王鈺，楊思文，代語林，鄧寧，王燕，何建波，朱燕舞

（合肥工業(yè)大學化學工程學院，安徽合肥230009）

毛細管電泳法分離檢測飲料中的防腐劑

王鈺，楊思文，代語林，鄧寧*，王燕，何建波，朱燕舞

（合肥工業(yè)大學化學工程學院，安徽合肥230009）

采用高效毛細管電泳法，同時在線分離檢測對羥基苯甲酸甲酯、山梨酸鉀和苯甲酸3種防腐劑。考察了運行緩沖液的濃度、pH值、分離電壓、進樣時間等因素對電泳分離的影響。在檢測波長為230nm時，獲得了3種防腐劑分離檢測的最優(yōu)化實驗條件為：20mmol/L pH 9.2的硼砂緩沖溶液，分離電壓為22kV，進樣時間15s。在最優(yōu)化實驗條件下，3種防腐劑檢測的線性相關系數(shù)均大于0.98，檢出限為1.0×10-2g/kg。利用此方法檢測了市售3種飲料中所含防腐劑的種類和含量，各種防腐劑的回收率在88%～102%之間。

毛細管電泳；防腐劑；分離；檢測

食品是人類生存的基本物質保障，現(xiàn)代化的食品生產要求食品能夠方便貯存和運輸，防腐劑既能使食品保存期延長，也能防止食品腐敗變質，因此被廣泛應用于食品生產中。但是食品防腐劑的過量使用會對人體健康造成較大的危害，傷害人體正常機能，降低人體免疫力。我國明確規(guī)定了防腐劑使用標準，但仍然有一些商家沒有按照標準合理使用防腐劑。2007年國家質檢總局對北京等13個省、直轄市96家企業(yè)生產的117種產品進行抽查，抽查中發(fā)現(xiàn)部分碳酸飲料中防腐劑的含量超標[1]。近年來，食品安全的監(jiān)督與管理已經是國務院食品安全工作的重要任務。因此，建立一種高效快速檢測食品中多種食品防腐劑的方法非常重要。

目前，食品防腐劑的分離檢測方法通常采用氣相色譜法（gas chromatography，GC）[2-4]、高效液相色譜法（high per formance liquid chromatography，HPLC）[5-7]和毛細管電泳法（capillary electrophoresis，CE）[8-10]。其中CE由于具有分離效率高、試劑消耗量小、實驗成本低、易與其他技術聯(lián)用和環(huán)境友好等優(yōu)點[2，11-13]，引起研究者的關注并成為一項具有較強競爭力和良好選擇性的新技術。運用CE能同時分離和檢測多種食品防腐劑，如龍巍然等[14]運用CE分離檢測苯甲酸、山梨酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯等6種防腐劑。YOSHIKAWA K等[11]運用CE分離檢測苯甲酸、山梨酸、丙酸等食品中防腐劑。但是根據文獻調研結果，截至目前，采用毛細管電泳-紫外檢測法（capillary electrophoresis-ultraviolet，CE-UV）同時分離檢測對羥基苯甲酸甲酯、山梨酸鉀和苯甲酸這3種常用食品防腐劑的相關文獻還未報道。本研究采用CE-UV同時分離檢測對羥基苯甲酸甲酯、山梨酸鉀和苯甲酸3種防腐劑，考察了分離電壓、進樣時間、運行緩沖液的濃度及其pH值等電泳參數(shù)對分離效率的影響，確定了3種防腐劑分析檢測的最優(yōu)化實驗條件，在最佳實驗條件下測定了市售飲料中防腐劑的種類和含量，并通過回收率實驗驗證了方法的可靠性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

對羥基苯甲酸甲酯、山梨酸鉀、苯甲酸、硼砂和氫氧化鈉均為分析純：國藥集團化學試劑有限公司；七喜檸檬味汽水：上海百事可樂飲料公司；美年達葡萄味汽水：上海百事可樂飲料公司；蘋果醋：煙臺綠杰蘋果醋飲料股份有限公司；實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 儀器與設備

