呂娜，劉陽，夏海洋，崔艷艷，沈明浩，張捷

（1.吉林農業(yè)大學食品科學與工程學院，吉林長春130118；2.浙江萬里學院生物與環(huán)境學院，浙江寧波315100）

響應面法優(yōu)化超聲波提取山荊子抗氧化物質工藝

呂娜1，2，劉陽1，夏海洋1，崔艷艷1，沈明浩1，張捷2

（1.吉林農業(yè)大學食品科學與工程學院，吉林長春130118；2.浙江萬里學院生物與環(huán)境學院，浙江寧波315100）

采用Box-Behnken響應面分析法研究超聲波提取山荊子抗氧化物質的工藝條件。在單因素試驗的基礎上，研究乙醇體積分數(shù)、超聲功率、提取時間對提取液抗氧化性的影響。建立該工藝的二次多項式模型。依據(jù)回歸分析確定最優(yōu)提取條件。結果表明：回歸模型具有高度顯著性。最佳提取工藝條件為乙醇體積分數(shù)57%，提取時間42min，超聲功率為493W。此時提取液抗氧化性最強，亞鐵還原能力（FRAP）值達最大值12 375.8。

山荊子；FRAP法；抗氧化能力；響應面法；提取條件

山荊子（Malus baccata）又名山定子、山丁子、堂梨子、水楸子，為一種耐寒性極強的薔薇科蘋果亞科蘋果屬落葉喬木的果實[1-5]。山荊子資源主要分布在我國黑龍江、吉林、遼寧、內蒙古、山西、河北、陜西、甘肅[6-7]。成熟的山荊子果具有獨特的風味及豐富的營養(yǎng)素，食用價值很高，還具有促進人體物質代謝，增強人體消化吸收能力等重要的生理功能[8]。在食品工業(yè)中，山荊子果可制作飲料，也可釀制果酒等[9-10]。一些研究表明，生長于寒冷氣候下的水果比溫帶氣候水果具有更豐富的植物次級代謝產物，這些物質主要為一些具有抗氧化活性的酚類化合物[11]。超聲波提取技術由于具有提取時間短、有效成分提取率高、成本低、低溫保護熱敏性成分等優(yōu)點，近年來被廣泛應用于植物化學物的提取[12]。響應面分析法（response surface methodology，RSM）是采用多元二次回歸方程擬合因素與響應值之間的函數(shù)關系，通過對回歸方程的分析來解決多變量問題的一種統(tǒng)計學方法。與正交試驗相比，該法試驗周期短，求得的回歸方程精度高，可研究幾個因素間的交互作用。本研究采用超聲波法通過單因素試驗和響應面優(yōu)化，考察了乙醇體積分數(shù)、提取時間和超聲功率對山荊子抗氧化活性物質提取的影響，確定了最佳提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山荊子來自吉林農業(yè)大學果園；三吡啶三吖嗪（tripyridyltriazine，TPTZ）：美國Sigma公司；FeSO4、FeCl3等均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

JY92-2型超聲波細胞粉碎機：寧波新芝生物科技股份有限公司；DELTA320型pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司；SP-722E可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 山荊子提取物的制備

山荊子成熟后烘干、粉碎。分別稱取1g粉末，設定料液比1∶10，根據(jù)單因素和響應面試驗設計確定每組的提取條件，置于超聲波細胞粉碎機中提取，得到的提取液離心后取上清，真空濃縮后用用溶劑定容至10mL，待測。

1.3.2 提取液抗氧化性的測定

參照BENZIE I F F等[13]的方法，采用亞鐵還原/抗氧化能力（Ferric reducing/antioxidant power，F(xiàn)RAP）法測定山荊子提取液的抗氧化性的大小。將濃度為25～800μmol/L的FeSO4溶液250μL與3mL預熱至37℃的FRAP工作液（由0.3mol/L醋酸鹽緩沖液25mL、10mmol/L TPTZ溶液2.5mL、20mmol/L FeCl3溶液2.5mL組成）混合，反應10min后，于波長593nm處測定其吸光度值，以OD593nm值（y）為縱坐標，F(xiàn)eSO4溶液濃度（x）為橫坐標，繪制標準曲線，獲得回歸方程為：y=0.002 3x+0.195 7，相關系數(shù)R2=0.998。同樣取3μL提取液與247μL蒸餾水混勻，再與3mL FRAP工作液反應，同樣測定OD593nm值。根據(jù)反應后吸光度值，在標準曲線上求得相應FeSO4的濃度（μmol/L），定義為FRAP值。FRAP值越大，表明溶液中含有的抗氧化活性物質越多，即抗氧化活性越強。

