王青龍，陳桂光，曾偉，鄭雙鳳，唐真，粱智群

（廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530004）

枯草芽孢桿菌GXA-28發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸動(dòng)力學(xué)研究

王青龍，陳桂光，曾偉，鄭雙鳳，唐真，粱智群*

（廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530004）

對(duì)耐熱高產(chǎn)菌株枯草芽孢桿菌GXA-28分批發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的動(dòng)力學(xué)特征進(jìn)行了研究，基于菌體生長(zhǎng)特性，結(jié)合Logistic方程和Luedeking-Piret方程，提出了菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物合成、葡萄糖消耗以及谷氨酸鈉消耗的動(dòng)力學(xué)模型。應(yīng)用Origin8.5對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，得到了Bacillis subtilisGXA-28分批發(fā)酵合成γ-聚谷氨酸相應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。將模型預(yù)測(cè)值和實(shí)驗(yàn)值進(jìn)行比較，結(jié)果表明，模型基本反映了枯草芽孢桿菌GXA-28分批發(fā)酵過(guò)程中的動(dòng)力學(xué)特征。

枯草芽孢桿菌GXA-28；γ-聚谷氨酸；動(dòng)力學(xué)模型

γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid，γ-PGA）主要是自然界中微生物來(lái)源的一種強(qiáng)水溶性的多聚氨基酸高分子化合物[1]。其具有良好的生物可降解性、可食用性、生物相容性和保濕性[2]，對(duì)人體和環(huán)境無(wú)毒無(wú)公害，可廣泛用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品、環(huán)境保護(hù)等[3]，還可應(yīng)用于化妝品、食品用水凝膠[4]、黏稠劑[5]、土壤沙地的蓄水保水劑[6]、高吸水劑[7-8]、高強(qiáng)度纖維的制備以及生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[9]。近年來(lái)，隨著國(guó)內(nèi)外對(duì)γ-聚谷氨酸研究的深入，γ-聚谷氨酸作為一種可降解高分子化合物，越來(lái)越顯現(xiàn)出其廣闊的科研價(jià)值和應(yīng)用前景。目前由于受到發(fā)酵工藝、生產(chǎn)成本及生產(chǎn)菌株的限制，國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)大規(guī)模生產(chǎn)的相關(guān)報(bào)道，因此對(duì)聚谷氨酸發(fā)酵過(guò)程的研究就有了很重要的現(xiàn)實(shí)意義。

國(guó)內(nèi)目前主要是將菌種選育以及對(duì)發(fā)酵條件的優(yōu)化作為研究重點(diǎn)，有關(guān)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型的報(bào)道相對(duì)較少[10]。本實(shí)驗(yàn)考察了γ-PGA分批發(fā)酵過(guò)程中的菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物合成、底物消耗情況。運(yùn)用Origin 8.5數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)枯草芽孢桿菌GXA-28發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行非線性擬合，并獲得了相應(yīng)的動(dòng)力學(xué)模型及模型參數(shù)。利用擬合方程可以預(yù)測(cè)分批發(fā)酵過(guò)程中菌體量、γ-PGA量、葡萄糖量、谷氨酸鈉量的變化情況，為下一步的放大培養(yǎng)及補(bǔ)料分批發(fā)酵等提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌GXA-28（B.subtilisGXA-28）：生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院自主篩選，菌株保藏編號(hào)CCTCC M2012347。

葡萄糖：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；谷氨酸鈉（純度≥99%）：南寧市荷花味精有限公司；酵母膏：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；KH2PO4：天津市紅巖化學(xué)試劑廠；MgSO4：天津博迪化工股份有限公司。

種子液培養(yǎng)基：葡萄糖10g/L、酵母膏5g/L、谷氨酸鈉5g/L、KH2PO40.5g/L、MgSO40.1g/L，pH 6.5±0.1。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30g/L、酵母膏2.5g/L、谷氨酸鈉20g/L、KH2PO40.5g/L、MgSO40.1g/L，pH 6.5±0.1。

