何華美，李淑珍，陳丹霞，潘進(jìn)權(quán)

（湛江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東湛江524048）

芽孢桿菌混合發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化

何華美，李淑珍，陳丹霞，潘進(jìn)權(quán)*

（湛江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東湛江524048）

為提高飼料用芽孢桿菌中性蛋白酶的活力，考察了多種芽孢桿菌混菌發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的協(xié)同作用效果，并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)多芽孢桿菌的混合發(fā)酵工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。通過優(yōu)化確定了混合發(fā)酵體系的最佳發(fā)酵條件為培養(yǎng)基最初pH值7.17，裝液量50mL/250mL，接種量3%，發(fā)酵溫度35.4℃，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，發(fā)酵周期100h。在優(yōu)化的工藝條件下，芽孢桿菌混合發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的活力單位可達(dá)到2 986U/mL。

芽孢桿菌；混合發(fā)酵；蛋白酶；中心組合設(shè)計(jì)

已有大量研究顯示，大多數(shù)芽孢桿菌屬微生物由于能夠分泌胞外淀粉酶和蛋白酶等消化酶，從而可以促進(jìn)飼料消化，提高飼料利用率[1-2]；芽孢桿菌屬微生物可以在動(dòng)物腸道定植，從而保持了動(dòng)物腸道微生態(tài)的平衡，有效地抵御外來致病菌的致病作用，可以有效提高動(dòng)物的抗病能力[3-4]。因此，近年來以枯草芽孢桿菌為代表的芽孢桿菌活菌制劑在養(yǎng)殖業(yè)中得到了越來越廣泛的應(yīng)用[5-6]。

隨著各類芽孢在養(yǎng)殖業(yè)中不斷被推廣應(yīng)用，以芽孢桿菌為代表的活菌制劑的生產(chǎn)規(guī)模不斷擴(kuò)大，芽孢桿菌類活菌制劑的清潔生產(chǎn)及活菌制劑發(fā)酵廢液中活性物質(zhì)，如蛋白酶[7-9]的綜合利用已成為研究重點(diǎn)之一。然而，要實(shí)現(xiàn)活菌制劑發(fā)酵廢液中蛋白酶的綜合利用，提高發(fā)酵廢液中蛋白酶濃度就尤為重要。大量的研究表明，不同芽孢桿菌之間可以存在良好的互惠共生關(guān)系[10]，這種有益的共生關(guān)系可顯著提高混合系統(tǒng)中各菌株的生長速率及代謝效率，從而在一定程度上提高某些產(chǎn)物的產(chǎn)量[11-13]。依據(jù)已有實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道，本研究擬建立多種不同飼料用芽孢桿菌混合發(fā)酵體系，借助芽孢桿菌之間存在的良好共生關(guān)系，促進(jìn)芽孢桿菌的生長，同時(shí)提高芽孢桿菌活菌制劑發(fā)酵廢液中蛋白酶的活力單位，提升活菌制劑發(fā)酵廢液的綜合利用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芽孢桿菌（Bacillus）A2、B2、B3菌株：湛江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室分離保藏菌種。

斜面培養(yǎng)基：酵母粉5g，蛋白胨10g，NaCl5g，水1000mL，瓊脂15g，pH 7.0～7.2。

種子培養(yǎng)基：酵母粉5g，蛋白胨10g，NaCl5g，水1000mL，pH 7.0～7.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖40g，蛋白胨20g，K2HPO43g，麩皮30g，吐溫80 1mL，CaCO33g，水1 000mL，pH 7.5。

氫氧化鈉、碳酸鈉、酒石酸鉀鈉、硫酸銅、鎢酸鈉、濃鹽酸等均為分析純：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）：上海陽光試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HYQ-60空氣恒溫振蕩器：武漢匯誠生物科技有限公司；SPX-250B-2生化培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；723N可見分光光度計(jì)、FC104電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；3-18k冷凍離心機(jī)：美國Sigma公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種的活化

