徐令清，汪 峰，侯紅艷，劉彩林，歐國(guó)平，孫明月，孫自鏞

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，武漢430030）

銅綠假單胞菌（PA）是一種無(wú)處不在的細(xì)菌，井水、河水、生牛奶、凍魚(yú)、未經(jīng)處理的污水、人畜的糞便及醫(yī)院環(huán)境中都能分離到PA，能夠引起菌血癥、創(chuàng)傷后傷口感染、肺炎、腦膜炎、附睪炎、眼部感染、乳突炎等。但有報(bào)道稱(chēng)，在感染PA的囊性纖維變性患者中，極少有真菌感染的發(fā)生，提示PA可能具有抗真菌的活性。

1 材料與方法

1.1 材料 2012年5月至2012年9月從本院住院部及門(mén)診患者送檢標(biāo)本中共分離出不重復(fù)的PA 24株，經(jīng)革蘭染色、氧化酶實(shí)驗(yàn)、Vitek-2全自動(dòng)微生物鑒定儀（法國(guó)梅里埃公司）或API 20NE（法國(guó)梅里埃公司）對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。大腸埃希菌（EC）ATCC23922、肺炎克雷伯菌（KP）ATCC700603及 PA ATCC25923為質(zhì)控菌株。真菌質(zhì)控菌株為白色念珠菌（CA）ATCC90028、熱帶念珠菌（CT）、光滑念珠菌（CG）、近平滑念珠菌（CP）、克柔念珠菌（CK）、葡萄牙念珠菌（MSB）各5株，均分離自臨床標(biāo)本。由科瑪嘉平板及API-20CAUX酵母樣真菌鑒定試條（法國(guó)梅里埃公司）對(duì)臨床分離的真菌進(jìn)行鑒定。

1.2 方法

1.2.1 紙片法 在沙堡羅培養(yǎng)基上涂布2個(gè)麥?zhǔn)蠞岫鹊恼婢?，然后貼上無(wú)菌濾紙片（直徑6mm），將PA制成0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?，吸?μL均勻涂在濾紙片上，孵育48h后，觀察結(jié)果。

1.2.2 十字交叉劃線法 24株臨床PA菌株與3種質(zhì)控菌株分別培養(yǎng)24h后用0.9%生理鹽水制成菌懸液，取30μL菌懸液至沙堡羅培養(yǎng)基上，用無(wú)菌棉簽沿任意直徑劃寬為1cm的劃痕，然后放至37℃培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。用無(wú)菌刀片移除沙堡羅培養(yǎng)基上的菌苔，取5cm的無(wú)菌濾紙浸滿(mǎn)三氯甲烷后放入一金屬小盒子中，將移除菌苔的沙堡羅培養(yǎng)基生長(zhǎng)面朝向?yàn)V紙放好，三氯甲烷的蒸汽會(huì)殺滅殘余的細(xì)菌，30min后將平板暴露于生物安全柜中抽吸幾分鐘，讓三氯甲烷揮發(fā)掉。將上述真菌在沙堡羅培養(yǎng)基上培養(yǎng)48h后，制成1×106／mL菌懸液，棉簽醮取并沿著三氯甲烷處理過(guò)的菌痕作垂直相交劃線。將平板30℃孵育24h后，觀察結(jié)果。

24株P(guān)A中每一株都與6種念珠菌中的每一株進(jìn)行測(cè)試。平板按照以下規(guī)則判讀，完全抑制真菌生長(zhǎng)記作：＋；部分抑制真菌生長(zhǎng)記作：±；不能抑制真菌生長(zhǎng)記作：-。

1.2.3 LB液體培養(yǎng)基中共孵育實(shí)驗(yàn) 無(wú)菌EP管中裝入1 mL LB液體培養(yǎng)基，分別將上述紙片法中的每一株P(guān)A和每一株真菌菌懸液各50μL加入EP管中，100r／min離心，30℃搖菌24h，取混懸液置顯微鏡下觀察。另取50μL真菌菌懸液放入1mL LB液體培養(yǎng)基中作對(duì)照。

