許秀蘭 張 翅 黃曉麗 張 雪 劉應高

(四川農(nóng)業(yè)大學，雅安，625014) (成都溫江花卉園林局) (四川農(nóng)業(yè)大學)

樹棲真菌泛指生活在林木上的所有真菌，是森林微生物系統(tǒng)的重要組成部分［1］，其中內(nèi)生真菌［2］被作為具有潛在利用價值的真菌資源得到廣泛的重視［3－7］。截止目前，這一類豐富的真菌資源仍未得到充分的研究和利用。四川西部康定地區(qū)的狹小區(qū)域是云杉(Picea)的現(xiàn)代分布中心［8］，該區(qū)域主要云杉樹種有:粗枝云杉(P.asperata)、川西云杉(P.likianensis var.balfouriana)、麥吊云杉(P.brachytyla)、麗江云杉(P.likianensis)、紫果云杉(P.purpurea)、白皮云杉(P.aurantiaca)、鱗皮云杉(P.retroflexa)等。目前報道的云杉葉部病害最為常見［9－13］。近年來，在四川二郎山地區(qū)也發(fā)現(xiàn)存在嚴重的云杉針葉枯死脫落的現(xiàn)象，嚴重影響云杉林的生長。本研究以云杉人工林中的云杉針葉為研究對象，對云杉內(nèi)生真菌的群落組成、結(jié)構(gòu)和多樣性進行研究分析，探索該地區(qū)云杉發(fā)病的原因，也可為后期篩選有效的生物拮抗菌奠定一定基礎。

1 研究方法

1.1 樣品采集

云杉針葉樣品采自二郎山林場的幼齡云杉林，采樣時間自9月份到次年7月份。每2月采集一次樣品，共計6 次。同時以海拔100 m 的差值設置5個樣點:2 480、2 580、2 680、2 780、2 880 m。并按樹冠的上、中、下進行取樣。

1.2 真菌的分離與純化

將云杉針葉切成5.0 mm 小段。處理Ⅰ:表面消毒，用70%的酒精處理30 s，0.1%升汞溶液表面消毒3 min，最后無菌水漂洗3 次，移至PDA 培養(yǎng)基。處理Ⅱ:表面不消毒，無菌水漂洗3 次后移至PDA 培養(yǎng)基。每個樣接種6 皿，每皿5 小段。置于人工氣候培養(yǎng)箱23 ℃恒溫培養(yǎng)，記錄菌落形態(tài)，采用尖端菌絲挑取法，在無菌條件下挑取形態(tài)不同、獨立的菌落轉(zhuǎn)入PDA 上純培養(yǎng)。同時統(tǒng)計分離率［14－16］。

1.3 真菌的形態(tài)分類鑒定

在PDA 培養(yǎng)基上所得的純培養(yǎng)，通過水載片，在顯微鏡下觀察其產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及孢子性狀，并結(jié)合菌落特征參考相關資料數(shù)據(jù)對各產(chǎn)孢菌株進行鑒定。采用不同培養(yǎng)基的方法對未產(chǎn)孢菌株進行產(chǎn)孢誘導［17］。

1.4 分子輔助分類鑒定

1.4.1 真菌總DNA 的提取

將PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌株用打孔法接種于PDB 培養(yǎng)液中，25 ℃振蕩培養(yǎng)5 ～7 d，無菌紗布過濾收集菌絲體，再用無菌濾紙將菌絲吸干，－20 ℃冷凍備用。采用改良二次沉淀法提取總DNA:將冷凍變硬的菌絲體轉(zhuǎn)移到已冷凍的研缽中，分別加入液氮2 ～3 次，把冷凍的菌絲體研磨成細粉末;迅速將粉末轉(zhuǎn)移到20 mL 離心管中，加入10 mL 緩沖液A(SDS－EB，pH=8.0)，密封后在旋渦振蕩器上混勻并靜置至室溫;將混合液置于65 ～68 ℃水浴20 min，室溫10 000 r/min 離心15 min;取上清液移至另一離心管，加入0.5 mL緩沖液B(8 MKOAc，pH =4.2)，混勻后冰浴45 min，于4 ℃下10 000 r/min 離心20 min;取上清液至另一試管，加入等體積的異丙醇，小心顛倒混合均勻，可以觀察到沉淀出現(xiàn);將離心管靜置5 min，倒掉上清液，將沉淀轉(zhuǎn)移到1.5 mL的離心管中，用70%乙醇清洗1 次，無水乙醇清洗2次，然后讓沉淀自然干燥;將沉淀溶解于50 μL 超純水，混勻后于冰箱中－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 rRNA 基因ITS 區(qū)的PCR 擴增及測序