1.3.3 單因素試驗

以FRAP值為考察指標，比較FRAP值與乙醇體積分數(shù)、提取時間和超聲功率的關系。

1.3.4 響應面試驗方案

在3個單因素試驗結果基礎上設計因素水平，以FRAP值為響應值（Y），通過Box-Behnken Design模型設計3因素3水平的試驗，并結合響應面分析法對山荊子抗氧化活性物質提取的工藝參數(shù)進行優(yōu)化分析，因素水平設計見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素水平及編碼Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 乙醇體積分數(shù)對FRAP值的影響

控制反應條件為超聲功率400W，提取時間30min，乙醇體積分數(shù)分別為0、20%、40%、60%、80%時，檢測提取液的FRAP值，結果如圖1所示。由圖1可知，當乙醇體積分數(shù)＜60%時，F(xiàn)RAP值隨乙醇體積分數(shù)的增加而增加。但當乙醇體積分數(shù)＞60%時，F(xiàn)RAP值反而下降。這可能因為當乙醇體積分數(shù)過高時，山荊子果實中脂溶性物質的溶出量增大，使抗氧化活性物質的溶解度降低，從而導致FRAP值降低。因此，選取體積分數(shù)60%乙醇作為提取溶劑較適合提取山荊子中的抗氧化活性物質。

圖1 乙醇體積分數(shù)對提取液FRAP值的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on FRAP value of extract

2.1.2 提取時間對FRAP值的影響

控制反應條件為超聲功率400W，提取劑為體積分數(shù)60%乙醇，分別超聲10min、20min、30min、40min、50min、60min后，檢測提取液FRAP值的大小，結果如圖2所示。由圖2可知，當提取時間＜40min時，所獲提取液的FRAP值隨提取時間的增加而增加。40min時FRAP值達到最大，之后隨提取時間增加FRAP值減小，這可能與山荊子較長時間的暴露于超聲波環(huán)境中，導致了果實中部分具有抗氧化活性的物質結果被破壞有關。

2.1.3 超聲功率對FRAP值的影響

設定提取劑為體積分數(shù)60%乙醇，提取時間40min，分別用100W、200W、300W、400W、500W、600W、700W的超聲波提取山荊子中的抗氧化活性物質，提取液的FRAP值如圖3所示。由圖3可知，當超聲功率為500W時，F(xiàn)RAP值達到最大，即提取液的抗氧化活性達到最高值。而繼續(xù)增加超聲功率，F(xiàn)RAP值反而減小，可能是由于超聲波功率過高導致了山荊子中抗氧化活性物質的破壞。

2.2 響應面法優(yōu)化山荊子抗氧化活性物質的提取工藝

2.2.1 試驗設計及結果

在單因素試驗基礎上，進行Box-Behnken響應面優(yōu)化試驗，試驗方案及結果如表2所示。

表2 響應面法設計與試驗結果Table 2 Design and results of Box-Benhnken experiment

采用Design-Expert 8.05b軟件，對表2中的結果進行多元擬合回歸，獲得FRAP值對乙醇體積分數(shù)、超聲功率和提取時間的二次多項回歸模型：

2.2.2 響應面結果分析

為了檢驗回歸方程的有效性，對回歸模型進行了方差分析，結果如表3所示。由表3可知，模型的P＜0.000 1，差異極顯著，說明該模型擬合度較好，回歸方程能很好的描述各因素與響應值之間的關系，證明了該方法是可靠的。失擬項P=0.398 9＞0.05，差異不顯著，表明可以用該模型預測實驗結果。模型的相關系數(shù)R2=0.975 1，說明該模型能解釋97.51%的響應面變化。變異系數(shù)（coefficientofvariation，CV）為5.48%，說明模型的置信度較高，模型方程能夠較好地反映真實的試驗值。以上表明可以用該模型來分析和預測山荊子抗氧化物質提取的最佳條件。從回歸方程各項方差分析結果看出，因素A、BC、A2、B2對響應值有極顯著影響，AB、AC、C2對響應值有顯著影響。結果表明，試驗各因素對抗氧化活性物質提取的影響不呈簡單的線性關系，3因素對響應值影響的大小順序為乙醇體積分數(shù)＞提取時間＞超聲功率。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.2.3 響應面分析與優(yōu)化

各因素之間兩兩相互關系對FRAP值影響的響應面及等高線見圖4。由圖4可知，F(xiàn)RAP值隨乙醇體積分數(shù)、超聲功率及提取時間增大呈先增后降的趨勢，說明3個因素在所選范圍內能產生最佳的響應值。在響應面分析中，曲面越陡峭表明該因素對響應值的影響越大[14-15]?？梢?，乙醇體積分數(shù)對提取液FRAP值的影響最顯著，表現(xiàn)為響應面中曲面較陡，提取時間次之，而超聲功率對FRAP值的影響最不顯著，表現(xiàn)為曲線較平滑。

