李姝江 朱天輝 彭 艷 雷美艷 韓 珊

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，雅安，625014)

楊樹紫紋羽病為世界性的一種楊樹病害，從苗到大樹均能受害。楊樹發(fā)生紫紋羽病后，輕者影響樹體正常生長(zhǎng)，降低木材質(zhì)量，重者引起個(gè)體或林木成片死亡，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，影響楊樹種植業(yè)的發(fā)展［1］。目前對(duì)楊樹紫紋羽病的防治措施主要有，對(duì)苗木嚴(yán)格檢疫，避免栽植帶病苗木;加強(qiáng)栽培管理，增強(qiáng)樹勢(shì);采用波爾多液、硫酸銅、硫酸亞鐵、代森銨、福爾馬林、福美砷藥液進(jìn)行灌根?；瘜W(xué)農(nóng)藥是毒性較高、環(huán)境釋放率較大、影響面廣的物質(zhì)，會(huì)破壞農(nóng)業(yè)生態(tài)甚至危害人體健康［2］。因此，開發(fā)替代化學(xué)殺菌劑的新型生物殺菌劑已成為必然［3］。國(guó)內(nèi)外對(duì)楊樹紫紋羽病生物防治的研究報(bào)道較少，有研究表明絳紅褐鏈霉菌(Streptomyces purpeofuscus YSSPG3)發(fā)酵液對(duì)楊樹紫紋羽病菌會(huì)產(chǎn)生抑菌帶［4］，分離自石榴果實(shí)中的1 株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)所產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)能使楊樹紫紋羽病菌的菌絲變粗［5］。鏈霉菌是革蘭氏陽(yáng)性放線菌，具有復(fù)雜的次級(jí)代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并產(chǎn)生大量具有重要價(jià)值的天然代謝物，包括抗生素［6］、殺蟲劑［7］以及胞外水解酶，如纖維素酶［8］、幾丁質(zhì)酶［9］、果膠酶［10］、淀粉［11］等，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、農(nóng)業(yè)、食品等領(lǐng)域。謝晨昭等［12］分離得到的拮抗放線菌B1 菌株—淡紫灰鏈霉菌(Streptomyces lavendulae)，對(duì)番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)等10 種植物病原真菌和甘藍(lán)黑腐病菌(Xanthomonas campestris)等3 種植物病原細(xì)菌均有抑制作用，有較廣的抑菌譜，其抗菌活性物質(zhì)對(duì)番茄灰霉病有良好的防治效果。拮抗球胞鏈霉菌AM6 的代謝產(chǎn)物可用于煙草赤星病的田間防治，且田間防效可達(dá)80.3%［13］。國(guó)內(nèi)外關(guān)于桑氏鏈霉菌的抗真菌活性已有少許報(bào)道，例如從菜園土壤樣品中分離得到的S.sampsonii GS1322 抗真菌活性的研究［14］、利用大孔吸附樹脂對(duì)S.sampsonii HP－47 抗真菌活性物質(zhì)的吸附工藝的研究［15］等。筆者從健康的楊樹根際土壤中分離篩選到1 株對(duì)楊樹紫紋羽病菌有較好拮抗效果的產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的菌株，并對(duì)其產(chǎn)幾丁質(zhì)酶特性進(jìn)行研究，優(yōu)化其產(chǎn)酶條件，并將優(yōu)化培養(yǎng)的發(fā)酵濾液用于田間防治試驗(yàn)，以期為其在生防中的實(shí)際應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

紫絲核菌(Rhizoctonia violacea)，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院森林保護(hù)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。菌株112903:從健康的楊樹根際土壤中分離得到。

