曹國珍，繆建順，張苗苗，王菊芳，李文建，陸棟*

（1.中國科學(xué)院近代物理研究所，甘肅蘭州730000；2.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅蘭州730000；3.甘肅省微生物資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730000）

分光光度法測定釀酒酵母細(xì)胞懸液濃度研究

曹國珍1，2，3，繆建順1，3，張苗苗1，3，王菊芳1，3，李文建1，3，陸棟1，3*

（1.中國科學(xué)院近代物理研究所，甘肅蘭州730000；2.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅蘭州730000；3.甘肅省微生物資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730000）

采用分光光度法測定釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）在不同生長條件、不同時(shí)間菌懸液OD600nm值，建立OD600nm在不同稀釋區(qū)間的分段回歸方程，利用OD600nm回歸值繪制生長曲線，對比平板菌落計(jì)數(shù)法測得的生長曲線，研究在對數(shù)期與穩(wěn)定期，OD600nm值與菌體數(shù)量以及稀釋倍數(shù)的關(guān)系。結(jié)果表明，稀釋前后OD600nm值在對應(yīng)區(qū)間內(nèi)呈線性關(guān)系，用OD600nm回歸值繪制的生長曲線沒有明顯的衰亡期，其主要是由于在對數(shù)期以后OD600nm值與菌體數(shù)量不呈線性關(guān)系，而在穩(wěn)定期以前兩者線性良好；得到了OD600nm值在0.2～0.8范圍內(nèi)與細(xì)胞數(shù)量的對應(yīng)關(guān)系，還發(fā)現(xiàn)實(shí)際OD600nm值與稀釋倍數(shù)之間并不是簡單的乘積關(guān)系，而呈冪函數(shù)關(guān)系。

分光光度法；OD600nm值；生長曲線；釀酒酵母

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是人類第一個(gè)應(yīng)用的微生物，其發(fā)酵性能早已被規(guī)模化利用。作為最重要的工業(yè)微生物與科學(xué)研究的模式生物，釀酒酵母在食品、醫(yī)藥、能源化工和環(huán)境治理等領(lǐng)域有重要經(jīng)濟(jì)應(yīng)用價(jià)值；同時(shí)也是模式生物基因組計(jì)劃（model organism genome project，MOGP）的成員，1996年釀酒酵母S288c基因組測序已全部完成[1]。目前，在釀酒酵母的開發(fā)與利用方面取得了顯著成果[2]，特別是隨著各種新型育種技術(shù)的出現(xiàn)，使獲得滿足于多重發(fā)酵需求的菌株成為可能，如陸棟等[3]利用重離子輻照育種方式得到的C03A菌株，使發(fā)酵時(shí)間縮短12h，乙醇產(chǎn)率提高了13%，就要求對其生長過程中菌體數(shù)量變化、生物量累積以及生長規(guī)律等要有更加清楚的了解，以便指導(dǎo)工業(yè)發(fā)酵和基礎(chǔ)研究。生長曲線反映了培養(yǎng)過程中生長和繁殖的規(guī)律，同一種釀酒酵母在不同的生長條件下生長曲線也不盡相同，通過生長曲線了解菌體生長繁殖情況，對于根據(jù)不同的需要有效地利用和控制釀酒酵母生長具有重要的意義。測定菌體數(shù)量的方法主要有直接血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法和間接平板菌落計(jì)數(shù)法，這些方法都比較繁瑣、耗時(shí)，所以在實(shí)際應(yīng)用中衡量菌體生長情況多采用簡單、快速的分光光度法，在此方法中常用光密度（optical density，OD）來表示菌懸液濃度。除此之外可以利用OD值來評價(jià)菌體的生長情況和生物性能，從而進(jìn)行相關(guān)基礎(chǔ)研究，苑偉等[4]利用菌懸液OD值來衡量釀酒酵母對乙醇的耐受性，ANDREW W等[5]利用OD值作為度量值來研究高產(chǎn)菌株基因與環(huán)境的相互作用。但是對于菌體濃度和OD值之間的確切關(guān)系，特別是當(dāng)菌液濃度較大時(shí)，用稀釋后的OD值反映菌體濃度等的研究較少。本研究采用分光光度法測定了釀酒酵母在不同生長條件下的生長曲線，并和平板菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行比較，然后對稀釋后OD值的回歸方式、不同生長期OD值與菌體細(xì)胞個(gè)數(shù)的相關(guān)性以及稀釋倍數(shù)和OD值的關(guān)系等進(jìn)行詳細(xì)探討。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：本實(shí)驗(yàn)室保存。酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L，酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，瓊脂20g/L，pH值為5.0。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司；PHS-3D型pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