采用真菌通用引物ITS1 和ITS4 進行擴增，ITS1(5'TCCGTAGGTGAACCTGCGG－ 3')，ITS4(5'TCCTCCGCTTATTGATATGC－3')。反應體系為50.0 μL，DNA 模板0.5 μL，dNTP mixture1.0 μL，ITS1 1.0 μL，ITS4 1.0 μL，Taq plus 酶0.5 μL，10 ×Buffer 5.0 μL，MgCl22.0 μL，超純水39.0 μL。擴增條件:95 ℃預變性5 min，30 個循環(huán)擴增(95 ℃1 min，50 ℃1 min，72 ℃1 min)，然后72 ℃延伸5 min，最后于4 ℃保存。產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖電泳進行檢測。送至上海生工生物有限公司進行DNA 序列測定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

以生長在不同海拔、不同樹體高度的云杉針葉為云杉葉棲真菌群落的棲息地結(jié)合采集樣本的不同季節(jié)，進行多樣性與均勻度比較。測度方法選用Simpson 的多樣性指數(shù)(λ，1949)、Shannon－Wiener的多樣性指數(shù)(H'，1949)、Pieloum 的均勻度指數(shù)(E1，1977)、Sheldon 的均勻度指數(shù)(E2，1969)和Heip 的均勻度指數(shù)(E3，1974)，計算公式為:

式中:S 為某部位樹棲真菌群落中的真菌種類;Pi為該部位樹棲真菌群落中第i 種的檢出率或稱出現(xiàn)頻率;H'為該部位樹棲真菌群落中S 個種的已知分離率總和;i=1，2，3，…，S［18］。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同冠層、葉齡的云杉葉棲真菌的種群組成

經(jīng)分離鑒定，自云杉樹冠上層針葉分離得到16個屬的19 種真菌。其中，表面消毒處理(Ⅰ)的針葉上有11 種，以Lophodermium sp.1、Pestalotiopsis sp.1、Phomopsis 為優(yōu)勢種群;不消毒處理(Ⅱ)的針葉上檢出真菌16 種，其中Pestalotiopsis sp.1、Aspergillus、Penicillium sp.2 的檢出率相對較高，為優(yōu)勢種。不同齡級真菌的種類差異較大，其中Pestalotiopsis sp.，Aspergillus sp.在各齡級針葉中都有分布。詳見表1。

表1 云杉樹冠上層針葉葉棲真菌檢出率

中冠層針葉組織分離結(jié)果見表2。自云杉樹冠中層的針葉上分離得到17 種真菌，分屬于14 個屬。表面消毒處理的針葉上獲得真菌9 種，Preussia sp.2的檢出率最高;不消毒處理的針葉上檢出真菌12種，其中Epicoccum nigrum 和Penicillium sp.1 的檢出率相對較高。葉齡不同，真菌的種類和數(shù)量都有差異。在各齡級都有分布的真菌種類有Penicillium sp，Epicoccum nigrum sp.，且數(shù)量較多。

表2 云杉樹冠中層針葉葉棲真菌檢出率

下冠層組織分離結(jié)果見表3。共分離得到26種真菌分別歸屬于20 個屬。經(jīng)表面消毒處理的針葉上獲得真菌14 種，以Pestalotiopsis sp.2 為優(yōu)勢種群;不消毒處理的針葉上檢出真菌20 種，其中Epicoccum nigrum、Xylaria sp.的檢出率相對較高。各齡級針葉真菌種類差異大，Preussia sp.，Epicoccum nigrum 為各齡級針葉共有的真菌。

表3 云杉樹冠下層針葉葉棲真菌檢出率

2.2 不同海拔云杉各冠層葉棲真菌的多樣性

從表4可以看出:云杉葉棲真菌的多樣性在同海拔處隨著冠層改變而有所不同。λ 指數(shù)反映出，葉棲真菌在海拔2 480、2 580 m 的云杉上、下冠層的多樣性一致，且都高于中冠層。而H'指數(shù)所示結(jié)果稍有差異，下冠層的多樣性最高，上冠層次之，同樣是中冠層最低。其他海拔的多樣性和均勻度指數(shù)，都反映出一致的規(guī)律:下冠層的多樣性和均勻度最高，中冠層最低，上冠層居于二者之間。

2.3 不同月份云杉各冠層葉棲真菌的多樣性

將調(diào)查期間6 次取樣的每兩個月數(shù)據(jù)進行分析，云杉葉棲真菌多樣性分析結(jié)果見表5。云杉上、中、下冠層總的葉棲真菌λ 指數(shù)和H'指數(shù)均在7月份和9月份顯示有最高的多樣性且均勻度也最高，而相對的11月份和1月份表現(xiàn)出最低的多樣性以及均勻度。在上、中、下各冠層單獨進行分析時，7月份和9月份的真菌多樣性和均勻度也是最高，11月份和1月份最低。