1.2 儀器與設(shè)備

YP1200型電子天平：上海精科實(shí)業(yè)有限公司；HVE-50自動(dòng)滅菌鍋：日本HIRAYAMA公司；SPX-250型生化培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療儀器廠；EBA21型高速離心機(jī)：德祥科技有限公司；SBA-40D生物傳感分析儀：山東省科學(xué)院生物研究所；UV-1800紫外分光光度計(jì)：日本SHIMADIU公司；SKY-211B恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子培養(yǎng)液的制備

取一管甘油保藏菌種接入裝有30mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于42℃、160r/min條件下培養(yǎng)16h，得到種子培養(yǎng)液。

1.3.2 分批發(fā)酵培養(yǎng)

將培養(yǎng)得到的種子培養(yǎng)液取1mL接種于裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，于42℃、160r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)?？疾觳煌瑫r(shí)間段培養(yǎng)液中的菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物合成、底物消耗情況。

1.3.3 殘?zhí)?、殘谷氨酸鈉含量測(cè)定

由上述培養(yǎng)條件獲得的發(fā)酵液采用生物傳感分析儀測(cè)定性能指標(biāo)，溫度10～35℃，相對(duì)濕度＜90%，可同時(shí)測(cè)定β-D-葡萄糖、L-谷氨酸含量，測(cè)定范圍：0～100mg/100mL。

1.3.4 聚γ-谷氨酸產(chǎn)量的測(cè)定

按照參考文獻(xiàn)[11]的方法測(cè)定。

1.3.5 枯草芽孢桿菌GXA-28生物量的測(cè)定

發(fā)酵液稀釋10倍后，用可見(jiàn)分光光度計(jì)于波長(zhǎng)660nm處測(cè)定其吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 動(dòng)力學(xué)模型的建立

2.1.1 菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型的建立

描述菌體生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)模型最常用的有Monod方程和Logistic方程，Monod方程主要用來(lái)描述理想化的均衡生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型。Logistic方程[12]與Monod方程相比，其限制因子主要是菌體濃度或生長(zhǎng)空間，而γ-PGA分批發(fā)酵過(guò)程后期發(fā)酵液黏度較大，因此菌體生長(zhǎng)將受到生長(zhǎng)空間及氧傳質(zhì)等因素的限制，選用Monod方程進(jìn)行建模會(huì)導(dǎo)致結(jié)果有較大偏差，因此本實(shí)驗(yàn)選用Logistic方程對(duì)菌體生長(zhǎng)規(guī)律進(jìn)行描述。Logistic方程為：

式中：X為菌體生物量（用OD660nm值表示）；μm為最大比生長(zhǎng)速率，h-1；Xmax為菌體最大生物量（用OD660nm值表示）。

將上式對(duì)時(shí)間t積分，得到Logistic方程的積分形式

式中：X0為菌體初始生物量（用OD660nm值表示）；μm為最大比生長(zhǎng)速率，h-1；Xmax為菌體最大生物量（用OD660nm值表示）；t為時(shí)間，h。

2.1.2 產(chǎn)物合成動(dòng)力學(xué)模型建立

通過(guò)跟蹤取樣分析發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌GXA-28分批發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA分為2個(gè)階段：第一個(gè)階段主要是菌體快速的生長(zhǎng)，產(chǎn)物合成量較少，此時(shí)基質(zhì)的消耗主要用于菌體的生長(zhǎng)；第二階段時(shí)γ-PGA開(kāi)始快速合成，在此過(guò)程中菌體量已經(jīng)接近穩(wěn)定值，此時(shí)基質(zhì)的消耗主要用于γ-PGA的合成。由此可以明顯看出，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)γ-PGA屬于部分偶聯(lián)型[13]。因此本實(shí)驗(yàn)選用由Luedeking和Piret提出的Luedeking-Piret方程對(duì)γ-PGA的合成規(guī)律進(jìn)行描述如下：

將上式簡(jiǎn)化得

式中：α，β為動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)；X為菌體生物量（用OD660nm值表示）；μm為最大比生長(zhǎng)速率，h-1；Xmax為菌體最大生物量（用OD660nm值表示）；dP/dt為γ-聚谷氨酸產(chǎn)物合成速率，g（/L·h）。

將上式積分得

式中：P為γ-聚谷氨酸產(chǎn)量，g/L；α，β為動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)；X0為菌體初始生物量（用OD660nm值表示）；μm為最大比生長(zhǎng)速率，h-1；Xmax為菌體最大生物量（用OD660nm值表示）；t為時(shí)間，h。