1.2 膠體幾丁質(zhì)的制備

參照文獻(xiàn)［16］的方法進(jìn)行操作。

1.3 主要培養(yǎng)基

高氏一號(hào)培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、幾丁質(zhì)平板培養(yǎng)基(膠體幾丁質(zhì)200 mL，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO40.7 g，KH2PO40.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，ZnSO40.001 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH=7.0 ～7.2)、產(chǎn)酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基(膠體幾丁質(zhì)200 mL，K2HPO40.7 g，KH2PO40.3 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，ZnSO40.001 g，蒸餾水1 L，pH=7.0)，其余培養(yǎng)基參照《鏈霉菌鑒定手冊(cè)》。所用試劑均為國(guó)產(chǎn)AR 級(jí)試劑。

1.4 土壤放線菌的分離

利用稀釋涂布平板法［17］分離單菌落，并分別保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 拮抗放線菌的篩選

以紫絲核菌為靶標(biāo)，采用平板對(duì)峙法［18］進(jìn)行初篩。經(jīng)初篩得到的菌株，用劃線法經(jīng)分離純化出菌落。然后再接種于幾丁質(zhì)平板上，置于生化培養(yǎng)箱內(nèi)(28 ℃)，培養(yǎng)時(shí)間同初篩，觀察單菌落周圍透明圈的產(chǎn)生情況，篩選出對(duì)楊樹紫紋羽病具有較好拮抗活性的放線菌，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 菌株112903 的鑒定

形態(tài)特征觀察:在高氏一號(hào)和PDA 培養(yǎng)基采用平皿插片法［19］進(jìn)行形態(tài)觀察，分別于5 ～10 d 取出插片置載玻片上在光學(xué)顯微鏡下觀察氣生菌絲、基內(nèi)菌絲和孢子絲的形態(tài)。參照《植物病原真菌的超微結(jié)構(gòu)》［20］進(jìn)行掃描電子顯微鏡觀察。

培養(yǎng)特征觀察和生理生化特征分析:參照文獻(xiàn)［21］中推薦的部分培養(yǎng)基和方法對(duì)菌株112903 進(jìn)行培養(yǎng)特征觀察和生理生化鑒定，28 ℃恒溫培養(yǎng)7 ～14 d 后觀察記錄特征。

16 S rDNA 序列分析:菌株112903 的基因組DNA 的提取采用購(gòu)于天根公司的DNA 試劑盒，以提取的DNA 為模板，用16 S rDNA 的通用引物對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增。通用引物為1492R 5'－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－ 3' 和 27F 5'－ GGTTACCTTGTTACGACTT－3'。16 S rDNA 片段的擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5 min;再以94 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30 次循環(huán);72 ℃后延伸5 min;4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠(含EB 0.5 mg/L)上電泳觀察，1×TAE 電泳緩沖液，80 V，40～50 min，在紫外燈下觀察結(jié)果，PCR 產(chǎn)物應(yīng)在大約1.5 kb 位置有一明顯的電泳帶。獲得的PCR 產(chǎn)物送上海生工純化測(cè)序。將測(cè)序得到的序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)注冊(cè)的菌株進(jìn)行BLAST 分析，利用NAMAN 對(duì)序列進(jìn)行同源性比對(duì)，選取同源性高的菌株，采用Neighbor－joining(Clustrax1.8 和MAGE4.0軟件)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，依據(jù)Nucleotide:Kimura 2－Paramter 推測(cè)遺傳距離Bootstrap(500replicates;seed=64238)，具體參照文獻(xiàn)［22］方法進(jìn)行。

1.7 菌株112903 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶發(fā)酵條件的優(yōu)化

菌株112903 孢子懸液制備:將菌株112903 接種于幾丁質(zhì)平板，25 ℃培養(yǎng)4 d，進(jìn)行活化。將平板表面的孢子刮落下來，用無(wú)菌水制備量濃度為107菌落/mL 的孢子懸液。