取活化后斜面釀酒酵母1環(huán)，接種于25mL液體YPD培養(yǎng)基中，30℃、200r/min培養(yǎng)14h，備用。

1.3.2 生長曲線的測定

取活化的菌懸液，按1%的接種量分別接種于50mL三角瓶裝25mL培養(yǎng)基（25mL/50mL）、250mL三角瓶裝50mL培養(yǎng)基（50mL/250mL）的2種新鮮YPD培養(yǎng)基中，同時(shí)在30℃、200r/min的條件下振蕩培養(yǎng)，分別于0、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h、26h、28h、30h、32h取樣在波長600nm處測定光密度值（OD600nm），濃度過大時(shí)應(yīng)稀釋相應(yīng)的倍數(shù)使OD600nm值在0.1～0.8之間[6-7]；并分別留樣連續(xù)稀釋至10-7倍后涂平板，利用平板菌落計(jì)數(shù)法測定細(xì)胞個(gè)數(shù)，然后分別繪制2種不同測量方法下的生長曲線。

1.3.3 釀酒酵母不同生長時(shí)間菌懸液OD600nm值回歸方程的建立

對于較濃的菌懸液在適當(dāng)稀釋下測OD600nm值后，還需測定此稀釋倍數(shù)區(qū)間內(nèi)的任意兩組OD600nm值在上一稀釋倍數(shù)區(qū)間被稀釋到此稀釋倍數(shù)時(shí)的OD600nm值，設(shè)稀釋前后OD600nm值的關(guān)系符合回歸方程：y=ax+b，然后得到OD600nm值的分段回歸方程，計(jì)算得到OD600nm值的實(shí)際回歸值[8-9]。

1.3.4 OD600nm值與稀釋倍數(shù)曲線的繪制

分別取對數(shù)期、穩(wěn)定期的菌懸液，稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)使其OD600nm盡可能均勻分布在0.1～0.8之間，記錄稀釋倍數(shù)與具體的OD600nm值，然后分別以O(shè)D600nm值為縱坐標(biāo)和稀釋倍數(shù)為橫坐標(biāo)繪制關(guān)系曲線。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每一組實(shí)驗(yàn)均在相同的情況下重復(fù)3次，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以χˉ±s的形式表示，所用圖形均采用Origin 8.0軟件制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母生長曲線測定

2.1.1 分光光度法測定釀酒酵母不同生長條件下的生長曲線

釀酒酵母在不同的裝液量生長條件下連續(xù)培養(yǎng)32h，利用分光光度法在600nm波長下測定不同時(shí)間點(diǎn)菌懸液光密度，用OD600nm值表示，較濃的菌液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后再測定，然后用平板菌落計(jì)數(shù)法測定對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)菌液的細(xì)胞個(gè)數(shù)，結(jié)果如表1所示。

表1 釀酒酵母不同生長條件、不同生長時(shí)間菌懸液OD600nm值及細(xì)胞數(shù)量Table 1 OD600nmand cells number ofS.cerevisiaewith different growth time and condition