2.1.3 葡萄糖消耗動(dòng)力學(xué)模型的建立

葡萄糖在聚谷氨酸發(fā)酵過(guò)程中是細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成所需的重要營(yíng)養(yǎng)成分，其消耗主要用于3個(gè)方面：①生成新的細(xì)胞；②用來(lái)維持細(xì)胞基本生命活動(dòng)；③是γ-PGA的合成。因此葡萄糖消耗動(dòng)力學(xué)可以用如下方程描述

式中：YX/S為葡萄糖用于菌體生長(zhǎng)的得率常數(shù)，g/g；YP/S為葡萄糖用于產(chǎn)物積累的得率常數(shù)，g/g；mx為微生物的維持常數(shù)，g/（L·h）；X為菌體生物量（用OD660nm值表示）；dS1/dt為葡萄糖消耗速率，g/（L·h）。

在分批發(fā)酵過(guò)程中，菌體呼吸消耗的基質(zhì)可以認(rèn)為是菌體生長(zhǎng)消耗的一部分[14-15]，因此葡萄糖的消耗就可以簡(jiǎn)單的分為菌體生長(zhǎng)的消耗和產(chǎn)物合成的消耗兩部分。故葡萄糖消耗的動(dòng)力學(xué)模型可以簡(jiǎn)化為

式中：k1為葡萄糖用于菌體生長(zhǎng)的得率常數(shù)，g/g；k2為葡萄糖用于產(chǎn)物積累的得率常數(shù)，g/g。將（1）、（3）式子帶入得

式中：k1為葡萄糖用于菌體生長(zhǎng)的得率常數(shù)，g/g；k2為葡萄糖

用于產(chǎn)物積累的得率常數(shù)，g/g；X為菌體生物量（用OD660nm值表示）；Xmax為菌體最大生物量（用OD660nm值表示）；α，β為動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)；μm為最大比生長(zhǎng)速率，h-1。

將（8）式子積分得

式中：S1為葡萄糖的質(zhì)量濃度，g/L；S0為葡萄糖初始質(zhì)量濃度，g/L；X0為菌體初始生物量（用OD660nm值表示）；k1為葡萄糖用于菌體生長(zhǎng)的得率常數(shù)，g/g；k2為葡萄糖用于產(chǎn)物積累的得率常數(shù)，g/g；Xmax為菌體最大生物量（用OD660nm值表示）；α，β為動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)；μm為最大比生長(zhǎng)速率，h-1。

2.1.4 谷氨酸鈉消耗動(dòng)力學(xué)模型的建立

枯草芽孢桿菌GXA-28屬于底物依賴型菌株，因此谷氨酸納的消耗主要用于γ-PGA的合成，谷氨酸鈉消耗的動(dòng)力學(xué)模型可以簡(jiǎn)化為：

式中：dS2/dt為谷氨酸鈉消耗速率，g/（L·h）；k3為谷氨酸鈉用于產(chǎn)物合成的得率常數(shù)，g/g。

對(duì)上式積分得

式中：S2為谷氨酸鈉質(zhì)量濃度，g/L；S0為葡萄糖初始質(zhì)量濃度，g/L；X0為菌體初始生物量（用OD660nm值表示）；k3為谷氨酸鈉用于產(chǎn)物合成的得率常數(shù)，g/g；Xmax為菌體最大生物量（用OD660nm值表示）；α為動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)；μm為最大比生長(zhǎng)速率，h-1。

2.2 動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)求解

根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和上述的模型方程應(yīng)用Origin 8.5軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)值進(jìn)行非線性擬合，獲得最優(yōu)化參數(shù)估計(jì)值。并得出實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值之間的方差，分別為菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型R2=0.997，產(chǎn)物合成動(dòng)力學(xué)模型R2=0.993，葡萄糖消耗動(dòng)力學(xué)模型R2=0.991，底物谷氨酸鈉模型R2=0.989。參數(shù)估計(jì)值結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 分批發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA的動(dòng)力學(xué)參數(shù)估計(jì)值Table 1 Estimated kinetic parameter of γ-PGA batch fermentation

