茍冶然 綜述 周建中 審校

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，重慶 400016)

葡激酶(staphylokinase，SAK)是一種具有極大臨床應(yīng)用前景的新型溶栓制劑，不僅具有高效的纖溶活性及對(duì)纖維蛋白特異的識(shí)別作用，而且在溶栓過(guò)程中血纖維蛋白原降解少，不會(huì)引起全身纖溶亢進(jìn)。但作為一種葡萄球菌來(lái)源的異體蛋白，進(jìn)入機(jī)體后容易誘發(fā)免疫反應(yīng)，尤其是重復(fù)使用時(shí)其誘導(dǎo)的中和抗體對(duì)療效(溶栓效果)有很大影響，從而限制了其在日常的預(yù)防和恢復(fù)治療的應(yīng)用。隨著生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)使葡激酶基因重組從而降低其免疫原性成為目前研究的熱點(diǎn)?，F(xiàn)就葡激酶的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、溶栓活性、機(jī)理及免疫原性改造等方面的研究進(jìn)展做一系統(tǒng)綜述。

1 葡激酶的分子結(jié)構(gòu)

天然葡激酶是金黃色葡萄球菌溶原性噬菌體合成的一種胞外蛋白質(zhì)。Sako 等［1-2］從金黃色葡萄球菌ΦC 基因組克隆出SAK 基因并確定了其序列。成熟的SAK 是由136 個(gè)氨基酸殘基組成的無(wú)二硫鍵連接的單鏈多肽結(jié)構(gòu)，相對(duì)分子量為15.5 kD(≈1.55 ×104)，主要為疏水氨基酸，其中包括45 個(gè)帶電氨基酸殘基，不含胱氨酸及糖基，決定活性的氨基酸主要位于親水一側(cè)。通過(guò)對(duì)SAK 晶體結(jié)構(gòu)解析發(fā)現(xiàn)，葡激酶分子空間構(gòu)象呈一緊湊的橢球體，僅包含一個(gè)結(jié)構(gòu)域——即由5 個(gè)β 折疊堆積于由12 個(gè)殘基構(gòu)成的α螺旋上形成的致密體［3］，當(dāng)α 螺旋結(jié)構(gòu)反向平行時(shí)可結(jié)合在一起促使SAK 單體形成二聚體［4］。研究發(fā)現(xiàn)，SAK 分子N-端前16 位氨基酸是位于α 螺旋與β 折疊所形成的致密體之外的無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，其中第11～16 位帶正電的Lys 殘基對(duì)結(jié)合及活化纖溶酶原有重要作用［5］。此外，序列中第20～77 位氨基酸形成的絲氨酸蛋白酶功能區(qū)域可能與葡激酶N-端融合蛋白的自動(dòng)裂解有關(guān)［6］。

2 葡激酶的溶栓特點(diǎn)

葡激酶最早于1948 年被Lack 發(fā)現(xiàn)并證實(shí)具有纖溶酶原激活作用。近年來(lái)隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，葡激酶及各種衍生物成功在大腸桿菌中高效表達(dá)。大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)通過(guò)原核表達(dá)體系獲得的SAK 具有生產(chǎn)成本低，纖溶能力及血管再通率與內(nèi)生組織型纖溶酶原激活劑(tissue plasminogen activator，tPA)相當(dāng)，優(yōu)于尿激酶(urokinase，UK)，且具有更高的纖維蛋白專一性等優(yōu)點(diǎn)［7］。這可能與其獨(dú)特的溶栓機(jī)理有關(guān)。