將低溫保存的芽孢桿菌A2、B1、B3菌株分別接種于斜面培養(yǎng)基，將其置于37℃的生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。

1.3.2 種子液的培養(yǎng)

在250mL三角瓶中裝入種子培養(yǎng)基50mL，分別從試管斜面上挑取1環(huán)活化菌種，然后將其置于恒溫?fù)u床中37℃、150r/min培養(yǎng)24h。

1.3.3 發(fā)酵試驗(yàn)

將培養(yǎng)好的A2、B2、B3液體種子按照體積比2∶3∶3進(jìn)行混合得到種子混合液。在250mL三角瓶中裝入發(fā)酵培養(yǎng)基50mL，滅菌之后按照4%（v/v）的比例接種混合液體種子，然后將三角瓶置于恒溫?fù)u床中37℃、150r/min發(fā)酵72h。

1.3.4 粗酶液的分離與蛋白酶活性測(cè)定

將發(fā)酵72h后的培養(yǎng)液在4℃，8 000r/min的條件下離心10min，然后收集離心所得上清液，即為粗酶液，采用Folin-酚法測(cè)定其蛋白酶活性[14]。酶活定義：在試驗(yàn)條件下，每分鐘水解酪蛋白釋放出1μg當(dāng)量酪氨酸所需酶量為1個(gè)酶活力單位。

1.3.5 發(fā)酵條件的單因素試驗(yàn)

培養(yǎng)基初始pH值對(duì)混合發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的影響：配制發(fā)酵培養(yǎng)基，分別調(diào)節(jié)其pH值至6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0，按照1.3.3的條件進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)并測(cè)定酶活，考察初始pH值對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

發(fā)酵溫度對(duì)混合發(fā)酵產(chǎn)酶的影響：配制發(fā)酵培養(yǎng)基，按照1.3.3的操作分別于27℃、32℃、37℃、42℃和47℃的溫度下進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)并測(cè)定蛋白酶活力，考察溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

接種量對(duì)混合發(fā)酵產(chǎn)酶的影響：配制發(fā)酵培養(yǎng)基，分別以1%、2%、3%、4%、5%和6%的接種量接種，按照1.3.3的操作進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)并測(cè)定蛋白酶活力，考察接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

搖床轉(zhuǎn)速對(duì)混合發(fā)酵產(chǎn)酶的影響：配制發(fā)酵培養(yǎng)基，按照1.3.3的操作分別于50r/min、100r/min、150r/min、200r/min、250r/min的搖床轉(zhuǎn)速條件下進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)并測(cè)定蛋白酶活力，考察搖床轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

裝液量對(duì)混合發(fā)酵產(chǎn)酶的影響：配制發(fā)酵培養(yǎng)基，在250mL三角瓶中分別裝發(fā)酵培養(yǎng)基25mL、50mL、75mL、100mL和150mL，按照1.3.3的操作進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)并測(cè)定蛋白酶活力，考察裝液量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

發(fā)酵時(shí)間對(duì)混合發(fā)酵產(chǎn)酶的影響：配制發(fā)酵培養(yǎng)基，按照1.3.3的操作進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，分別發(fā)酵24h、48h、72h、96h、120h、144h后測(cè)定蛋白酶活力，考察發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

1.3.6 響應(yīng)面分析

利用SAS統(tǒng)計(jì)軟件，采用響應(yīng)面分析法的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)[15]，進(jìn)一步考察單因素試驗(yàn)篩選出的顯著影響因素，優(yōu)化各因素的最佳取值，由此確定混合發(fā)酵的工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基pH值對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

分別于不同pH條件下進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)考慮了培養(yǎng)基初始pH值對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 培養(yǎng)基初始pH對(duì)混合發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.1 Effect of initial pH on the protease yield by mixture-culture fermentation