酶活力的測(cè)定:制備菌株112903 發(fā)酵濾液，以產(chǎn)酶培養(yǎng)基為初始培養(yǎng)基，將配置好的培養(yǎng)基分裝至100 mL 三角瓶中，每瓶20 mL，121 ℃滅菌30 min，冷卻后每瓶接入1 mL 量濃度為107菌落/mL的孢子懸液，每個(gè)平行樣品設(shè)3 次重復(fù)，然后置于恒溫?fù)u床上，25 ℃，140 r/min，培養(yǎng)一定時(shí)間后，5 000 r/min，4 ℃離心15 min，65 ℃下濃縮至50 mL，離心，留上清液，用0.22 μm 孔徑無(wú)菌過濾器過濾除菌，獲得制備好的發(fā)酵濾液。

幾丁質(zhì)酶活力測(cè)定方法:在0.5 mL 膠體幾丁質(zhì)和1 mL 磷酸鹽緩沖液(pH =7.0)體系中加入1 mL發(fā)酵濾液，50 ℃準(zhǔn)確水浴1 h，以DNS 法［23］測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)生的還原糖。冷卻離心后，取上清液在波長(zhǎng)540 nm 下測(cè)吸光度(OD)，并與已知濃度的N－乙酰氨基葡萄糖(NAG)的OD 值做標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。根據(jù)DNS 法作N－乙酰氨基葡萄糖(NAG)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出酶活力［24］。以50 ℃下，每分鐘酶催化膠體幾丁質(zhì)釋放出1 μg NAG 所需的酶量為一個(gè)酶活單位。

培養(yǎng)時(shí)間與產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的關(guān)系:以產(chǎn)酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基為初始培養(yǎng)基。每培養(yǎng)24 h 測(cè)定一次幾丁質(zhì)酶活力。并繪制生防鏈霉菌的產(chǎn)酶曲線，得出最佳產(chǎn)酶時(shí)間，作為下步試驗(yàn)酶活力測(cè)定時(shí)間。

培養(yǎng)基的初始pH 值對(duì)鏈霉菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的影響:用HCl 和NaOH 溶液將后產(chǎn)酶培養(yǎng)基起始pH值調(diào)成3 ～12，按1 遞增，10 個(gè)梯度，以中間值為對(duì)照。第6 天測(cè)定幾丁質(zhì)酶活力，測(cè)定方法同幾丁質(zhì)酶活力測(cè)定。

不同培養(yǎng)溫度對(duì)桑氏鏈霉菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的影響:分別將產(chǎn)酶培養(yǎng)基放入到恒溫箱中24、26、28、30、32 ℃培養(yǎng)，第6 天測(cè)定幾丁質(zhì)酶活力，測(cè)定方法同幾丁質(zhì)酶活力測(cè)定。

碳氮源對(duì)鏈霉菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的影響:在產(chǎn)酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加1%的各種碳源，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對(duì)照，碳源有以下幾種:葡萄糖、NAG、麥芽糖、蔗糖、乳糖、甘油、淀粉、研究各種碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響。在產(chǎn)酶基本培養(yǎng)基中添加0.2%的各種氮源，以基本培養(yǎng)基為對(duì)照，無(wú)機(jī)氮源有(NH4)2SO4、NH4NO3、KNO3;有機(jī)氮源有蛋白胨、牛肉膏，研究不同氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響。第6 天測(cè)定幾丁質(zhì)酶活力，得出最佳碳氮源。

產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方的優(yōu)化:在確定最佳碳源、氮源的基礎(chǔ)上，設(shè)置膠體幾丁質(zhì)(100、200、300 mL/L)、蛋白 胨(0.10%、0.25%、0.40%)、無(wú) 機(jī) 鹽——K2HPO4(0.4、0.7、1.0 g/L)、KH2PO4(0.15、0.30、0.60 g/L)4 因素3 水平的正交試驗(yàn)，第6 天測(cè)定幾丁質(zhì)酶活力。