2.2.4 提取工藝條件的確定

通過二次回歸預測的最佳工藝參數(shù)為體積分數(shù)57%乙醇溶液、超聲功率493W、提取時間42min，在此條件下提取液的FRAP理論值為12 324.2。采用該工藝進行3次重復試驗，得到提取液的FRAP平均值為12 375.8，測定結果穩(wěn)定，偏差不大，與響應面優(yōu)化結果差異不顯著，置信區(qū)間（confidence interval，CI）＜95%，表明響應面法優(yōu)化得到的提取工藝科學合理，準確可靠。

圖4 各兩因素交互作用對提取液FRAP值影響的響應面及等高線Fig.4 Response surface plot and contour line of the interaction among each two factors of ethanol concentration volume fraction,ultrasonic power and extraction time on FRAP value of the extract

3 結論

本研究在單因素試驗的基礎上采用響應面法對山荊子抗氧化成分進行了提取工藝優(yōu)化，得到了最佳提取工藝參數(shù)為乙醇體積分數(shù)57%，超聲功率493W、提取時間42min。在此條件下，F(xiàn)RAP值為12 375.8。研究結果為今后野生山荊子資源的綜合利用以及天然抗氧化劑的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

[1]中國農業(yè)科學院鄭州果樹研究所.中國果樹栽培學[M].北京：中國農業(yè)出版社，1987.

[2]呂娜，劉陽，崔艷艷，等.響應面法超聲提取山荊子總黃酮工藝[J].中國釀造，2014，33（2）：71-74.

[3]錢關澤.蘋果屬（MalusMill.）分類學研究[D].南京：南京林業(yè)大學博士論文，2005.

[4]YANG W,LIU X D,CHI X J,et al.Dwarf apple MbDREB1 enhances plant tolerance to low temperature,drought,and salt stress via both ABA-dependent and ABA-independent pathways[J].Planta,2011,233 (2):219-229.

[5]XIAO H H,YIN L P,XU X F,et al.The Iron-regulated transporter,Mb-NRAMP1,isolated fromMalus baccatais involved in Fe,Mn and Cd trafficking[J].Ann Bot-London,2008,102(6):881-889.

[6]ZAGAJA S W.Transmission of disease resistance and winter hardiness from selected fruits of Asiatic and East European origin[M].Russia:Research institute of pomology,1978.

[7]王雷宏.山荊子（Malus baccata（L.）Borkh.）變異式樣研究[D].南京：南京林業(yè)大學碩士論文，2008.

[8]苗影志.山荊子果部分營養(yǎng)成分分析和貯藏加工特性[J].經濟林研究，1995，13（4）：49-50.

[9]高海生.山荊子果酒的釀造[J].食品工業(yè)，1994（3）：33-34.

[10]潘小軍，王玉霞.山定子營養(yǎng)成分的測定[J].中國林副特產，2005，76（3）：41-43.

[11]孫婧.變溫條件下鈣對山定子葉片功能調節(jié)效應的研究[D].沈陽：沈陽農業(yè)大學碩士論文，2013.

[12]侯學敏，李林霞，張直峰，等.響應面法優(yōu)化薄荷葉總黃酮提取工藝及抗氧化活性[J].食品科學，2013，34（6）：124-128.

[13]BENZIE I F F,STRAIN J.The ferric reducing ability of plasma(FRAP) asa measure of“antioxidant power”the FRAP assay[J].Anal Biochem, 1996,239(3):70-76.

[14]SIN H N,YUSOF S,HAMID N S A,et al.Optimization of hot water extraction for sapodilla juice using response surface methodology[J].J Food Eng,2006,75(3):352-358.

[15]宋拓，李俊俊，唐湘華，等.響應面分析法優(yōu)化β-環(huán)糊精的制備工藝[J].中國釀造，2013，32（1）：84-89.

Optimization of ultrasonic wave extraction of antioxidant substances from Malus baccataby response surface methodology

Box-Behnken response surface methodology was employed to optimize the ultrasonic-assisted extraction of antioxidant substances from Malus baccata.On the basis of single factor investigation,effects of ethanol volume fraction,ultrasonic power and extraction time on the antioxidant activity of the extract were investigated.A quadratic regression model equation which described the extraction process was fitted.The optimum extraction parameters were determined by the regression analysis and the fitted regression model had high statistical significance.The optimum extraction conditions were determined as follows:ethanol volume fraction 57%,ultrasonic time 42 min,ultrasonic power 493 W.Under these conditions, the extract showed highest antioxidant activity with the FRAP value of 12 375.8.

Malus baccata;FRAP assay;antioxidant capacity;response surface methodology;extraction condition

O629.9

A

0254-5071（2014）04-0052-04

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.04.013

2014-02-25

浙江省科技廳公益項目（2010C32066）；吉林農業(yè)大學博士啟動基金（201308）

呂娜（1980-），女，副教授，博士，研究方向為天然產物化學。