葡激酶本身沒(méi)有蛋白酶活性，是一種“間接型”的纖溶酶原激活劑，與t-PA、UK 等不同，不能直接作用于纖溶酶原Arg561-Val562 位肽健促使纖溶酶原(plasminogen，Plg)轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶(plasmin，Plm)，而是作為一種輔助因子，以1∶1 的比例結(jié)合到纖溶酶原的絲氨酸蛋白酶區(qū)，在血栓表面痕量纖溶酶的作用下切斷纖溶酶原的Arg561-Val562，暴露出活性位點(diǎn)［8］。該過(guò)程中葡激酶的空間構(gòu)象也相應(yīng)發(fā)生改變，Lys10-Lys11 被選擇性切斷，40～46 位氨基酸殘基更加暴露，促進(jìn)葡激酶與纖溶酶緊密結(jié)合［9］。葡激酶-纖溶酶復(fù)合物是高效的纖溶酶原激活劑，激活游離的纖溶酶原形成纖溶酶，纖溶酶上的賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)與血栓中的纖維蛋白結(jié)合，催化纖維蛋白降解，從而溶解血栓，恢復(fù)血液循環(huán)，同時(shí)纖溶酶還可以溶解一些凝血因子。

血漿中，α2-抗纖溶酶可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合到葡激酶-纖溶酶復(fù)合物中的賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)從而抑制其溶栓活性。其抑制作用呈劑量相關(guān)性，當(dāng)復(fù)合物中Lys 結(jié)合位點(diǎn)被纖維蛋白占據(jù)后，α2-抗纖溶酶的抑制率會(huì)下降100 倍［10］。有效的纖溶酶原活化作用僅發(fā)生在血纖維蛋白表面，是因?yàn)橥暾难“灞砻婺転槿芙饫w維蛋白提供催化場(chǎng)所。如果沒(méi)有纖維蛋白存在，復(fù)合物很快被α2-抗纖溶酶中和，然后被巨噬細(xì)胞吞噬，避免溶血形成。研究發(fā)現(xiàn)，SAK 肽鏈11 位上的賴氨酸和26 位上的甲硫氨酸殘基是激活纖溶酶原的重要部位，若將其水解或替換為其他氨基酸，SAK 將失去活性［11］。同時(shí)，有報(bào)道發(fā)現(xiàn)磷酸丙糖異構(gòu)酶也會(huì)引起SAK 的纖溶酶原激活作用大大降低［12］。

3 葡激酶免疫原性的研究

葡激酶是一種極具研發(fā)潛力的溶栓制劑，具有如下一些優(yōu)點(diǎn):(1)分子量小、穿透性能好、溶栓活性高;(2)葡激酶進(jìn)入體內(nèi)后迅速被肌肉和腎臟攝取，不分布于肝臟，不會(huì)引起纖溶酶原的明顯降解;(3)高度纖維蛋白特異性，不會(huì)引起全身纖溶亢進(jìn)，溶栓后出血并發(fā)癥少;(4)高血栓選擇性，對(duì)陳舊性血栓和富含血小板的血栓，尤其是腦動(dòng)脈血栓和肢體動(dòng)靜脈血栓的溶解作用突出;(5)在原核及真核系統(tǒng)中均能表達(dá)，易大量制備，不含二硫鍵，易復(fù)性。但葡激酶作為一種異體蛋白，作用于人體有較強(qiáng)的抗原性，且血漿半衰期短，僅持續(xù)3 min 左右。雖然臨床試驗(yàn)中還未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)，然而80%以上的患者用藥后2 周，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生高滴度的IgG 中和抗體，且抗體水平可以維持半個(gè)月到1 年左右，嚴(yán)重影響了葡激酶的重復(fù)使用。為了降低葡激酶的免疫原性，使之更加適合臨床應(yīng)用，國(guó)內(nèi)外多個(gè)課題組通過(guò)定點(diǎn)突變、化學(xué)修飾及構(gòu)建融合蛋白等方法對(duì)葡激酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造研究，并且取得了一些成果。

3.1 表位研究與定點(diǎn)突變

抗原性取決于蛋白質(zhì)分子表面由15～22 個(gè)氨基酸殘基組成的抗原決定簇。近兩年的研究很大一部分集中于對(duì)葡激酶分子抗原決定簇的確定及改造，以期把葡激酶改造成為低免疫原性的高效溶栓制劑。