1.8 發(fā)酵濾液對(duì)楊樹紫紋羽病的田間防效測(cè)定

選擇歷年發(fā)病中等林地，移栽健康楊樹苗木。將于產(chǎn)酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基與發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基中發(fā)酵后所得的濾液按體積比分別稀釋10、50、100、200、400、600、800 倍后，加上原液分別沿楊樹苗木根系幅面灌根，以無(wú)菌水為對(duì)照。每株100 mL，每處理30株，6 重復(fù)。每年春、夏季各施用一次，秋季統(tǒng)計(jì)發(fā)病率，發(fā)病率為發(fā)病株數(shù)占總株數(shù)的比例。

1.9 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS19.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素ANOVA 分析，采用LSD 法進(jìn)行多組樣本間差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌的篩選結(jié)果

以R.violacea 為指示菌，通過初篩、復(fù)篩得到具有明顯拮抗效果的3 株放線菌，編號(hào)分別為JK1－3、JK2－1、112903，經(jīng)過計(jì)算各菌株的抑制率分別是51.6%、53.3%、61.3%?？梢?，放線菌112903 抑菌活性強(qiáng)，抑菌性穩(wěn)定，因此確定菌株112903 為下一步的試驗(yàn)菌株，用于進(jìn)一步研究分析。

2.2 菌株112903 的分類地位

2.2.1 形態(tài)特征

菌株112903 在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落表面呈粉絨狀凸起，菌落乳脂色，在PDA 培養(yǎng)基上帶有明顯褶皺，培養(yǎng)7 ～10 d 后，顯微鏡下可以看見菌株112903 基內(nèi)基內(nèi)菌絲豐富，菌絲無(wú)橫隔，多分支，不斷裂;電鏡掃描結(jié)果顯示，孢子絲長(zhǎng)而直，柔曲，偶見2 ～3 圈螺旋形。孢子卵圓形至短圓柱形，表面光滑(圖1)。

圖1 菌株112903 掃描電鏡觀察結(jié)果［左為菌絲(1500 ×)］;右為孢子(2000 ×)］

2.2.2 培養(yǎng)特性及生理生化特性

利用不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)，菌株112903 在瓦氏肉汁瓊脂、牛肉膏蛋白胨、PDA、馬鈴薯塊培養(yǎng)基上氣生菌絲和基內(nèi)菌絲都生長(zhǎng)良好，氣生菌絲蚌肉白至淺鶴灰，基生菌絲塵灰至棕葉綠。而在高氏一號(hào)瓊脂、葡萄糖天門冬素瓊脂、無(wú)機(jī)鹽淀粉瓊脂培養(yǎng)基上氣生菌絲不發(fā)達(dá);在PDA 培養(yǎng)基上可產(chǎn)生金褐色的可溶性色素，所產(chǎn)的氣生菌絲與基內(nèi)菌絲的顏色有差別(表1)。該菌可在15 ～45 ℃環(huán)境下生長(zhǎng)，環(huán)境溫度為45 ℃時(shí)基內(nèi)菌絲生長(zhǎng)，但不產(chǎn)生孢子。其存活pH 值為3 ～12;能水解淀粉，能液化明膠，不能使牛奶凝固，不能還原硝酸鹽，不能產(chǎn)生黑色素和H2S，不能在纖維素上生長(zhǎng)。利用葡萄糖、麥芽糖、甘油、甘露醇、山梨醇，不利用木糖、果糖、酒石酸鈉和肌醇。

2.2.3 16 S rDNA 分析與系統(tǒng)發(fā)育樹

以菌株112903 的基因組DNA 為模板，利用16 S rDNA 基因引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到1.4 kb 的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。經(jīng)測(cè)序，得到的16 S rDNA 全序列經(jīng)過校對(duì)后，與GeneBank 序列數(shù)據(jù)庫(kù)中的已有序列進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)序列同源性從高到低的次序選取模式菌株的序列用于序列分析，利用ClustalX 程序進(jìn)行列陣分析，并用Mega4 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。研究發(fā)現(xiàn)就16 S rDNA 序列而言，菌株112903 與Streptomyces sampsonii 同源性達(dá)到了99.31%。

