崔玉娟，張龍飛，平 政，曹雪濱

線粒體是真核細(xì)胞進(jìn)行氧化代謝產(chǎn)生能量的場所，對心肌收縮功能的維持起著至關(guān)重要的作用。冷暴露、饑餓、運(yùn)動等刺激會誘導(dǎo)線粒體數(shù)量增加和功能改變，即線粒體生物發(fā)生［1］。線粒體生物發(fā)生能夠提高細(xì)胞的能量代謝能力，從而滿足心肌持續(xù)收縮所需能量。目前研究表明線粒體生物發(fā)生的主導(dǎo)協(xié)調(diào)因子——過氧化物酶增殖物激活受體γ輔助激活因子-1α(Peroxisome proliferator-activated receptorγ coactivator 1α，PGC-1α)在線粒體活動中發(fā)揮了中心作用，它是控制線粒體生物發(fā)生轉(zhuǎn)錄通路上游的調(diào)節(jié)共激活因子，能通過強(qiáng)烈地誘導(dǎo)核呼吸因子-1(nuclear respiratory factor-1，NRF-1)和核呼吸因子-2(nuclear respiratory factor-2，NRF-2)基因的表達(dá)刺激線粒體生物合成，因此，PGC-1α-NRF-1-NRF-2是調(diào)控線粒體生物發(fā)生的關(guān)鍵級聯(lián)信號通路［2］。運(yùn)動是一種病理生理刺激，適度運(yùn)動能夠誘導(dǎo) PGC-1α、NRF-1、NRF-2 的表達(dá)［3］，從而刺激線粒體生物發(fā)生。而力竭運(yùn)動會對機(jī)體心臟功能造成負(fù)面影響，引起線粒體功能障礙［4］，但其分子機(jī)制是否與線粒體生物發(fā)生有關(guān)尚不明確。紅景天苷(Salidroside，SAL)是中藥紅景天中的主要有效成分之一，具有抗心肌缺血缺氧、抑制心肌細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管再生、抗動脈粥樣硬化等作用［5-7］。本實驗擬通過研究SAL對力竭大鼠心肌線粒體生物發(fā)生關(guān)鍵調(diào)控因子 PGC-1α、NRF-1、NRF-2在不同時相的表達(dá)，為SAL的臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器 清潔級SD雄性大鼠104只［軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，許可證號:SCXK(京)2003-1-003］。98%提純紅景天苷粉(南京澤朗植提技術(shù)有限公司)，兔抗PGC-1α抗體、兔抗NRF-1抗體及兔抗NRF-2抗體(英國Abcam公司)，兔抗β-Actin抗體(美國CST公司)，HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(中國中杉金橋公司)。凝膠成像系統(tǒng) Fluor Chem E(美國 Cell Biosciences公司)。Image J 1．44圖像分析軟件(National Institutes of Health)。

1.2 方法

1.2.1 分組:將104只SD大鼠隨機(jī)分對照(C)組、力竭(EE)組、低劑量SAL力竭(LS)組、高劑量SAL力竭(HS)組，對照組8只，其余組分4個時間點即即刻、6 h、12 h、24 h 觀察，每個時間點8 只。

1.2.2 造模及取材:C及EE組給予生理鹽水10 ml/kg灌胃 2周，LS和 HS組給予 SAL 100、300 mg/kg灌胃2周。EE、LS和HS組灌胃結(jié)束后分別予以建立一次性力竭游泳模型，C組無需特殊處理。一次性力竭游泳模型建立方法:使用塑料圓桶(高60 cm、直徑55 cm)作為大鼠的游泳場地，注意保證水的清潔，水深約 50 cm，水溫保持在(32.0±0．5)℃。模型建立前大鼠均進(jìn)行適應(yīng)性的無負(fù)重游泳練習(xí)，每次10 min，造模前大鼠需禁食12 h，造模時大鼠尾部負(fù)為體重3%的鉛塊。一次性力竭游泳運(yùn)動所達(dá)到的力竭狀態(tài)參考Thomas力竭標(biāo)準(zhǔn)［8］:①大鼠超過10 s沉入水下后無法再返回水面;②大鼠的協(xié)調(diào)運(yùn)動消失，出現(xiàn)了無方向性的亂竄，雖少于10 s亦可定為大鼠已力竭。對于短時間(2 h)內(nèi)就出現(xiàn)了運(yùn)動不協(xié)調(diào)的大鼠，將其撈出休息5 min后，繼續(xù)進(jìn)行游泳運(yùn)動至其力竭。達(dá)到力竭標(biāo)準(zhǔn)后，將大鼠撈出，吹干皮毛，并記錄結(jié)束時間。力竭后即刻、6、12、24 h，立即摘除3個模型組大鼠心臟，去除心房，于緩沖液中洗去心臟殘留血漬，裝入2 ml離心管中，做好標(biāo)記，置于液氮中冷凍后于－80℃冰箱中保存。同時期相同方法處理 C組大鼠。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 大鼠一般狀況及游泳時間:觀察3個模型組力竭運(yùn)動前后的一般狀況，記錄并比較EE、LS、HS組力竭游泳時間。