由圖1可知，培養(yǎng)基的起始pH對(duì)混合發(fā)酵產(chǎn)酶有較顯著的影響，不同pH條件下的發(fā)酵產(chǎn)酶單位有明顯差異；發(fā)酵培養(yǎng)基的起始pH值設(shè)定在7.5左右較為合適。

2.2 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)中性蛋白酶的影響

分別于不同的溫度條件下進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)考察溫度發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 溫度對(duì)混合發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of temperature on the protease yield by mixture-culture fermentation

由圖2可知，發(fā)酵溫度對(duì)混合發(fā)酵產(chǎn)酶有顯著的影響；發(fā)酵溫度過低（低于27℃）菌體生長非常緩慢進(jìn)而影響酶的產(chǎn)量；發(fā)酵溫度過高（超過40℃）易導(dǎo)致菌體過早衰老死亡，同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致酶的穩(wěn)定性降低而失活；由試驗(yàn)結(jié)果可初步確定混合發(fā)酵的適宜溫度在37℃左右。

2.3 接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

分別以不同的接種量進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，考察了接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 接種量對(duì)混合發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of inoculum on the protease yield by mixture-culture fermentation

由圖3可知，接種量對(duì)混合發(fā)酵產(chǎn)酶也有一定的影響，過高或過低的接種量均會(huì)在一定程度上導(dǎo)致產(chǎn)酶量有所降低；混合發(fā)酵的適宜接種量在3%左右。

2.4 轉(zhuǎn)速與裝液量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

圖4 裝液量(A)及搖床轉(zhuǎn)速(B)對(duì)混合發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of broth content(A)and rotate speed(B)on the protease yield by mixture-culture fermentation

在搖瓶發(fā)酵的條件下，分別從250mL搖瓶裝液量及搖床轉(zhuǎn)速的角度考察了溶氧量對(duì)混合發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，芽孢桿菌混合發(fā)酵產(chǎn)酶量的高低受溶氧水平的顯著影響。當(dāng)搖瓶裝液量過高（＞50mL/250mL）或搖床轉(zhuǎn)速過低（＜150r/min），則蛋白酶的發(fā)酵產(chǎn)量會(huì)明顯的降低。因此，要保證芽孢桿菌混合發(fā)酵產(chǎn)酶量的最大化，充足的氧氣供應(yīng)尤為重要。在搖床發(fā)酵條件下，最大裝液量為50mL/250mL，搖床轉(zhuǎn)速不宜低于200r/min。

2.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

考察了不同發(fā)酵周期芽孢桿菌混合發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的情況，結(jié)果如圖5所示。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)混合發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of fermentation time on the protease yield by mixture-culture fermentation

由圖5可知，芽孢桿菌在接種發(fā)酵24h后進(jìn)入快速產(chǎn)酶期，蛋白酶的產(chǎn)率幾乎與發(fā)酵時(shí)間成線性關(guān)系增長；與單一芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的情況相比[16-17]，在混合發(fā)酵系統(tǒng)中芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶的周期明顯有所延長，可持續(xù)相對(duì)更長的發(fā)酵產(chǎn)酶時(shí)間，這應(yīng)該是蛋白酶發(fā)酵產(chǎn)量得以提高的原因之一；發(fā)酵持續(xù)到96h后蛋白酶的產(chǎn)量趨于平穩(wěn)，由此初步確定芽孢桿菌混合發(fā)酵的適宜時(shí)間為96h。

2.6 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過以上單因素試驗(yàn)初步考察了各工藝參數(shù)對(duì)混合發(fā)酵產(chǎn)酶的影響情況，并在此基礎(chǔ)上篩選出了對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶有顯著影響并易于工藝放大的3個(gè)因素（培養(yǎng)基初始pH值、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度）進(jìn)行后續(xù)的響應(yīng)面優(yōu)化，同時(shí)固定其他因素取值：搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，接種量為3%，搖瓶裝液量為50mL/250mL。表1、表2分別給出了中心組合設(shè)計(jì)的因素水平及試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果。