1.2.4 十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析菌體蛋白差異 將完全有抑制作用的6號(hào)與15號(hào)PA菌株及完全無(wú)抑制作用的1號(hào)與22號(hào)PA菌株作SDS-PAGE蛋白分析。在LB液體培養(yǎng)基中150r／min離心，35℃搖菌24 h，取沉淀及上清液分別煮沸10min后直接進(jìn)行SDS-PAGE電泳，脫色后觀察結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 紙片法結(jié)果 在24株P(guān)A與30株真菌的紙片法試驗(yàn)中，24株P(guān)A菌株中6、15、16、17、18、19、20號(hào)菌株對(duì)6種真菌的30株菌株均出現(xiàn)了明顯的抑菌環(huán)，抑菌環(huán)直徑非常接近，3、9、23號(hào)菌株有抑菌環(huán)但不明顯，其余菌株及質(zhì)控菌株均無(wú)抑菌環(huán)出現(xiàn)，見(jiàn)圖1。

圖1 紙片法實(shí)驗(yàn)

2.2 十字交叉劃線實(shí)驗(yàn)結(jié)果 部分 PA（6、15、16、17、18、19、20號(hào)菌株）出現(xiàn)明顯的抑制現(xiàn)象，部分PA菌株（3、9、23號(hào)菌株）有輕微抑制作用，其余菌株及質(zhì)控菌株均未出現(xiàn)抑制現(xiàn)象，這與紙片法結(jié)果一致，見(jiàn)圖2。24株P(guān)A對(duì)各種真菌的抑制活性情況見(jiàn)表1。

2.3 LB液體培養(yǎng)基中共孵育試驗(yàn)結(jié)果 有抑制作用的PA菌株（6、15號(hào)菌株）與真菌共培養(yǎng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)真菌菌絲顯著減少，而無(wú)抑制作用的PA菌株（1、22號(hào)菌株）共培養(yǎng)后菌絲數(shù)量與真菌單獨(dú)培養(yǎng)相近，見(jiàn)圖3。

2.4 SDS-PAGE分析菌株蛋白差異 幾株P(guān)A的共同點(diǎn)是在35×103處均有一明顯條帶，但其他條帶存在明顯差異：無(wú)抑制作用的1、22號(hào)PA菌株只在35×103處有一明顯條帶，有明顯抑制效果的6、15號(hào)PA菌株在38、35、27、24×103處均有較清晰的條帶，即6、15號(hào)PA菌株要比1、22號(hào)PA菌株多出好幾個(gè)條帶，見(jiàn)圖4。

圖2 十字交叉劃線實(shí)驗(yàn)

圖3 LB液體培養(yǎng)基中共孵育實(shí)驗(yàn)（普通光學(xué)顯微鏡×400）

表1 PA菌株抗真菌活性

圖4 SDS-PAGE電泳圖

3 討 論

PA是廣泛存在于水、土壤、動(dòng)物體內(nèi)的一種條件致病菌，以往研究只關(guān)注PA作為致病菌在臨床上能引起一些感染性疾病，但在環(huán)境與個(gè)體中PA常會(huì)與周?chē)钠渌⑸锵嗷プ饔?，抑制甚至殺死其他微生物?/p>

已有資料表明，PA的二代產(chǎn)物，如植物毒素、黏液、抗真菌化合物的產(chǎn)生，對(duì)自然環(huán)境中的其他微生物有明顯的選擇作用。Hogan等［1］報(bào)道稱(chēng)，PA能在CA菌絲上形成厚厚的生物被膜從而殺死CA，表明PA影響的是CA的菌絲形成，而不是孢子形成，因?yàn)樗麄兊募?xì)胞壁存在差異；另外一些PA的毒力因子（如四型菌毛、磷脂酶C、吩嗪等）同樣也與殺死CA的菌絲有關(guān)。Kaleli等［2］報(bào)道PA對(duì)CA、CP、CK及CT的抑制率在使用血平板和沙堡羅培養(yǎng)基時(shí)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