CL1020高效毛細管電泳儀（配置高壓電源、CL1020紫外檢測器，HW-2000色譜工作站）：北京彩陸科學儀器公司；PHS-3C型精密pH計：上海雷磁儀器廠；HS2060A型超聲波清洗器：昆山超聲儀器有限公司。未涂層熔融石英毛細管柱（60cm×52cm×50μm）：河北永年光導纖維廠。

1.3 實驗方法

準確稱取對羥基苯甲酸甲酯、山梨酸鉀、苯甲酸各0.1g分別置于小燒杯中，用適量的無水乙醇溶解并定容至100mL容量瓶中，配制成1.0g/L標準樣品溶液。稱取一定量的硼砂置于燒杯中，用二次蒸餾水溶解，全部轉移并定容于250mL容量瓶中，配制成20mmol/L的硼砂溶液。實驗前，溶液均用孔徑為0.45μm的超濾膜過濾。3種防腐劑的分子結構式如表1所示。為便于標記，在后文圖中，對羥基苯甲酸甲酯、山梨酸鉀和苯甲酸分別用M、P和B來表示。

表1 分析物的結構式Table 1 Structure of the analyte

每次開機前，毛細管依次用1mol/L的HCl沖洗5min，水沖洗5min，1mol/L NaOH沖洗10min，水沖洗5min，緩沖溶液沖洗10min。每兩次進樣之間毛細管都要用緩沖溶液沖洗2～3min。

2 結果與討論

2.1 電泳條件的選擇

2.1.1 緩沖溶液濃度的確定

緩沖溶液的濃度會從緩沖容量、毛細管內擴散層的厚度、以及電泳介質導電性等方面對分離產生影響[15]，因此，緩沖溶液的濃度是毛細管電泳分離物質的重要參數(shù)之一。在分離電壓為18kV、檢測波長為230nm、進樣時間為15s、緩沖液pH為9.2的條件下，調節(jié)硼砂緩沖溶液的濃度分別為10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L、40mmol/L、50mmol/L。圖1（A）反映的是緩沖溶液濃度對分離度的影響，從圖1（A）可以看出，在實驗的5個緩沖液濃度條件下，對羥基苯甲酸甲酯、山梨酸鉀和苯甲酸3種防腐劑均能夠實現(xiàn)基線分離，隨著硼砂緩沖溶液濃度的增大，對羥基苯甲酸甲酯、山梨酸鉀和苯甲酸之間的分離度逐漸增大。圖1（B）是3種防腐劑柱效隨緩沖溶液濃度的變化圖，由圖1（B）可以看出，當緩沖溶液濃度從10mmol/L增大為30mmol/L時，柱效逐漸升高；但是，當緩沖溶液濃度從30mmol/L進一步升高到50mmol/L時，由于高濃度的緩沖液導致分析電流增大，毛細管中的熱效應急劇增加，柱效開始下降，因此當緩沖液濃度為30mmol/L時3種防腐劑的分析柱效最高。但是，實驗工作中發(fā)現(xiàn)，當緩沖液濃度為30mmol/L時，由于熱效應的影響，防腐劑的色譜峰開始出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，因此，選擇3種防腐劑分析的最佳緩沖溶液濃度為20mmol/L。

圖1 緩沖溶液的濃度對分離度(A)及柱效(B)的影響Fig.1 Effect of buffer concentration on resolution and column efficiency

2.1.2 緩沖溶液的pH值的確定

在毛細管電泳中，緩沖溶液的pH值是影響電滲流的大小和分析物荷電狀態(tài)的主要因素，因此pH值也是影響毛細管分析的重要參數(shù)之一[15]。在20mmol/L硼砂緩沖溶液，分離電壓為18kV、檢測波長為230nm、高差10cm、進樣時間為15s的條件下，考察了緩沖液pH值從9.2升至10.0時3種防腐劑的分離情況。圖2（A）是3種防腐劑的分離度隨緩沖溶液pH值變化情況圖，從圖2（A）可以看出，隨著緩沖溶液pH值的增加，對羥基苯甲酸甲酯、山梨酸鉀和苯甲酸之間的分離度逐漸減小。圖2（B）是3種防腐劑柱效隨緩沖溶液pH值的變化圖，從圖2（B）可以看出，當緩沖溶液pH值為9.2時，3種防腐劑柱效較高。因此，選擇最佳pH值為9.2。