表1 中心組合設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of central composite design

表2 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of central composite design

對(duì)表2的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，可以擬合得到以下數(shù)學(xué)模型：

從表3可以看出，模型的P＜0.05，表明該模型較顯著；在因素水平的取值范圍內(nèi)，因素A、B、C的二次項(xiàng)對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響較顯著，而單一因素項(xiàng)A、B、C及因素間的交互作用對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響不顯著。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of the regression equation

圖6給出了擬合模型的響應(yīng)曲面。由圖6可以看出，該曲面是典型的凸面響應(yīng)，其上存在最大響應(yīng)點(diǎn)。利用SAS軟件分析確定了最大響應(yīng)值為（2 909±177）U/mL，其對(duì)應(yīng)的因素取值分別為發(fā)酵溫度35.4℃，培養(yǎng)基初始pH值為7.17，發(fā)酵時(shí)間100h。4次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果為3 060U/mL、2 954U/mL、2 820U/mL、3 108U/mL，平均值為2 986U/mL，與模型的預(yù)測(cè)值基本一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了該模型的可靠性。

圖6 各因素相互作用對(duì)混合發(fā)酵產(chǎn)酶影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.6 Response surface plot and contour line of interaction among fermentation time,temperature,pH on the protease yield by mixture-culture fermentation

根據(jù)以上優(yōu)化試驗(yàn)的結(jié)果，由此可確定芽孢桿菌混合發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的工藝條件：培養(yǎng)基初始pH值為7.17，裝液量50mL/250mL，接種量3%，于35.4℃，搖床轉(zhuǎn)速200r/min發(fā)酵100h。在此最佳條件下，芽孢桿菌混合發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的活力可達(dá)到2 986U/mL。

3 結(jié)論

本研究擬通過多種芽孢桿菌混合發(fā)酵的方式提高芽孢桿菌活菌制劑發(fā)酵廢液中蛋白酶的活力單位，從而提高發(fā)酵廢液的可利用性，實(shí)現(xiàn)活菌制劑發(fā)酵廢液的綜合利用及清潔生產(chǎn)。在構(gòu)建了芽孢桿菌混合配伍體系的基礎(chǔ)上，考察了發(fā)酵工藝條件，包括培養(yǎng)基pH值、發(fā)酵溫度、時(shí)間、接種量、裝液量及搖床轉(zhuǎn)速對(duì)混合發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的影響，應(yīng)用響應(yīng)面分析的試驗(yàn)方法對(duì)工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，最終確立了適宜的芽孢桿菌混合發(fā)酵工藝條件：即培養(yǎng)基初始pH7.17，裝液量50mL/250mL，接種量3%，于35.4℃，搖床轉(zhuǎn)速200r/min發(fā)酵100h。在此最佳條件下，芽孢桿菌混合發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的活力可達(dá)到2 986U/mL。

構(gòu)建的混合發(fā)酵體系使得發(fā)酵液中蛋白酶的活力有了顯著的提高，遠(yuǎn)高于單一芽孢桿菌的蛋白酶酶活。試驗(yàn)結(jié)果表明，采用混合發(fā)酵的方式確實(shí)可顯著提高活菌制劑發(fā)酵廢液中蛋白酶的活力單位，在一定程度上提高了活菌制劑發(fā)酵廢液的綜合利用價(jià)值。

[1]凌華云.飼用芽孢桿菌的生物學(xué)功能及其在飼料中的應(yīng)用[J].飼料與畜牧，2010（8）：39-42.

[2]潘康成，古叢偉，吳敏峰.飼用芽孢桿菌作用機(jī)理研究新進(jìn)展[J].飼料與畜牧，2009（12）：19-23.

[3]郭小華，趙志丹.飼用益生芽孢桿菌的應(yīng)用及其作用機(jī)理的研究進(jìn)展[J].中國畜牧獸醫(yī)雜志，2010（2）：27-31.