利用OD600nm值來衡量細(xì)胞濃度時(shí)必須把OD600nm值回歸到統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)上才可以比較。研究發(fā)現(xiàn)在不同的稀釋區(qū)間，OD600nm值稀釋前后與細(xì)胞濃度呈線性關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)做了3個(gè)不同倍數(shù)的稀釋，分別為10、20、30倍，需要建立3組對應(yīng)區(qū)間的回歸方程。實(shí)驗(yàn)中分別測定了4h、5h、6h、8h、10h、11h、14h、21h相應(yīng)稀釋倍數(shù)OD600nm值，然后在對應(yīng)的稀釋范圍內(nèi)對稀釋前后OD600nm值進(jìn)行分段線性回歸，結(jié)果如表2所示。由表2可知，在一定的稀釋范圍內(nèi)，稀釋前后OD600nm值（y）與細(xì)胞濃度（x）呈明顯的線性關(guān)系，分段回歸方程可以用于OD600nm回歸值的計(jì)算。

表2 釀酒酵母菌懸液不同稀釋區(qū)間OD600nm值分段回歸方程Table 2 Piecewise regression equations of OD600nminS.cerevisiae suspension with different dilution ratio

將不同稀釋倍數(shù)下測得的OD600nm值代入對應(yīng)的回歸方程，得到同一稀釋倍數(shù)水平相應(yīng)的OD600nm回歸值，然后繪制生長曲線，結(jié)果見圖1。由圖1可知，在相同時(shí)間下50mL/250mL比25mL/50mLOD600nm回歸值略大，這可能是在50mL/250mL條件下相對供氧更足，有利于其生長。但兩者生長曲線的趨勢基本一致，均經(jīng)過3h左右的延滯期，然后進(jìn)入對數(shù)期，對數(shù)期大概為4～12h，然后進(jìn)入穩(wěn)定期，此后OD600nm回歸值一直保持在一定的范圍內(nèi)，看不到明顯的衰亡期，結(jié)果與釀酒酵母實(shí)際生長不符[10]。為此本實(shí)驗(yàn)又利用平板菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行繪制其生長曲線，比較二者的區(qū)別。

圖1 分光光度法測得釀酒酵母不同生長條件下的生長曲線Fig.1 Growth curve ofS.cerevisiaewith different growth condition by spectrophotometry

2.1.2 平板菌落計(jì)數(shù)法繪制釀酒酵母的生長曲線

圖2 平板菌落計(jì)數(shù)測得釀酒酵母不同生長條件下的生長曲線Fig.2 Growth curve ofS.cerevisiaewith different growth condition by plate count

為了和圖1結(jié)果進(jìn)行比較，采用平板菌落計(jì)數(shù)法繪制釀酒酵母在25mL/50mL和50mL/250mL下的生長曲線，結(jié)果見圖2。與圖1相比圖2中不同生長條件下菌懸液細(xì)胞濃度的差異基本一致，圖2中出現(xiàn)了明顯的4個(gè)階段：延滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。其中延滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期與圖1一致，但有明顯的衰亡期。這可能是因?yàn)樵诜€(wěn)定期的后半段，菌體中衰亡的細(xì)胞逐漸增多，分光光度法測定時(shí)由于死亡的菌體也會產(chǎn)生一定的吸光度，所以在圖1中沒有明顯的衰亡期。結(jié)果表明，OD600nm值在反映菌體濃度時(shí)菌體實(shí)際的細(xì)胞數(shù)量之間有一定的差異。

2.2 不同生長期菌體細(xì)胞數(shù)量與OD600nm值的關(guān)系

為了解釋OD600nm值與菌體細(xì)胞數(shù)量之間的差異，選取了對數(shù)期和穩(wěn)定后期的菌懸液來研究釀酒酵母在不同生長時(shí)期OD600nm值與平板菌落計(jì)數(shù)所得細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系，結(jié)果見圖3及圖4。

圖3 對數(shù)期OD600nm值與菌體細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系Fig.3 Relation between OD600nmand cell number in log phase

圖4 穩(wěn)定期OD600nm值與菌體細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系Fig.4 Relation between OD600nmand cell number in stationary phase