圖2 緩沖溶液pH值對分離度(A)及柱效(B)的影響Fig.2 Effect of buffer pH on resolution and column efficiency

2.1.3 分離電壓的確定

為了考察分離電壓對對羥基苯甲酸甲酯、山梨酸鉀和苯甲酸3種防腐劑分離度及柱效的影響，在20mmol/LpH9.2的硼砂緩沖溶液、檢測波長為230nm、高差10cm進樣時間為5s的條件下，在18～24kV范圍內調節(jié)分離電壓。圖3（A）反映的是分離電壓對3種防腐劑遷移時間的影響情況，從圖3（A）中可以得出，隨著分離電壓的增大，3種防腐劑的遷移時間逐漸縮短，這主要是電滲流隨著電壓的升高而增大的結果。圖3（B）是3種防腐劑柱效隨分離電壓的變化圖，由圖3（B）可以看出，3種防腐劑的分離柱效在電壓為22kV的時候最大。當分離電壓從18kV增大到22kV時，柱效逐漸升高；當分離電壓從22kV進一步升高到24kV時，柱效開始降低。這是因為焦耳熱與毛細管中的電流值平方成正比，當分離電壓過高時，急劇增大的焦耳熱難以有效驅散，從而導致柱效降低，運行不穩(wěn)定[16]。因此，為了節(jié)約分析時間并獲得較高的分離柱效，選擇最佳分離電壓為22kV。

圖3 分離電壓對分析時間(A)及柱效(B)的影響Fig.3 Effect of separation voltage on analysis time and column efficiency

2.1.4 進樣時間的確定

在20mmol/LpH9.2的硼砂緩沖溶液、檢測波長為230nm、分離電壓為22kV的條件下，采用高差10cm進樣，在5～25s范圍內調節(jié)進樣時間。隨著進樣時間的延長，3個色譜峰峰高均增大，檢測靈敏度均提高；但是，當進樣時間大于15s時，色譜峰有所展寬，柱效開始降低。同時考慮檢測靈敏度和柱效，選擇最佳的進樣時間為15s。

2.1.5 最優(yōu)化條件的確定

綜上所述，在檢測波長為230nm的條件下，對羥基苯甲酸甲酯、山梨酸鉀和苯甲酸3種防腐劑實現(xiàn)基線分離的最佳毛細管電泳條件為20mmol/L pH 9.2的硼砂緩沖溶液，分離電壓22kV，高差10cm進樣，進樣時間15s。圖4是3種防腐劑在最佳實驗條件下的電泳分離譜圖，在此條件下對羥基苯甲酸甲酯、山梨酸鉀和苯甲酸在7min之內實現(xiàn)了基線分離，相鄰色譜峰的分離度分別為7.78和5.29。

圖4 最優(yōu)化條件下防腐劑的毛細管電泳圖譜Fig.4 Capillary electrophoresis of preservative under the optimal condition

2.2 檢測線性范圍、重現(xiàn)性和檢出限分析

配制一系列不同濃度的對羥基苯甲酸甲酯、山梨酸鉀和苯甲酸混合標準溶液，在最優(yōu)化條件下進行毛細管電泳實驗，建立了同時分離測定3種防腐劑的方法。對羥基苯甲酸甲酯、山梨酸鉀和苯甲酸毛細管電泳測定的線性范圍、回歸方程、相關系數(shù)和檢出限（S/N=3）等結果見表2。3種防腐劑分析的線性范圍為0.05～1.00mmol/L，線性相關系數(shù)均大于0.98，檢出限為1×10-2g/kg。

表2 不同濃度混合標樣的測定結果Table 2 Determination results of different concentrations of mixed standard sample