[4]劉瑩，孫榮丹.5株芽孢桿菌的分離鑒定、拮抗性試驗(yàn)與抑菌效價(jià)測(cè)定[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006，22（5）：32-34.

[5]ZULKIFLI I,ABDULLLAH N,AZRIN N M,et al.Growth performance and immune response of two commercial broiler strains fed diets containingLactobacilluscultures and oxytetracycline under heat stress conditions[J].Brit Poultry Sci,2000,41(5):593-597.

[6]JIRAPHOCAKUL S,SULLIVAN T W,SHAHANI K M.Influence of a driedBacillus subtilisculture and antibiotics on performance and intestinal microflora in turkeys[J].Poultry Sci,1990,69(11):1966-1973.

[7]陳鴻圖，傅金磊，楊月明，等.枯草芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶的特性及補(bǔ)料研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38（3）：43-48.

[8]孫妍，王加啟，奚曉琦，等.高產(chǎn)蛋白酶納豆芽孢桿菌的分離篩選與鑒定[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，41（2）：175-180.

[9]孫倩，陳復(fù)生，丁長河，等.地衣芽孢桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶發(fā)酵條件優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技，2012，33（13）：174-177.

[10]徐穎宣，徐爾尼，馮乃憲，等.微生物混菌發(fā)酵應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國釀造，2008，27（9）：1-4.

[11]郭淑文，趙樹欣，崔景宜，等.以乳清為原料采用混菌發(fā)酵技術(shù)促進(jìn)Nisin生產(chǎn)的研究[J].中國釀造，2010，29（7）：123-126.

[12]孫曉鳴，宋德平.不同菌株配伍搖瓶發(fā)酵蛋白酶的初探[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，31（3）：537-540

[13]徐桂轉(zhuǎn)，范帥堯，楊君芳，等.纖維素酶液體混菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化研究[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，45（6）：688-691.

[14]SIERECHA J K.Purification and partial characterization of a neutral proteasefromavirulentstrainofBacilluscereus[J].Int J Biochem Cell Biol,1998,30(5):579-595.

[15]LIU C B,LIU Y,LIAO W,et al.Application of statistically based experimental designs for the optimization of nisin production from whey [J].Biotechnol Lett,2003,25(11):877-882.

[16]李永泉，朱志成，李向晨，等.中性蛋白酶發(fā)酵工藝優(yōu)化研究[J].微生物學(xué)通報(bào)，1995，22（3）：150-154

[17]肖懷秋，林親錄，李玉珍，等.中性蛋白酶芽孢桿菌BX-4產(chǎn)酶條件及部分酶學(xué)性質(zhì)[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2005，24（4）：42-46.

Optimization of fermentation process by mixedBacillusstrains

HE Huamei,LI Shuzhen,CHEN Danxia,PAN Jinquan*
(School of Life Science and Technology,Zhanjiang Normal University,Zhanjiang 524048,China)

To increase the neutral protease activity fermented byBacillusstrains，the synergistic effect of multiple kinds ofBacillusstrains for preparing neutral protease by mixture-culture fermentation was investigated.On the basis of single factor experiment,the fermentation process by mixed Bacillusstrains was optimized through central composite design.After optimization,a proper mixture-culture fermentation process was determined: initial medium pH 7.17,liquid volume 50 ml in 250 ml flask,agitation speed of rotary shaker 200 r/min,inoculum 3%,temperature 35.4℃,fermentation time 100 h.Under these optimized conditions,the active unit of neutral protease produced byBacillusstrains by mixture-culture fermentation reached 2 986 U/ml.

Bacillusstrain;mixture-culture fermentation;protease;central composite design

Q939.97

A

0254-5071（2014）04-0056-05

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.04.014

2014-02-28

國家星火計(jì)劃項(xiàng)目（2013GA780084）；國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（201310579014）

何華美（1989-），女，本科生，研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)。

*通訊作者：潘進(jìn)權(quán)（1978-），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槊概c發(fā)酵工程。