2.3 菌株112903 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 初始pH、培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)溫度對(duì)桑氏鏈霉菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的影響

幾丁質(zhì)酶活性在pH 為7.0 時(shí)達(dá)到最大。此后，隨著pH 值增大，酶活力持續(xù)下降。該菌株的最佳產(chǎn)酶pH 為中性，pH 過高或過低對(duì)產(chǎn)酶的影響較大(圖3A)。幾丁質(zhì)酶活力在第6 天達(dá)到最大值，此后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)液中的幾丁質(zhì)酶活性開始下降。因此在后續(xù)的試驗(yàn)中，選擇第6 天作為最佳酶活力的測(cè)定時(shí)間(圖3B)。該菌株最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)溫度為26 ℃(圖3C)?？傮w來說，在試驗(yàn)測(cè)定范圍內(nèi)，培養(yǎng)溫度對(duì)幾丁質(zhì)酶產(chǎn)酶的影響較小。

表1 菌株112903 的培養(yǎng)特征

圖2 基于16 S rDNA 的菌株112903 與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 初始pH、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度對(duì)菌株112903 產(chǎn)酶活性的影響

2.3.2 不同碳源、氮源對(duì)菌株112903 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的影響

在產(chǎn)酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，以100 mL/L 的膠體幾丁質(zhì)與0.1%的其它碳源作為復(fù)合碳源進(jìn)行發(fā)酵對(duì)比試驗(yàn)，以葡萄糖、淀粉、麥芽糖、乳糖、NAG、作為添加碳源時(shí)，吸光度達(dá)到儀器的極限值，無(wú)法估算其中的幾丁質(zhì)酶含量。添加蔗糖和甘油的培養(yǎng)基發(fā)酵液的酶活力低于以膠體幾丁質(zhì)作為唯一碳源的酶活力，蔗糖和甘油對(duì)產(chǎn)酶有一定的抑制作用，以膠體幾丁質(zhì)作為唯一碳源時(shí)產(chǎn)酶效果最好，結(jié)果如表2所示。

表2 不同碳源對(duì)菌株112903 產(chǎn)酶活性的影響

在產(chǎn)酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加幾種單一有機(jī)或無(wú)機(jī)氮源，結(jié)果表明，以蛋白胨為氮源時(shí)酶活力最高，其次是牛肉膏;采用單一無(wú)機(jī)氮源時(shí)產(chǎn)酶都較低(表3)。

表3 不同氮源對(duì)菌株112903 產(chǎn)酶活性的影響

2.3.3 碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)酶影響的正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以膠體幾丁質(zhì)、蛋白胨、K2HPO4、KH2PO4為產(chǎn)酶因素，按L9(34)設(shè)計(jì)試驗(yàn)，分別取發(fā)酵濾液進(jìn)行幾丁質(zhì)酶活力測(cè)定，9 組試驗(yàn)結(jié)果分別為0.320 0、0.256 7、0.926 7、0.366 7、0.223 3、0.650 0、0.426 7、0.283 3、0.826 7 U/mL。確定較優(yōu)產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，菌株在4 因素的影響下產(chǎn)酶的最佳配比是:膠體幾丁質(zhì)300 mL/L，蛋 白 胨0.4%，K2HPO41.0 g/L，KH2PO40.6 g/L。各因素均達(dá)到極顯著水平，其中對(duì)產(chǎn)酶影響最大的是氮源含量，其次為膠體幾丁質(zhì)、K2HPO4，相比之下底物濃度和KH2PO4對(duì)產(chǎn)酶的影響較小(表4、表5)。

表4 不同碳氮源、無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌株112903 產(chǎn)酶影響的正交試驗(yàn)極差分析結(jié)果

表5 不同碳氮源、無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌株112903 產(chǎn)酶影響的正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