1.3.2 大鼠心肌 PGC-1α、NRF-1、NRF-2的蛋白表達(dá)測定:以 β-actin作為內(nèi)參。提取心肌蛋白，用BCA蛋白測定法測定蛋白濃度。取15μg蛋白質(zhì)樣品行SDS-PAGE電泳，電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，1%脫脂奶粉稀釋一抗 PGC-1α、NRF-1、NRF-2、β-actin分別按照1∶1000、1∶500、1∶500、1∶1000 的比例稀釋4℃孵育過夜，漂洗3次，HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG按照1∶10 000的比例稀釋，漂洗3次。使用ECL試劑盒發(fā)光顯影，放入凝膠成像系統(tǒng) Fluor Chem E中曝光顯影，使用Image J 1．44圖像分析軟件計算蛋白表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。各組間數(shù)據(jù)符合正態(tài)、方差齊(α＞0．1)時采用單因素方差分析，方差不齊時采用Dunnertt法，α=0．05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況及游泳時間 各模型組大鼠力竭運(yùn)動前活動自如，皮毛光亮，一般狀況可;力竭游泳運(yùn)動后表現(xiàn)為極度疲勞的狀態(tài):呼吸急促，運(yùn)動遲緩，對刺激的反應(yīng)不靈敏，部分動物甚至出現(xiàn)了結(jié)膜充血、血尿等征象。EE、LS及HS組游泳時間分別為(500．8 ± 18．0)、(580．9 ± 17．5)、(675．9 ±20．2)min，LS及HS組游泳時間較EE組明顯延長(P＜0.05)，HS組游泳時間較LS組明顯延長(P＜0.05)。

2.2 各組心肌蛋白表達(dá)量比較

2.2.1 心肌PGC-1α蛋白表達(dá)量:EE、LS及HS組PGC-1α蛋白表達(dá)量均為即刻最低，6 h最高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與C組比較，EE組各時相心肌PGC-1α蛋白的表達(dá)量均降低(P＜0.05)。與相同時相的EE組比較，LS組即刻、6、24 h，HS組各時相心肌PGC-1α蛋白表達(dá)量均顯著增高(P＜0.05)。與相同時相的LS組比較，HS組即刻、24 h PGC-1α蛋白的表達(dá)量顯著降低，6、12 h顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1、圖1。

2.2.2 心肌NRF-1蛋白表達(dá)量:各組不同時相心肌NRF-1蛋白表達(dá)比較，LS組6 h表達(dá)量最高，即刻表達(dá)量最低;HS組6 h表達(dá)量最高，24 h表達(dá)量最低。與C組比較，EE組即刻、6 h、24 h心肌NRF-1蛋白表達(dá)量顯著降低(P＜0.05)。與相同時相的EE 組比較，LS組6、12、24組，HS組即刻、12 h心肌NRF-1蛋白表達(dá)量顯著增高(P＜0.05)。與相同時相的LS組比較，HS組各時相心肌NRF-1蛋白表達(dá)量均顯著降低(P＜0.05)。見表1、圖1。

2.2.3 心肌NRF-2蛋白表達(dá)量:EE、LS及HS組NRF-2蛋白表達(dá)量均為12 h表達(dá)量最高，即刻表達(dá)量最低(P＜0.05)。與C組比較，EE組即刻、6 h、24 h心肌NRF-2蛋白表達(dá)量顯著降低(P＜0.05)。與相同時相的EE組比較，LS組即刻、6 h、12 h，HS組各時相心肌NRF-2蛋白表達(dá)量均顯著增高(P＜0.05)。與相同時相的LS組比較，HS組6、12、24 h心肌NRF-2蛋白表達(dá)量均顯著增高(P＜0.05)。見表1、圖1。