組成一個(gè)抗原決定簇的氨基酸在空間構(gòu)象上相鄰，而在一級(jí)結(jié)構(gòu)中往往不連續(xù)，且通常只有幾個(gè)氨基酸決定與抗體結(jié)合的活性。通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)及噬菌體展示抗原突變庫(kù)的負(fù)選技術(shù)發(fā)現(xiàn)［13］，葡激酶分子中存在3 個(gè)互不重疊的B 細(xì)胞抗原決定表位，其中抗原表位1 由第74，75，77 位氨基酸殘基構(gòu)成，抗原表位3 由第35，38，80，82 位氨基酸殘基構(gòu)成，抗原表位2 的氨基酸殘基還有待進(jìn)一步確定，推測(cè)與二聚體的形成有關(guān)。

Warmerdam 等［14］通過(guò)分析大量不同來(lái)源的葡激酶特異性T 細(xì)胞表位發(fā)現(xiàn)，葡激酶分子內(nèi)存在6 個(gè)不同的T 細(xì)胞抗原決定區(qū)域，其中C3 區(qū)(71～87 位氨基酸)是B 細(xì)胞抗原表位和T 細(xì)胞抗原表位非常集中的區(qū)域，可被90%病人特異性T 細(xì)胞識(shí)別。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)C3 區(qū)包含S1(72～82)和S2(75～85)兩個(gè)重疊的T 細(xì)胞表位序列，其中73，76 位氨基酸分別為兩個(gè)表位的關(guān)鍵氨基酸，若將C3 區(qū)的氨基酸序列替代突變?yōu)楸彼岷?，葡激酶突變體仍保留溶栓活性，但對(duì)C3 特異性T 細(xì)胞克隆無(wú)反應(yīng)。Xu 等［15］通過(guò)定點(diǎn)突變掉葡激酶的T 細(xì)胞和B 細(xì)胞抗原表位重疊的關(guān)鍵氨基酸Arg77 和Glu80，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該突變體免疫原性明顯降低，而其纖溶活性和催化效率則與r-葡激酶相當(dāng)?？乖砦坏陌l(fā)現(xiàn)，可能為葡激酶免疫原性的進(jìn)一步改造提供新的思路。

3.2 葡激酶結(jié)構(gòu)改造

目前，葡激酶結(jié)構(gòu)改造多以其空間結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能的關(guān)系為基礎(chǔ)，通過(guò)分子設(shè)計(jì)及其指導(dǎo)的特定的基因修飾，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)天然葡激酶的定向改造。

3.2.1 葡激酶的化學(xué)修飾

3.2.1.1 葡激酶的聚乙二醇修飾

聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)是一種巰基特異性修飾劑，是一種無(wú)毒、無(wú)免疫原性的水溶性高分子物質(zhì)，可以通過(guò)化學(xué)反應(yīng)與蛋白質(zhì)的非必須基團(tuán)共價(jià)結(jié)合。研究發(fā)現(xiàn)［16］，將葡激酶的特異性氨基酸定點(diǎn)突變?yōu)榘腚装彼岷笤俳?jīng)PEG 修飾，不僅能延長(zhǎng)藥物在血液中的循環(huán)半衰期，并通過(guò)遮蔽抗原決定簇來(lái)降低蛋白的免疫原性，且一般不會(huì)影響蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和生物活性，從而提高葡激酶的療效，減少毒副作用，為臨床應(yīng)用帶來(lái)了方便。此外，PEG 修飾可以使葡激酶分子量大大增加，增強(qiáng)其水溶性，增強(qiáng)抵抗蛋白酶水解的能力，并且降低腎臟對(duì)蛋白質(zhì)的排泄作用［17］。