將擬合所得模型參數(shù)代入方程可以得出γ-PGA分批發(fā)酵的動(dòng)力學(xué)模型分別為：

菌體生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)模型

產(chǎn)物γ-PGA合成的動(dòng)力學(xué)模型

葡萄糖消耗的動(dòng)力學(xué)模型

谷氨酸鈉消耗的動(dòng)力學(xué)模型

2.3 曲線擬合分析

為了驗(yàn)證上述動(dòng)力學(xué)模型的可靠性，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用Origin 8.5數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)γ-PGA分批發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行非線性擬合分析，得到了γ-PGA分批發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物合成、葡萄糖消耗以及谷氨酸鈉消耗的擬合曲線分別如圖1～圖4所示。從圖1～圖4可以看出，除了在發(fā)酵開(kāi)始階段和結(jié)束階段的個(gè)別點(diǎn)的相對(duì)誤差較大外，在發(fā)酵中期，所建動(dòng)力學(xué)模型都能對(duì)真實(shí)的發(fā)酵情況進(jìn)行很好的擬合。可以認(rèn)為擬合曲線基本反映了γ-PGA真實(shí)的發(fā)酵過(guò)程。

圖1 菌體生物量實(shí)驗(yàn)值與擬合曲線的比較Fig.1 Comparison of fitted curve and measured biomass

圖2 γ-PGA產(chǎn)量實(shí)驗(yàn)值與擬合曲線的比較Fig.2 Comparison of fitted curve and measured γ-PGA yield

圖3 剩余葡萄糖量實(shí)驗(yàn)值與擬合曲線比較Fig.3 Comparison of fitted curve and measured remaining glucose content

圖4 谷氨酸鈉剩余量實(shí)驗(yàn)值與擬合曲線比較Fig.4 Comparison of fitted curve and measured sodium glutamate content

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)枯草芽孢桿菌GXA-28發(fā)酵合成γ-PGA特征分析，運(yùn)用Origin 8.5數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行非線性擬合，得出其分批發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)、γ-PGA合成、葡萄糖消耗、底物消耗的動(dòng)力學(xué)模型及相關(guān)參數(shù)，通過(guò)擬合曲線圖可以看出，實(shí)驗(yàn)值與模型曲線非常接近。將預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值進(jìn)行對(duì)比可以看出，除發(fā)酵初期和發(fā)酵末期的個(gè)別點(diǎn)相對(duì)誤差較大外，在發(fā)酵中期動(dòng)力學(xué)模型能很好的對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。因此可以用該模型來(lái)預(yù)測(cè)發(fā)酵液中菌體量、產(chǎn)物合成量、葡萄糖以及谷氨酸鈉在發(fā)酵過(guò)程的變化情況，為以后工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)及補(bǔ)料分批發(fā)酵提供參考。

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Fermentation kinetics model of γ-polyglutamic acid production byBacillis subtilisGXA-28

WANG Qinglong,CHEN Guiguang,ZENG Wei,ZHENG Shuangfeng,TANG Zhen,LIANG Zhiqun*
(College of Life Science and Technology,Guangxi University,Nanning 530004,China)

The kinetics feature of a heat-resistant and high-yieldγ-polyglutamic acid strainBacillis subtilisGXA-28 was investigated.Based on bacterial growth characteristics,combining with Logistic and Luedeking-Piret equation,the kinetic model of microbial growth,γ-polyglutamic acid formation and glucose consumption during fermentation were proposed.The data was analyzed with origin 8.5 to generate the kinetics parameters ofγ-ploy glutamic acid production byB.subtilisGXA-28 batch fermentation.The prediction value was compared with the experimental value;it showed that the model could provide reasonable description for the batch fermentation process ofB.subtilisGXA-28.

Bacillis subtilisGXA-28;γ-polyglutamic acid;kinetics model

Q936

A

0254-5071（2014）04-0075-04

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.04.018

2014-03-13

廣西研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃資助項(xiàng)目（YCBZ2012004）；2013年廣西大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研究課題；2013年廣西大學(xué)微生物及植物遺傳工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任基金課題

王青龍（1988-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程及生物制藥。

*通訊作者：梁智群（1959-），男，教授，博士，研究方向?yàn)樯锕こ虒W(xué)。