2.4 發(fā)酵濾液對(duì)楊樹紫紋羽病的田間防治效果

通過觀察并統(tǒng)計(jì)楊樹紫紋羽病的發(fā)生率(圖4)，結(jié)果顯示，對(duì)S.sampsonii 112903 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶條件優(yōu)化后，可顯著降低楊樹紫紋羽病的發(fā)生率，特別是使用優(yōu)化后的發(fā)酵原液及稀釋10、50 倍的發(fā)酵濾液處理時(shí)，無(wú)發(fā)病現(xiàn)象，從而顯著提高防治效果。

圖4 發(fā)酵濾液對(duì)楊樹紫紋羽病田間防治效果

3 結(jié)論與討論

鏈霉菌廣泛地存在自然界中。有關(guān)桑氏鏈霉菌S.sampsonii 的報(bào)道，R E 布坎南在《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第8 版中記載該菌是從普通馬鈴薯的瘡痂病中分離到的［25］;而賀春玲［26］、吳浩瑄等［15］分別從長(zhǎng)木蜂蜂糧和海綿中分離得到;本試驗(yàn)分離出S.sampsonii 112903 是從健康的楊樹根際土壤中篩選得到。另一方面，微生物幾丁質(zhì)酶不僅在生物降解幾丁質(zhì)方面起著重要作用，而且可通過水解病原真菌的細(xì)胞壁而有效地抑制其生長(zhǎng)［27］。本試驗(yàn)利用平板對(duì)峙法篩選到對(duì)楊樹紫紋羽病有拮抗作用的3株菌株，進(jìn)而用膠體幾丁質(zhì)平板檢查產(chǎn)幾丁質(zhì)酶性能，結(jié)合形態(tài)、生理生化特性及16 S rDNA 分析獲得S.sampsonii 112903。微生物產(chǎn)幾丁質(zhì)酶能力不僅取決于生產(chǎn)菌種本身的性能，而且需要合適的環(huán)境，才能使其性能充分表現(xiàn)出來。目前對(duì)幾丁質(zhì)酶的發(fā)酵研究較多的是木霉屬真菌［28］和芽孢桿菌屬細(xì)菌［29］，對(duì)桑氏鏈霉菌幾丁質(zhì)酶發(fā)酵鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)通過搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)，以發(fā)酵幾丁質(zhì)酶活性為指標(biāo)，采用單因素和正交試驗(yàn)對(duì)S.sampsonii 112903 的培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。其中，培養(yǎng)基初始pH 值對(duì)菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶影響較大，這與Leger等［30］等的結(jié)論相同，他們還通過RNA Northern 印跡分析證明，pH 值在幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)中起著重要作用，這一結(jié)果有助于對(duì)幾丁質(zhì)酶基因的進(jìn)一步研究。眾所周知，碳、氮源是影響微生物發(fā)酵的最主要因素，本研究中僅使用膠體幾丁質(zhì)是誘導(dǎo)該菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的最佳碳源，這一結(jié)果與大多數(shù)研究相同［31－32］;膠體幾丁質(zhì)比細(xì)粉幾丁質(zhì)分散均勻，誘導(dǎo)產(chǎn)酶能力更強(qiáng)，但與鄧紅梅等［33］結(jié)論不同，可能由于不同種類微生物對(duì)其利用有所不同。以甘油和蔗糖作為添加碳源時(shí)的酶活力比幾丁質(zhì)作為唯一碳源時(shí)的酶活力低，出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是S.sampsonii 112903 對(duì)碳源的利用有一個(gè)誘導(dǎo)的過程，并且各種碳源的誘導(dǎo)途徑不一樣，使幾丁質(zhì)酶的表達(dá)滯后。本試驗(yàn)中蛋白胨為最佳氮源，證實(shí)有機(jī)氮比無(wú)機(jī)氮誘導(dǎo)產(chǎn)酶更佳，但楊紹青等［32］認(rèn)為2 種氮源的復(fù)配提供的營(yíng)養(yǎng)更為全面，S.sampsonii 112903 是否存在同樣結(jié)果有待進(jìn)一步的研究。再者，K2HPO4與KH2PO4是一對(duì)緩沖體系，維持發(fā)酵環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，同時(shí)又為S.sampsonii 112903 提供磷元素，因此在發(fā)酵組分中起重要作用。