由圖3、4可知，在對數(shù)期OD600nm值與菌體細(xì)胞數(shù)量之間有著較好的線性關(guān)系，OD600nm為0.618時(shí)，細(xì)胞數(shù)量為2.33×107個(gè)/mL，相應(yīng)的OD600nm回歸值增加到2.054時(shí)細(xì)胞數(shù)量為1.83×108個(gè)/mL。這也與圖1、圖2結(jié)果相符，說明在對數(shù)期細(xì)胞生長旺盛，死亡細(xì)胞很少，可以用OD600nm值較為準(zhǔn)確地反映菌液的細(xì)胞濃度。然而在穩(wěn)定期，特別是穩(wěn)定期的后半段細(xì)胞死亡率大于增長率，實(shí)質(zhì)進(jìn)入了衰亡期，如圖4所示，細(xì)胞數(shù)量隨著時(shí)間呈現(xiàn)出先增后減的趨勢，OD600nm值與細(xì)胞數(shù)量之間沒有線性關(guān)系，所以在這種情況下不能用OD600nm值來反映菌體的細(xì)胞濃度。這也很好的解釋了用OD600nm值作生長曲線時(shí)沒有明顯衰亡期的原因，也顯示了利用OD600nm值來衡量菌體濃度的缺陷。

2.3 對數(shù)期可信范圍內(nèi)OD值與細(xì)胞數(shù)量的對應(yīng)關(guān)系

在科學(xué)研究中，很多情況下對菌體細(xì)胞個(gè)數(shù)有明確要求，但是直接測定細(xì)胞個(gè)數(shù)往往很繁瑣，所以利用OD600nm值與菌體細(xì)胞個(gè)數(shù)在穩(wěn)定期以前的線性關(guān)系，可以作出OD600nm值與細(xì)胞數(shù)量的對應(yīng)關(guān)系，以便及時(shí)、準(zhǔn)確地了解細(xì)胞個(gè)數(shù)，本實(shí)驗(yàn)所得OD600nm值與細(xì)胞數(shù)量的對應(yīng)關(guān)系見圖5。

圖5 可信范圍內(nèi)OD600nm值與菌體細(xì)胞數(shù)量之間的線性關(guān)系Fig.5 Linear relation between OD600nmand cell number

由圖5可知，OD600nm值在0.2～0.8的可信范圍內(nèi)時(shí)，OD600nm值與細(xì)胞數(shù)量之間線性關(guān)系良好。

2.4 OD600nm值與稀釋倍數(shù)的關(guān)系

有研究發(fā)現(xiàn)[11]，在較低的稀釋倍數(shù)下，OD值和稀釋倍數(shù)是乘冪關(guān)系，但對于稀釋倍數(shù)較大時(shí)是否也是乘冪關(guān)系以及初濃度對其的影響等沒有深入研究。本實(shí)驗(yàn)分別選取對數(shù)期和穩(wěn)定期的菌懸液來研究OD600nm值與稀釋倍數(shù)的具體關(guān)系，繪制OD600nm值與稀釋倍數(shù)的關(guān)系曲線，結(jié)果分別見圖6及圖7。

圖6 對數(shù)期OD600nm值與稀釋倍數(shù)的關(guān)系Fig.6 Relation between OD600nmand dilution ratio in log phase

圖7 穩(wěn)定期OD600nm值與稀釋倍數(shù)的關(guān)系Fig.7 Relation between OD600nmand dilution ratio in stationary phases

由圖6及圖7可知，無論是對數(shù)期還是穩(wěn)定期，OD600nm值與稀釋倍數(shù)都呈明顯的冪函數(shù)關(guān)系，擬合度良好，其擬合方程式由最初的菌液濃度決定。說明菌液的細(xì)胞濃度隨稀釋倍數(shù)并不是均勻下降的，這就更正了先前認(rèn)為的二者是簡單倍數(shù)關(guān)系的認(rèn)識。