另有一些研究表明，PA和CA在人體內(nèi)相互作用。在囊胞性纖維癥中有超過(guò)80%的患者會(huì)伴有PA感染，而廣譜抗菌藥物和類(lèi)固醇激素的使用也會(huì)導(dǎo)致煙曲霉和CA的感染。Hughes等［3］發(fā)現(xiàn)在感染PA的囊胞性纖維癥患者中只有10%CA皮膚試驗(yàn)陽(yáng)性，而未感染PA的囊胞性纖維癥患者中則有30%的陽(yáng)性率，表明PA產(chǎn)生了一些抗真菌的物質(zhì)防止念珠菌感染。另外也有報(bào)道稱(chēng)，PA可以抑制隱球菌的生長(zhǎng)［4-5］。而到目前為止，還沒(méi)有在囊泡性纖維癥患者體內(nèi)分離出隱球菌的報(bào)道，隱球菌與PA都是常見(jiàn)的肺部致病菌，如果這二者不能同時(shí)定植，那么有可能是PA抑制了隱球菌生長(zhǎng)，綠膿菌素和喹諾酮系統(tǒng)可能是預(yù)防囊泡性纖維癥患者肺部感染隱球菌的主要原因。

PA能產(chǎn)生多種細(xì)胞間因子如群體感應(yīng)系統(tǒng)絲氨酸內(nèi)酯、鼠李糖脂、氧化還原吩嗪、胰蛋白酶E、磷脂酶C、胞外多糖、胞藻酸鹽等。Hogan等［6］發(fā)現(xiàn)PA能產(chǎn)生一種絲氨酸內(nèi)酯，是一種細(xì)胞間信號(hào)分子，能充分抑制CA菌絲形成。

Grillot等［7］通過(guò)PA與酵母菌純培養(yǎng)及混合培養(yǎng)來(lái)調(diào)查PA與酵母菌間的相互作用，報(bào)道顯示所有被測(cè)試酵母菌在血平板和在與細(xì)菌的過(guò)濾液中共同培養(yǎng)時(shí)均受到抑制。Gupta等［8］報(bào)道有59%的念珠菌在燒傷時(shí)與細(xì)菌混合感染。然而，在有PA存在時(shí)，真菌的定植明顯受到抑制。這也表明PA能殺死或抑制致病性真菌的生長(zhǎng)。Kerr等［9］報(bào)道PA臨床菌株的主要抗真菌活性是通過(guò)產(chǎn)生氧化還原色素、綠膿菌素等來(lái)抑制CA和煙曲霉的。綠膿菌素能降低人類(lèi)上皮細(xì)胞中的環(huán)磷酸腺苷和三磷酸腺苷［10-14］。

本次研究發(fā)現(xiàn)，部分PA對(duì)真菌有顯著的抑制效果，部分PA有一定抑制作用，而另外一些則對(duì)真菌完全沒(méi)有抑制作用。如6號(hào)PA菌株出現(xiàn)了非常明顯的抑菌環(huán)（圖1），通過(guò)十字交叉劃線及共培養(yǎng)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，6號(hào)及15號(hào)PA菌株的抑制作用非常強(qiáng)，通過(guò)SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)這兩株菌與1號(hào)及22號(hào)PA菌株的蛋白條帶比較差異明顯，比后者多出2～3個(gè)條帶（圖4），多出的條帶是否與其抑制真菌的活性存在相關(guān)性，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，PA在體內(nèi)和體外都具有強(qiáng)大的抗真菌活性，原因可能是他能產(chǎn)生綠膿菌素形成生物被膜，及產(chǎn)生多種細(xì)胞間因子如群體感應(yīng)系統(tǒng)絲氨酸內(nèi)酯、鼠李糖脂、氧化還原吩嗪、胰蛋白酶E、磷脂酶C等及分泌各種蛋白類(lèi)物質(zhì)抑制真菌菌絲從而抑制真菌生長(zhǎng)。作者將進(jìn)一步分離和純化這些物質(zhì)，作進(jìn)一步研究。

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