表4 不同海拔云杉葉棲真菌多樣性

表5 不同月份云杉葉棲真菌群落多樣性

3 結(jié)論與討論

采用2 種針葉表面處理，即消毒組和未消毒組對云杉葉棲真菌進行了組織分離及鑒定，較內(nèi)生真菌的研究來說更廣泛地分析了云杉針葉上真菌的組成和結(jié)構(gòu)，得到的數(shù)據(jù)也更全面。對云杉葉棲真菌的種群組成分析表明，葉棲真菌種類在不同冠層上的分布以下冠層最多，上冠層次之，而中冠層最少。這一結(jié)果與周秀華等［19］略有所不同，相同的是中冠層的真菌種類都是最少的，但和紅松葉棲真菌的組成［20］不同，這可能是樹種和立地條件等的不同而導致的差異。其次，上冠層和下冠層葉棲真菌的種群數(shù)量隨著樹齡的增長而增長，而中冠層真菌種群的數(shù)量在樹齡上雖然差異不大，但3年生及以上的葉棲真菌種群數(shù)略高于更小葉齡的針葉。這一規(guī)律和樟子松針葉上的葉棲真菌隨葉齡的增加而增加的結(jié)果相一致，且表面消毒后的真菌也明顯少于葉表棲真菌［19，21－22］。此外，不同葉齡針葉的真菌數(shù)量變化在紅松葉棲真菌群落結(jié)構(gòu)組成分析上也有相同結(jié)論［20］。

室外調(diào)查時發(fā)現(xiàn)，每個樣點的發(fā)病云杉都是樹體的中下冠層最為嚴重。宋瑞清等［23］以紅松不同棲息地的樹棲真菌分離率作為種群個體參數(shù)，采用多樣性指數(shù)和均勻性指數(shù)對樹棲真菌進行多樣性比較，樹棲真菌多樣性和均勻度越高，病害發(fā)生的可能性越低，呈負相關。對云杉葉棲真菌多樣性的分析表明，中冠層的多樣性和均勻度都是最低的，下冠層雖然真菌群落的多樣性和均勻度指標都較高，但卻發(fā)病嚴重。這主要是受病針葉掉落在云杉林下，故下層的針葉更容易接受到病原菌孢子的侵染并定殖而易引起病害的發(fā)生。賈云等［24］對紅松落針病研究時也提出，病葉落地后產(chǎn)生的子囊孢子向上飛散形成密度遞減的梯度。研究表明，7月份和9月份的真菌多樣性和均勻度最高，但云杉林在每年的6月份到9月份發(fā)病嚴重，這得考慮到林木病害在森林生態(tài)中的分布還受多種環(huán)境因素的影響［25］。因此，真菌群落的多樣性與均勻度反映了群落的穩(wěn)定性，也在一定程度上與病害現(xiàn)象相關，有助于對病害的發(fā)生進行分析。但這種相關度的高低，是否和病害的發(fā)生有必然聯(lián)系還需要作大量的實踐工作加以分析判斷。

對云杉葉棲真菌群落的研究表明，散斑殼屬(Lophodermium)和擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis)在所有葉棲真菌中檢出率相對較高，而這兩屬真菌中的有些種是松落針病和赤枯病的病原菌［26－28］。二郎山林場的樹種分布以松樹和云杉所占比例最大，并且已有這兩種松樹病害的發(fā)生，故在對松樹病害防治的同時，應加強對云杉的施藥防病，防止同屬植物的病原菌侵染，減少病原菌的繁殖場所。近年來，二郎山地區(qū)的云杉幼林出現(xiàn)了嚴重的針葉枯死脫落癥狀，以上兩屬的真菌在病害發(fā)生的過程中是否參與致病，還有待研究。同時，在對葉棲真菌的分離中，檢出的菌株中有引起云杉葉疫病的根球殼孢菌(Rhizosphaera kalkhoffia)，該菌1990年在我國首次報道［13］，此后便很少有報道，而國外在早年報道較多［12，29－32］。目前國內(nèi)報道更多的是由云杉散斑殼菌(Lophodermium picea )引起的云杉落針?。?－10，33－34］，但在室外發(fā)病針葉上并未發(fā)現(xiàn)云杉散斑殼的子囊果。因此，引起二郎山云杉幼林受害的病原菌亟需進一步研究確定。

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