3 結(jié)論

本研究對稀釋后的OD值進(jìn)行分段線性回歸，利用回歸方程將OD值回歸到統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)上，然后繪制生長曲線，將此與平板菌落計(jì)數(shù)法繪制的生長曲線進(jìn)行比較，得出以下結(jié)論：2種方法測定生長曲線時(shí)在穩(wěn)定期以前基本一致，在穩(wěn)定期以后出現(xiàn)明顯的差異，前者觀察不到衰亡期。后續(xù)OD值與菌體細(xì)胞數(shù)量關(guān)系的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在對數(shù)期OD值與菌體細(xì)胞數(shù)量呈良好的線性關(guān)系，穩(wěn)定期以后不再呈線性，這也就解釋了上述生長曲線的差異。這主要是由于進(jìn)入穩(wěn)定期后半段以后細(xì)胞死亡率開始大于繁殖率，死亡的細(xì)胞逐漸增多，再加上菌體自溶[12-13]都會產(chǎn)生一定吸光值，此時(shí)的OD值已經(jīng)不能反映菌懸液的細(xì)胞濃度，所以O(shè)D值測得的生長曲線在穩(wěn)定期以后是不可靠的。但在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中，更多關(guān)注的是菌體進(jìn)入對數(shù)期的時(shí)間或者穩(wěn)定期以前的情況，所以O(shè)D值測生長曲線還是有著重要的應(yīng)用價(jià)值。本研究還利用了OD值與菌體細(xì)胞數(shù)量在穩(wěn)定期以前的線性關(guān)系，進(jìn)行了不同OD值與細(xì)胞數(shù)量的對應(yīng)關(guān)系，此結(jié)論對釀酒酵母生產(chǎn)和基礎(chǔ)研究中有關(guān)菌體數(shù)量的測定有著指導(dǎo)性的意義。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌懸液OD值與稀釋倍數(shù)之間并不是線性關(guān)系，而呈冪函數(shù)關(guān)系。

在傳統(tǒng)工業(yè)生產(chǎn)中，用OD值衡量釀酒酵母的生長過程主要是為了判斷是否進(jìn)入對數(shù)期來指導(dǎo)發(fā)酵接種。但近年來研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母在不同的生理時(shí)期核糖體以及脅迫相關(guān)蛋白都不盡相同[14]，這些差異都會反過來影響到其發(fā)酵性能[15]，故利用OD值監(jiān)測釀酒酵母的生長過程，準(zhǔn)確定位生理時(shí)期對于發(fā)酵生產(chǎn)尤為重要。本研究對于利用OD值來評價(jià)菌體生長過程的相關(guān)結(jié)論對于工業(yè)生產(chǎn)和生物學(xué)研究有著重要一定的參考價(jià)值。

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Determination ofSaccharomyces cerevisiaecell suspension concentration by spectrophotometry

CAO Guozhen1,2,3,MIU Jianshun1,3,ZHANG Miaomiao1,3,WANG Jufang1,3,LI Wenjian1,3,LU Dong1,3*
(1.Institute of Modern Physics,Chinese Academy of Sciences,Lanzhou 730000,China; 2.School of pharmacy,Lanzhou University,Lanzhou 730000,China; 3.Key Laboratory of Microbial Resources Exploition and Application,Lanzhou 730000,China)

The OD600nmvalues ofSaccharomyces cerevisiaewere measured by spectrophotometry under different growth time and condition.The piecewise regression equations of OD600nmvalues with different dilution ratio were established for obtaining growth curves.Comparing to the growth curve which acquired by the plate culture count method,the relation between OD600nmand cell number in log phase and stable phase were studied.Results showed that the OD600nmvalues were linear relation in corresponding interval before and after dilution.The growth curve had no obvious decline phase,mainly due to the relation between OD600nmvalues and yeast cells number didn't show linear relation after log phase,but in linear relation before stable phase.The corresponding relation between OD600nmvalues in 0.2-0.8 range and cell number was gained and the relation on OD600nmvalues and dilution ratio was power function relationship rather than multiplication relation.

spectrophotometry;OD600nmvalue;growth curve;Saccharomyces cerevisiae

Q939.97

A

0254-5071（2014）04-0129-05

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.04.031

2014-03-05

中國科學(xué)院西部之光人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目（Y306010XB0）；甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（1308RJZA316）

曹國珍（1989-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)檩椛渖飳W(xué)。

*通訊作者：陸棟（1979-），男，副研究員，博士，研究方向?yàn)樯镂锢韺W(xué)。