3 討論

在真核生物體內(nèi)，細(xì)胞呼吸、能量產(chǎn)生及其他代謝過程均發(fā)生在線粒體內(nèi)。線粒體是細(xì)胞代謝活動的重要調(diào)節(jié)器，是真核生物的糖、脂肪和氨基酸進(jìn)行氧化最終釋放能量的場所。力竭運(yùn)動后心肌耗氧量增加，細(xì)胞內(nèi)三磷腺苷(ATP)減少，影響細(xì)胞內(nèi)各種生化反應(yīng)的進(jìn)行，從而使心肌正常功能受到損害。PGC-1a作為線粒體生物合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，對維持生物活動的能量平衡起到重要的生理意義［9］。Ventura Clapier等［10］通過對降低心肌氧化能力在心臟衰竭的發(fā)病機(jī)制中作用的研究表明，心臟及骨骼肌在壓力超負(fù)荷下由于PGC-1a及其下游的NRF-2等因子的表達(dá)下調(diào)而引起線粒體功能減弱。本研究結(jié)果顯示，所有力竭運(yùn)動后大鼠的PGC-1α、NRF-1和NRF-2的蛋白表達(dá)量均低于對照組，表明力竭運(yùn)動會降低心肌線粒體的功能。此外，很多研究表明在接觸外源性氧化應(yīng)激［11-13］或應(yīng)答氧化損傷［14］時，線粒體生物生成會增加。本研究中各組PGC-1α和NRF-2蛋白均在力竭后即刻的表達(dá)量最低，隨時間延長蛋白表達(dá)量有所升高，PGC-1α在6 h升到最高，NRF-2在12 h達(dá)高峰，無進(jìn)一步升高趨勢。表明線粒體生物發(fā)生是力竭大鼠應(yīng)對心肌缺血缺氧的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

表1 各組大鼠心肌PGC-1α、NRF-1、NRF-2蛋白表達(dá)量比較(x±s)

圖1 各組大鼠心肌PGC-1α、NRF-1、NRF-2蛋白表達(dá)PGC-1α．過氧化物酶增殖物激活受體γ輔助激活因子-1α，NRF-1．核呼吸因子-1，NRF-2．核呼吸因子-2;C組．對照組，EE組．力竭組，LS組．低劑量紅景天苷力竭組，HS組．高劑量紅景天苷力竭組

紅景天是多年生草本植物，多生長于亞洲的高海拔地區(qū)與歐洲北極地區(qū)的干燥沙地，在惡劣的生長環(huán)境中表現(xiàn)出耐寒、耐干旱、耐強(qiáng)紫外線照射等特性，這表明紅景天對環(huán)境的適應(yīng)能力很強(qiáng)，生命力非常旺盛。作為紅景天主要活性物質(zhì)SAL的臨床藥用價值很高，尤其在心血管疾病治療方面，近些年來對其研究越來越多。有研究表明，SAL對缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷有保護(hù)作用［15］。楊雷等［16］的研究表明，SAL能促進(jìn)心肌梗死后大鼠心肌組織血管的再生。而本研究中LS及HS組力竭游泳時間均明顯高于EE組，說明SAL能夠增強(qiáng)大鼠的運(yùn)動耐力。LS組PGC-1α、NRF-1和 NRF-2及 HS組的 PGC-1α和NRF-2蛋白表達(dá)量顯著高于EE組，說明SAL能夠上調(diào)線粒體生物發(fā)生調(diào)節(jié)關(guān)鍵因子PGC-1α和NRF-2的表達(dá)，低劑量SAL能夠上調(diào)NRF-1的表達(dá)，從而刺激線粒體的生物發(fā)生，對力竭運(yùn)動產(chǎn)生的心肌損傷起保護(hù)作用。但HS組的NRF-1蛋白表達(dá)未見上調(diào)，可能是高劑量SAL通過對其他因子的調(diào)節(jié)影響了NRF-1的蛋白表達(dá)，具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，力竭運(yùn)動會造成心肌損傷，影響線粒體的功能，而SAL能通過刺激線粒體的生物發(fā)生形成對心肌的保護(hù)作用。SAL具有很好的開發(fā)前景，但其對心臟疾病的作用機(jī)制尚未完全清楚，仍需深入研究。

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