但是，PEG 化修飾葡激酶降低免疫原性的同時(shí)，不可避免的會(huì)通過(guò)空間位阻的作用部分遮蔽葡激酶活性位點(diǎn)，影響其對(duì)纖溶酶原的結(jié)合及活化作用，目前的研究多集中在通過(guò)減小PEG 的分子量或者構(gòu)建葡激酶二聚體(PEG-dSAK)來(lái)降低PEG 化對(duì)溶栓活性的影響［18］。

3.2.1.2 葡激酶的聚乙烯醇修飾

聚乙烯醇(polyving akohol，PVA)作為添加劑，能夠防止溶菌酶在水/二氯甲烷面的變性，是一種被廣泛運(yùn)用于醫(yī)藥和食品工業(yè)的水溶性高分子聚合物。王改珍等［19］對(duì)PVA 與葡激酶形成的復(fù)合物中葡激酶酰胺I 帶定量分析發(fā)現(xiàn)，葡激酶分子中易導(dǎo)致蛋白變性的分子間折疊明顯減少，有利于增強(qiáng)葡激酶蛋白的穩(wěn)定性。

3.2.2 葡激酶的靶向性改造

生物靶向技術(shù)主要是通過(guò)受體與配體的特異性結(jié)合而發(fā)揮靶向定位作用，廣泛運(yùn)用于腫瘤治療的靶向給藥。近年來(lái)，為提高溶栓效果，防止再栓塞，靶向溶栓劑的研究引人注目。纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)g)和活化血小板膜糖蛋白(glycoprotein，GP)Ⅱb/Ⅲa 受體的特異性結(jié)合是生理性誘導(dǎo)血小板聚集的最終共同通道，在血栓形成中起著重要作用。含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列的物質(zhì)均可競(jìng)爭(zhēng)性地抑制Fg 和GPⅡb/Ⅲa 受體的結(jié)合，且具有對(duì)血栓部位血小板的趨向性，可以最直接、最完全地抑制活化血小板聚集，從而抑制血栓的形成。

RGD 序列有線狀和含二硫鍵的環(huán)狀兩種結(jié)構(gòu)，其中環(huán)狀RGD 序列比線性序列有著更強(qiáng)的GPⅡb/Ⅲa受體結(jié)合力和受體特異性，因此含RGD 序列藥物的研發(fā)都是基于環(huán)狀RGD 序列［20］。Ning 等［21］通過(guò)特異性位點(diǎn)突變，將構(gòu)建的低免疫原性葡激酶突變體mSAK(K130T、K135R)的35，36，37 位的氨基酸分別替換為R、G、D，得到了RGD-m 葡激酶(K130T、K135R)，不僅溶栓活性與野生型葡激酶相當(dāng)，而且還具有良好的抗血小板聚集效應(yīng)和低免疫原性。蘇曉明等［22］構(gòu)建的RGDS-葡激酶納米脂質(zhì)體及Jingfang等［23］構(gòu)建的葡激酶突變體MD2-葡激酶、MD4-葡激酶，均得到了類似的結(jié)論。推測(cè)突變體的抗血小板功能跟RGD 短肽序列能與Fg 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合GPⅡb/Ⅲa 受體，其羧基端的10 余個(gè)氨基酸是特異性結(jié)合并使凝血酶失活的關(guān)鍵區(qū)域，能使相鄰血小板之間失去了相互交聯(lián)的“橫橋”，從而阻止血小板的聚集有關(guān)。

臨床試驗(yàn)表明使用重組葡激酶后仍有一定的再梗塞率，其中血小板介導(dǎo)的動(dòng)脈血栓的形成是溶栓后再梗塞的主要原因，將RGD 序列導(dǎo)入溶栓藥物，所得的突變體具有溶栓、防栓的雙重功能［24］。

