蝦抗WSSV子三代和普通日本囊對蝦在SOD活性上也無顯著差異[9]。這些研究表明, ACP與AKP活力高低有可能作為衡量蝦類抗WSSV能力的潛在指標(biāo)。

對Rn群體和Vn群體在WSSV感染后的存活率比較的結(jié)果表明, Rn群體在WSSV感染后的存活率明顯高于Vn群體。酶活檢測的結(jié)果表明, Rn群體和Vn群體在感染后6 h, ACP 和AKP的酶活也存在顯著差異且Rn群體酶活低于Vn群體, 與之前檢測結(jié)果相似, 進一步說明ACP和AKP作為對蝦抗WSSV耐受性檢測指標(biāo)具有一定可行性。

本研究篩選得到ACP和AKP可以作為指示蝦類抗 WSSV能力的免疫指標(biāo), 可為蝦類抗病家系選育提供參考。然而由于酶活力會受到環(huán)境條件及機體生理活動等各種因素的影響, 建立對蝦相關(guān)酶活的檢測標(biāo)準(zhǔn), 進一步確定對蝦抗病性能定量檢測的指標(biāo)將作為下一步研究的重點。

圖3 Vn群體和Rn群體在WSSV攻毒6 h后酸性磷酸酶和堿性磷酸酶酶活的比較Fig.3 Comparation of ACP and AKP activity between group Rn and Vn at 6 h

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(本文編輯: 譚雪靜)

Analysis on the activity of immune related enzymes in survivedExopalaemon carinicaudafrom WSSV infection

FENG Ning-ning1,2, SUN Yu-miao1, WEN Rong1,2, ZHANG Cheng-song1, LI Fu-hua1
(1. Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Mar., 1, 2013

Exopalaemon carinicauda; WSSV; ACP; AKP; SOD

The white spot syndrome(WSS)had caused great economic loss to shrimp aquaculture. Seeking effective indicator for anti-WSSV ability in shrimp is very important to aquaculture industry. In the present study,Exopalaemon carinicaudawas chosen as a investigation target. The activities of different enzymes, including acid phosphatase (ACP), alkaline phosphatase (AKP) and superoxide dismutase (SOD), in the individuals survived from WSSV injection (WSSV tolerance population, Rm), and individuals subject to PBS injection (control population, Vm) were examined and compared in order to screen shrimp anti-virus indicators. The data showed that the activities of ACP and AKP in Rm were significantly lower than those in Vm, while the activity of SOD showed no difference between them. In order to explore whether individuals survived from WSSV infection showed higher anti-WSSV ability than normal shrimp, we took another batch of shrimp survived from natural WSSV infection as WSSV tolerance population (Rn), and shrimp without WSSV infection as control population (Vn) to perform WSSV injection. The cumulative mortality and survival rate were compared between Rn and Vn, and the data showed that Rn had significantly higher survival rate than Vn. These data suggest that ACP and AKP have the potential to be developed as indicators for evaluation of the anti-WSSV ability of shrimp.

P735

A

1000-3096(2014)03-0075-05

10.11759/hykx20130301002

2013-03-01;

2013-05-20

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項經(jīng)費項目(201103034); 國家科技支撐計劃項目(2011BAD13B01); 國家蝦產(chǎn)業(yè)體系項目(CARS-47)

馮寧寧(1987-), 女, 山東省濰坊人, 碩士研究生, 從事甲殼動物基礎(chǔ)免疫學(xué)研究, 電話: 0532-82898570, E-mail: fn1867@ 163.com; 李富花, 通信作者, 研究員, 電話: 0532-82898571, E-mail: fhli@ms.qdio.ac.cn