劉娟趙玲玲宋來慶姜中武,2*

1）山東省煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院·265500 2）煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

蘋果銹果類病毒山東文登峰山分離物的克隆

劉娟1趙玲玲1宋來慶1姜中武1,2*

1）山東省煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院·265500 2）煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

蘋果銹果病又名花臉病或裂果病，是嚴(yán)重影響蘋果生產(chǎn)的主要病毒病之一。廣泛分布于東北、西北、華北各蘋果產(chǎn)區(qū)，目前仍有擴(kuò)大蔓延趨勢(shì)。其病原物為蘋果銹果類病毒（App1e scar skin viroid，ASSVd），主要侵染蘋果和梨，最新研究發(fā)現(xiàn)還可侵染桃、杏、櫻桃核果類果樹。感病蘋果因品種和環(huán)境條件的變化果實(shí)表現(xiàn)為5種病狀：銹果型、花臉型、銹果-花臉型、環(huán)斑型和綠點(diǎn)型，發(fā)病較重的果實(shí)發(fā)生畸形龜裂，大大降低果品的食用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。對(duì)文登峰山地區(qū)富士蘋果進(jìn)行ASSVd擴(kuò)增和克隆，以期明確ASSVd在文登地區(qū)富士蘋果上的變異情況。

1 材料和方法

1.1 材料

2013年5月在文登峰山采集4株富士蘋果的嫩葉進(jìn)行ASSVd擴(kuò)增，樣品編號(hào)分別為D1、D2、D3、D4。

RNA提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo公司；Taq DNA聚合酶（附10×Buffer，25 mmo1/L）、PMD18-T購自寶生物工程（大連）有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自TIANGEN生化科技有限公司；大腸桿菌DH-5α為本實(shí)驗(yàn)室保存菌株。

參閱Genebank中NC-001340序列設(shè)計(jì)特異引物：

反向引物：5′-CCGGCCTTCGTCGACGACGA-3′

正向引物：5′-TGAGAAAGGAGCTGCCAGCAC-3′用于擴(kuò)增ASSVD的全長核苷酸序列，目的片段大小約為330 bp，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方法

總RNA提取：采用北京艾德萊公司的RNA提取試劑盒（型號(hào)RN09）提取葉片總RNA，溶解于40 μL ddH2O中，貯存于-70℃冰箱中備用。

RT-PCR體系：反轉(zhuǎn)錄過程：參照Thermo反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行。PCR擴(kuò)增體系：10× Buffer 2.5 μL、dNTPs 2 μL、Mg2＋2.0 μL、正反向引物各1 μL(10 umo1/L)、CDNA 1 μL、TaqE 0.15 μL，總體積25 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性45 s，58℃退后45 s，72℃延伸60 s，35次循環(huán)；72℃延伸10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。

克隆測序：按照TIAN ge1 MidiPurification Kit說明書回收DNA目的片段，連接到pMD18-T載體上。取5 μL上述純化后的目的片段和pMD18-T克隆載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑取白色菌落進(jìn)行PCR陽性克隆篩選。由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。

將測序所得序列在GenBank中BLAST，然后用DNAMAN進(jìn)行序列比對(duì)。

2 結(jié)果分析

2.1 ASSVd的RT-PCR檢測

以病樣中提取的總RNA為模板，利用設(shè)計(jì)好的引物進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，擴(kuò)增得到大小約為330 bp的特異帶，與目的片段大小一致（圖1）。

2.2 變體序列比對(duì)

每個(gè)樣品選取3個(gè)陽性克隆進(jìn)行測序，將測序結(jié)果在GenBank中BLAST，確定為ASSVd，并獲得5條ASSVd變體，以WS1～WS5表示，大小為330 bp、332 bp、333 bp、355 bp、358 bp。使用DNAMAN進(jìn)行序列比對(duì)（圖2）。序列比對(duì)結(jié)果中可以得出，5條變體的差異位點(diǎn)主要發(fā)生在232位點(diǎn)以后（WS1、WS2、WS3）或257位點(diǎn)以后（WS4、WS5）；WS4、WS5分別在124～148和124～151有連續(xù)片段插入。

3 討論

目前，蘋果銹果病的主要傳播途徑有帶病枝條嫁接傳播、修剪工具造成的污染傳播、種子傳播等3種。尚無有效的藥物防止該病的發(fā)生，因而防治該病應(yīng)以預(yù)防為主?？蓮囊韵聨讉€(gè)方面預(yù)防該病發(fā)生：建立新蘋果園時(shí)應(yīng)遠(yuǎn)離梨園150 m以上，避免與梨樹混栽；嚴(yán)格選用無毒接穗和砧木，培育無病毒苗木；不用修剪過病樹的剪、鋸修剪健樹。

通過研究ASSVd的變異，可為該病的防治、流行規(guī)律的判斷以及分子變異研究提供理論依據(jù)。本試驗(yàn)從文登的4個(gè)富士樣品中，獲得5條不同于Genbank中已登錄的ASSVd新序列，并且5條變體的核苷酸序列存在較大差異，有關(guān)變體的致病性或毒性需要近一步研究。

泰山學(xué)者種業(yè)計(jì)劃項(xiàng)目，國家現(xiàn)代蘋果產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)支持項(xiàng)目（CARS-28）

*責(zé)任作者,E-mai1:jiangzhongwu@163.com