2.3 實際樣品檢測

2.3.1 樣品的預處理

對美年達葡萄味汽水、蘋果醋進行適當?shù)南♂?，并且對美年達葡萄味汽水、蘋果醋和七喜檸檬味汽水等實際樣品分別進行超聲脫氣。

2.3.2 檢測結果

實際樣品經預處理后，按上述確定的最優(yōu)化實驗條件進行毛細管電泳分離測定，根據線性回歸方程，計算出各種樣品中各防腐劑的含量[17]，測定結果如表3所示。其中檸檬味汽水中測出含有苯甲酸鈉1種防腐劑，含量為0.91g/kg，相對標準偏差（relativestandarddeviation，RSD）為5.6%；葡萄味汽水中測出含有山梨酸鉀和苯甲酸2種防腐劑，含量分別為0.56g/kg和0.58g/kg，RSD分別為4.3%和2.1%；蘋果醋中檢測出含有山梨酸鉀1種防腐劑，含量為1.69g/kg，RSD為2.7%。

表3 樣品中添加劑的含量Table 3 Content of additives in samples

根據GB2760—1996《食品添加劑使用衛(wèi)生標準》[18]中規(guī)定飲料中苯甲酸鈉的含量以苯甲酸計不得超過2g/kg（相當于苯甲酸鈉含量2.36g/kg），山梨酸鉀的含量以山梨酸計不得超過2g/kg（相當于山梨酸鉀含量2.68g/kg），苯甲酸不得超過2g/kg。因此所檢測的3種實際樣品中所含防腐劑的量都符合國家衛(wèi)生標準。

2.4 回收率實驗

在七喜檸檬味汽水中加入一定量的苯甲酸，美年達葡萄味汽水中加入一定量的山梨酸鉀和苯甲酸，蘋果醋中加入一定量的山梨酸鉀，進行加標回收實驗，根據測定的結果計算回收率，結果如表4所示。從表4可以看出，3種防腐劑的測定回收率在88%～102%之間，說明實驗建立的毛細管電泳法同時分析測定對羥基苯甲酸甲酯、山梨酸鉀和苯甲酸3種常用防腐劑，方法可靠，可適用于實際產品的檢測。

表4 樣品加標回收率實驗Table 4 Experiment recovery of standard addition

3 結論

建立了毛細管電泳同時分離檢測對羥基苯甲酸甲酯、山梨酸鉀和苯甲酸3種防腐劑的新方法。在檢測波長為230nm條件下，考察了緩沖溶液濃度、緩沖液pH值、分離電壓和進樣時間等因素對分析結果的影響，確定了3種防腐劑分析測定的最佳電泳條件為20mmol/L pH 9.2的硼砂緩沖溶液，分離電壓22kV，進樣時間15s。在最佳實驗條件下，檢測了3種市售飲料中添加防腐劑的種類和含量，結果表明，其防腐劑含量均符合國標GB2760—1996《食品添加劑使用衛(wèi)生標準》?；厥章蕦嶒灲Y果表明3種防腐劑的回收率均在100%左右，證明了實驗建立的分析方法可靠性高。該方法步驟簡便、檢測快速、試劑用量少、成本低、環(huán)境友好等優(yōu)點而利于推廣使用，因此該技術具有廣泛的應用前景。

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Separation and detection of preservatives in beverage by capillary electrophoresis

WANG Yu,YANG Siwen,DAI Yulin,DENG Ning*,WANG Yan,HE Jianbo,ZHU Yanwu
(School of Chemical Engineering,Hefei University of Technology,Hefei 230009,China)

A high performance capillary electrophoresis method was developed for the simultaneous determination of three kinds of preservatives, such as methylparaben,potassium sorbate and benzoic acid.The effect of running buffer concentration,pH,separation voltage,sampling time on electrophoretic separation was investigated.At the detection wavelength of 230 nm,the optimal separation and detection of three preservatives conditions were optimized as follows:20 mmol/L sodium borate buffer at pH 9.2,running voltage 22 kV and sampling time 15 s.Under the optimized condition,the linearly dependent coefficients of three preservatives were all greater than 0.98,and the detection limits was 1×10-2g/kg.The method has been successfully used for determination of preservatives in three kinds of beverages,and the recoveries of the preservatives were between 88%-102%.

capillary electrophoresis;preservatives;separation;detection

O657.8

A

0254-5071（2014）04-0124-05

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.04.030

2014-03-05

國家自然科學基金資助項目（21102030）

王鈺（1988-），女，碩士研究生，研究方向為工業(yè)及儀器分析。

*通訊作者：鄧寧（1976-），女，副研究員，博士，研究方向為毛細管電泳、毛細管電色譜。