姚文健，白 玉，趙寶生△

（1．新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院胸外科，河南新鄉(xiāng)453100；2．新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，河南新鄉(xiāng)453003）

腫瘤是當(dāng)前威脅人類生命最嚴(yán)重的疾病之一，每年死于腫瘤的人數(shù)以百萬計(jì)，腫瘤的防治研究，已成為醫(yī)學(xué)研究中的重要課題。在動(dòng)物體內(nèi)建立人類疾病模型可以更好地模擬活體狀態(tài)下疾病的特征，為疾病病因研究及治療提供實(shí)驗(yàn)材料。1969年Ryaaid首次成功地將人類腫瘤移植于無胸腺裸小鼠，這為異種動(dòng)物腫瘤移植開辟了新局面。由于裸鼠缺乏T淋巴細(xì)胞功能，所以是極為理想的腫瘤移植模型材料［1］。我國在這方面已經(jīng)做了不少探索，成功地將大腸癌［2］、乳腺癌［3］、肺癌［4］等移植于裸鼠。但關(guān)于食管癌裸鼠皮下移植尤其是原位移植模型的報(bào)道較少，本實(shí)驗(yàn)采用將人食管癌組織塊接種于裸鼠體內(nèi)的方法，觀察其生長(zhǎng)特征，初步建立了人食管癌裸鼠皮下移植及原位移植模型，為食管癌的研究提供了重要的實(shí)驗(yàn)工具。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 食管癌組織來源 食管癌組織來源于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院胸外科的1例食管癌患者手術(shù)切除標(biāo)本，病理診斷為低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性食管鱗癌組織，且術(shù)前未進(jìn)行放化療。

1．1．2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)所用的BALB／C裸鼠由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，3～4周齡，體質(zhì)量16～22 g，雌雄均可，隨機(jī)取用。裸鼠在恒溫（25～27℃）、恒濕（40%～50%）、無特殊病原菌級(jí)飼養(yǎng)室條件下飼養(yǎng)。動(dòng)物先放于有機(jī)玻璃盒內(nèi)，再置于超凈生物層流架內(nèi)，每個(gè)飼養(yǎng)盒內(nèi)飼養(yǎng)5～6只裸鼠。籠具、墊料、飼料、飲水均經(jīng)高壓蒸汽滅菌。所有實(shí)驗(yàn)程序均嚴(yán)格按無菌操作規(guī)程進(jìn)行。

1．2 方法

1．2．1 腫瘤手術(shù)標(biāo)本的移植 手術(shù)切除標(biāo)本離體后在無菌條件下去除包膜，清除標(biāo)本周圍的纖維組織及壞死部分，用含有青霉素／鏈霉素雙抗（終濃度為100 IU／mL）及10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液反復(fù)沖洗后，取新鮮的癌組織用彎剪剪成約1 mm3組織碎塊。裸鼠經(jīng)0．5%戊巴比妥鈉（30 mg／kg）腹腔注射全身麻醉。取2粒組織碎塊包埋于裸鼠右腹部皮下，共10例，5／0絲線縫皮，繼續(xù)飼養(yǎng)觀察，取原代移植成功且腫瘤生長(zhǎng)良好的裸鼠1只，處死后進(jìn)行鼠間傳代，連續(xù)傳代3次，每代10只，觀察成瘤率。

1．2．2 裸鼠皮下移植 取10例裸鼠，全身麻醉后取傳3代后移植瘤移植于裸鼠皮下，移植方法同上。術(shù)后繼續(xù)飼養(yǎng)，每周觀察2次。裸鼠飼養(yǎng)至自然死亡或?yàn)l臨死亡狀態(tài)下處死。觀察移植瘤成瘤率、大體及組織形態(tài)、腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移情況。

1．2．3 裸鼠食管黏膜下移植 取10例裸鼠，全身麻醉后取腹正中線切口開腹，在手術(shù)顯微鏡下游離食管下段。做3 mm切口深達(dá)黏膜下層，經(jīng)切口將2粒1 mm3傳代后瘤塊以10／0無損傷縫合線固定于食管壁黏膜下層。以7／0絲線縫合腹膜，5／0絲線縫皮。荷瘤裸鼠飼養(yǎng)至自然死亡或?yàn)l死狀態(tài)下處死，觀察移植瘤成瘤率、大體及組織形態(tài)、腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移情況。

1．2．4 病理學(xué)檢測(cè) 上述移植瘤標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察。