3.2.3 葡激酶融合蛋白的構(gòu)建

融合蛋白是指通過(guò)DNA 重組技術(shù)使兩個(gè)基因片段連接后的表達(dá)產(chǎn)物。研究證實(shí)［25］，利用基因融合構(gòu)建的融合蛋白一般均保留所構(gòu)成的酶分子各自的酶活性。因此，通過(guò)在葡激酶中融合其他功能的蛋白來(lái)提高葡激酶的溶栓活性及特異性，成為近年研究的熱點(diǎn)。

徐東崗等［26］通過(guò)基因工程方法構(gòu)建的葡激酶與P11 融合基因的表達(dá)產(chǎn)物，溶栓活性高，免疫原性低，加上半衰期延長(zhǎng)，不僅可以提高藥物的療效，還可以降低藥物成本和價(jià)格。其中，P11 又稱為S100A10，廣泛存在于人體內(nèi)，通常作為膜聯(lián)蛋白annexin11 異四聚體復(fù)合物的亞基調(diào)節(jié)血液纖溶系統(tǒng)，刺激組織型纖溶酶原激活因子。

Szemraj 等［27］通過(guò)基因重組技術(shù)構(gòu)建了一種新的葡激酶融合蛋白，葡激酶-RGD-K2-Hirul。該融合蛋白包括4 個(gè)部分:(1)葡激酶，高效溶栓作用;(2)RGD，抗血小板聚集;(3)K2，tPA 分子與纖維蛋白結(jié)合部位;(4)hirul，水蛭素的C 末端，天然抗凝小分子蛋白。在頸動(dòng)脈血栓動(dòng)物模型中，該融合蛋白在溶解血栓、開(kāi)通閉塞血管方面明顯強(qiáng)于野生型葡激酶，抗凝血酶的作用與水蛭素相當(dāng)并明顯延長(zhǎng)了激活的部分促凝血酶原時(shí)間(APTT)和凝血酶時(shí)間(PT)。Pulicherla等［28］構(gòu)建的融合蛋白葡激酶-RGD-Hirulog(SRH)，成功在大腸桿菌GJ1158 中誘導(dǎo)表達(dá)，純化后的蛋白通過(guò)驗(yàn)證也得到了類似的結(jié)論。

融合蛋白的構(gòu)建已在葡激酶的結(jié)構(gòu)改造中顯示出一定的優(yōu)勢(shì)，新的融合蛋白多能在保存天然葡激酶溶栓活性的基礎(chǔ)上增加抗凝、抗血小板聚集、防止血管再堵塞等功能。為葡激酶改造提供了新的研發(fā)方向。

4 展望

血栓性疾病是全球病死率和發(fā)病率均較高的疾病之一，特別是急性心肌梗死、腦血栓、肺靜脈栓塞等。血栓性疾病嚴(yán)重危害人類健康，每年都有數(shù)百萬(wàn)的人死于該疾病。血栓的形成減少或阻斷了重要臟器的血供，導(dǎo)致組織局部缺氧、細(xì)胞壞死以及臟器功能的喪失。溶栓治療因其方便、快捷、易于在基層醫(yī)院開(kāi)展等優(yōu)勢(shì)而逐漸成為血栓性疾病的主要治療手段。葡激酶以其高效的纖溶活性、特異的纖維蛋白選擇性得到了廣泛的關(guān)注和研究，但天然葡激酶進(jìn)入體內(nèi)后誘發(fā)的免疫反應(yīng)限制了其在臨床的應(yīng)用。隨著葡激酶晶體結(jié)構(gòu)的解析，人們得以進(jìn)一步分析其免疫原性與結(jié)構(gòu)的關(guān)系，進(jìn)而應(yīng)用生物工程技術(shù)對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，期望能夠在不影響其溶栓活性的前提下盡可能降低免疫原性。相信隨著人們對(duì)葡激酶免疫原性產(chǎn)生機(jī)制認(rèn)識(shí)的深入，一種低免疫原性的高效特異性溶栓劑——新型葡激酶突變體能夠在不久的將來(lái)為血栓性疾病患者帶來(lái)福音。

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