在田間防治試驗(yàn)中，優(yōu)化培養(yǎng)后的發(fā)酵濾液對(duì)楊樹紫紋羽病有較好的防治效果，10 倍和50 倍發(fā)酵液的處理均無(wú)發(fā)病現(xiàn)象，說明優(yōu)化后S.sampsonii 112903 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶大大增加，從而使楊樹根部形成有益的小生境，阻礙病原菌的侵染、抑制病原菌的繁殖和擴(kuò)展，因此起到較好的預(yù)防與治療作用。本研究結(jié)果中S.sampsonii 112903 表現(xiàn)出了較好的應(yīng)用前景，為將其開發(fā)用于生物防治奠定了一定的基礎(chǔ)。

［1］ 趙桂華，王海明，牛迎福，等.楊樹紫紋羽病發(fā)生與防治［J］.西部林業(yè)科學(xué)，2010，39(1):86－89.

［2］ 華小梅，江希流.我國(guó)農(nóng)藥環(huán)境污染與危害的特點(diǎn)及控制對(duì)策［J］.環(huán)境科學(xué)研究，2000，13(3):40－43.

［3］ Philip Jarvis，關(guān)愛瑩，劉長(zhǎng)令.生物農(nóng)藥的現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢(shì)［J］.農(nóng)藥科學(xué)與管理，2002，23(3):29－30，34.

［4］ 張麗娜，朱天輝，李芳蓮.絳紅褐鏈霉菌YSSPG3 的鑒定及其抗菌蛋白純化［J］.植物病理學(xué)報(bào)，2012，42(3):242－251.

［5］ 周翠，喬魯芹，金靜，等.一株枯草芽孢桿菌揮發(fā)性物質(zhì)的抑菌作用初步研究［J］.農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2011，13(2):201－204.

［6］ 陳祈磊，趙子翰，王輅，等.黃灰鏈霉菌SIIA－A02191 產(chǎn)生的多環(huán)口山酮類新抗生素Bromoxantholipin［J］.中國(guó)抗生素雜志，2011，36(8):566－570.

［7］ Bentley S D，Chater K F，Cerdeno-Tarraga，et al.Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3 (2)［J］.Nature，2002，417:141－147.

［8］ 徐杰，楊謙.一株高活力纖維素酶產(chǎn)生菌－鏈霉菌C－5 產(chǎn)酶研究［J］.太陽(yáng)能學(xué)報(bào)，2009，30(5):682－685.

［9］ 邱立友，王明道，戚元成，等.鏈霉菌A048 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶最佳發(fā)酵工藝研究［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2006，33(2):58－62.

［10］ Kuhad R C，Kapoor M，Rustagi R.Enhanced production of an alkaline pectinase from Streptomyces sp.RCK-SC by whole-cell immobilization and solid-state cultivation［J］.World Journal of Microbiology and Biotechnology，2004，20(3):257－263.

［11］ Chakraborty S，Khopade A，Kokare C，et al.Isolation and characterization of novel α-amylase from marine Streptomyces sp.D1［J］.Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic，2009，58(1/4):17－23.

［12］ 謝晨昭，楊毅玲，李磊，等.拮抗放線菌B1 菌株鑒定及其防治番茄灰霉病的初步研究［J］.植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2008，35(4):300－306.

［13］ 儲(chǔ)慧清，方敦煌，孔光輝，等.拮抗球胞鏈霉菌AM6 代謝產(chǎn)物防治煙草赤星病的田間效果測(cè)定［J］.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，19(1):4－6，23.