2 結(jié) 果

2．1 裸鼠移植瘤成瘤率 人食管癌組織移植于10只裸鼠皮下，原代成瘤1只，成瘤率10%（1／10），傳代3次后，成瘤5只，成瘤率50%（5／10）。

2．2 裸鼠皮下移植模型的觀察 皮下移植的10例裸鼠共有6只形成肉眼可見腫瘤，成瘤率60%，移植瘤呈膨脹性生長(zhǎng)，圓形或橢圓形，灰白色，邊界清楚，有纖維包膜包裹。光鏡下觀察移植瘤與人原發(fā)食管癌組織形態(tài)特點(diǎn)基本相同，為低分化鱗狀細(xì)胞癌。細(xì)胞呈片狀或條索狀排列，細(xì)胞大小不同、形態(tài)各異，核漿比增加，核分裂像多見，見圖1 A。腫瘤周圍淋巴結(jié)、肝、肺未見癌轉(zhuǎn)移。

2．3 裸鼠原位移植模型的觀察 食管黏膜下移植的10例裸鼠尸檢可見8例成瘤，成瘤率80%。原位腫瘤肉眼觀見圖1B。光鏡下觀察移植瘤與人原發(fā)食管癌組織形態(tài)特點(diǎn)基本相同，鏡下觀見圖1C。8例均發(fā)生食管周圍淋巴結(jié)癌轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率100．0%（8／8），見圖1D；有3例發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率37．5%（3／8）見圖1E；有2例發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率25．0%（2／8），見圖1F。

圖1 病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

腫瘤動(dòng)物模型是研究腫瘤生物學(xué)行為及腫瘤治療的主要工具之一，廣泛應(yīng)用于腫瘤生長(zhǎng)、腫瘤免疫、抗腫瘤藥物篩選等方面的研究［5］。應(yīng)用裸鼠建立的移植性腫瘤模型是目前應(yīng)用最多的動(dòng)物模型，他是將外源性腫瘤細(xì)胞或組織移植到裸鼠內(nèi)生長(zhǎng)并形成腫瘤，其中以皮下移植模型和原位移植模型最為常見。

本研究采用瘤組織塊接種法，這種方法能較好地保持腫瘤細(xì)胞形態(tài)，接種后成瘤率高。在裸鼠皮下傳代3次的目的是通過反復(fù)傳代可以對(duì)腫瘤細(xì)胞起到篩選作用，提高成瘤率。與直接移植患者腫瘤標(biāo)本相比，經(jīng)過傳代后，移植瘤處于無菌狀態(tài)，用傳代后的移植瘤建模，瘤體更易存活，也有較高的成瘤率［6］。本次研究也證實(shí)了這一點(diǎn)。

傳統(tǒng)的移植途徑是將腫瘤細(xì)胞或組織進(jìn)行皮下移植。皮下移植模型具有操作簡(jiǎn)單、便于觀察的優(yōu)點(diǎn)，可以部分模擬人惡性腫瘤的生物學(xué)特征，但皮下移植屬于異位移植，脫離了起源組織器官的微環(huán)境，在實(shí)驗(yàn)中移植瘤的一些行為常不同于原先患者身上惡性腫瘤的生物學(xué)行為［7］。本次研究發(fā)現(xiàn)，皮下移植瘤雖與人原發(fā)食管癌組織相同，都是低分化鱗狀細(xì)胞癌，但移植瘤被纖維結(jié)締組織囊包繞，呈局限性生長(zhǎng)，未見局部擴(kuò)散和遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移，原因考慮是結(jié)締組織包繞干擾了新生血管的生長(zhǎng)和長(zhǎng)入［8］。故皮下移植模型難以用于腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的研究。

原位移植，是將人類腫瘤細(xì)胞或組織移植到免疫缺陷動(dòng)物相當(dāng)于人類腫瘤原發(fā)部位組織器官內(nèi)。與皮下移植相比，原位移植具有豐富的自然血管，可保證瘤體獲得充分的營(yíng)養(yǎng)，且腫瘤細(xì)胞具有親器官性，容易在與母體腫瘤相同的器官上滯留、浸潤(rùn)或擴(kuò)散，更能模擬食管癌侵襲、轉(zhuǎn)移的特征［9］。本次研究發(fā)現(xiàn)，食管黏膜下移植瘤的成瘤率要高于皮下移植，為低分化鱗狀細(xì)胞癌，沒有包膜，呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，可見廣泛淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肝肺轉(zhuǎn)移?？梢?，原位移植為人類惡性腫瘤的研究，尤其是與侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)的研究提供了更為適宜的動(dòng)物模型。

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