［14］ Jain P K，Jain P C.Isolation，characterization and antifungal activity of Streptomyces sampsonii GS 1322［J］.Indian Journal of Experimental Biology，2007，45(2):203－206.

［15］ 吳浩瑄，任大明，陳紅漫，等.大孔吸附樹脂對(duì)桑氏鏈霉菌HP－47 抗真菌活性物質(zhì)的吸附工藝［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(4):117－120.

［16］ Chen Chunti，Huang Chienjui，Wang Yihuei，et al.Two-step purification of Bacillus thuringiensis chitinase A1 expressed in Escherichia coli periplasm［J］.Protein Expression and Purification，2004，37(1):27－31.

［17］ 沈萍，陳向東.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)［M］.4 版.北京:高等教育出版社，2007:29－31.

［18］ Cao L，Qiu Z，You J，et al.Isolation and characterization of endophytic Streptomyces strains from surface-sterilized tomato (Lycopersicon esculentum)roots［J］.Letters in Applied Microbiology，2004，39(5):425－430.

［19］ 姜云，黃麗麗，陳長(zhǎng)卿，等.一株拮抗番茄葉霉病菌的放線菌篩選、鑒定及發(fā)酵條件研究［J］.微生物學(xué)報(bào)，2007，47(4):622－627.

［20］ 康振生.植物病原真菌的超微結(jié)構(gòu)［M］.北京:中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社，1996:1－29.

［21］ 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所放線菌分類組.鏈霉菌鑒定手冊(cè)［M］.北京:科學(xué)出版社，1975:13－15.

［22］ 徐麗華，李文均，劉志恒，等.放線菌系統(tǒng)學(xué):原理、方法及實(shí)踐［M］.北京:科學(xué)出版社，2007:59－62.

［23］ 查嶺生，胡鵬，吳曉敏，等.DNS 法測(cè)定植物組織中還原糖含量實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)［J］.安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2013，19(11):16，26.

［24］ 張海濤，王婷，田囡，等.幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌篩選鑒定及產(chǎn)酶性能研究［J］.中國(guó)生物工程雜志，2010，30(8):82－87.

［25］ 布坎南R E，吉本斯N E.伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)［M］.8 版.中國(guó)科學(xué)院微生物研究所《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》翻譯組，譯.北京:科學(xué)出版社，1984.

［26］ 賀春玲.長(zhǎng)木蜂蜂糧防腐機(jī)理研究［D］.南京:南京林業(yè)大學(xué)，2009.

［27］ 王治偉，劉志敏.微生物幾丁質(zhì)酶研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)通訊，2006，17(3):439－442.

［28］ 楊春林，席亞東，謝華蓉，等.哈茨木霉Th－30 幾丁質(zhì)酶的生產(chǎn)條件及對(duì)灰霉病菌的拮抗作用［J］.植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2009，36 (4):295－300.

［29］ 孫慎俠，付昌斌，倫永志，等.芽孢桿菌菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶發(fā)酵條件的研究［J］.中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2003，15(3):144－146.

［30］ St Leger R J，Joshi L，Roberts D.Ambient pH is a major determinant in the expression of cuticle-degrading enzymes and hydrophobin by Metarhizium anisopliae［J］.Applied and Environmental Microbiology，1998，64(2):709－713.

［31］ 張燦，黃德智，李豐碩，等.海洋產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株的篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化［J］.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，34(2):141－146.

［32］ 楊紹青，張舒平，閆巧娟，等.高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶高溫紫鏈霉菌的篩選和發(fā)酵條件優(yōu)化［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，18(2):167－173.

［33］ 鄧紅梅，畢方鋮，葉炬斌，等.幾丁質(zhì)酶高產(chǎn)菌的篩選及其產(chǎn)酶條件的優(yōu)化研究［J］.化學(xué)與生物工程，2010，27(5):62－65.