高智明，趙沁沁，張國(guó)華，閆達(dá)中，劉軍

（武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢430023）

畢赤酵母工程菌表達(dá)豬β-干擾素

高智明，趙沁沁，張國(guó)華，閆達(dá)中，劉軍*

（武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢430023）

根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛(ài)，人工合成了豬β-干擾素（PoIFN-β）基因，構(gòu)建了重組載體pPICZA-PoIFN-β。重組載體經(jīng)SacI線性化后，電擊轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115，對(duì)在含博萊霉素（Zeocin）平板上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定，得到分泌表達(dá)豬β-干擾素的畢赤酵母基因工程菌株GS115/pPICZA-PoIFN-β。以1%甲醇誘導(dǎo)GS115/pPICZA-PoIFN-β表達(dá)。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析表明，工程菌株實(shí)現(xiàn)了豬β-干擾素的高效分泌表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物為相對(duì)分子質(zhì)量22ku和26ku的混合物，表達(dá)蛋白量約為80mg/L。

豬β-干擾素；分泌表達(dá)；畢赤酵母

畢赤酵母（Pichia pastoris）表達(dá)系統(tǒng)是當(dāng)前最有效、最方便的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一[9-11]。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)不存在原核表達(dá)系統(tǒng)的內(nèi)毒素難以去除的問(wèn)題，也不存在哺乳細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的病毒和支原體污染等問(wèn)題，并對(duì)表達(dá)的外源蛋白還可進(jìn)行翻譯后修飾加工，如蛋白水解、二硫鍵的形成以及糖基化修飾[12-13]等。畢赤酵母中表達(dá)量較高的基因往往采用的都是畢赤酵母所偏愛(ài)的密碼子，在所有的61個(gè)密碼子中，有19～25個(gè)是酵母所偏愛(ài)的密碼子，高表達(dá)的基因幾乎毫無(wú)例外地使用這25個(gè)偏愛(ài)的密碼子[14-16]。鑒于此，依據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛(ài)人工合成豬β-干擾素基因，構(gòu)建胞外表達(dá)豬β-干擾素的畢赤酵母工程菌株，以期實(shí)現(xiàn)了豬β-干擾素高效分泌表達(dá)，為豬β-干擾素的進(jìn)一步研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 質(zhì)粒和菌株

畢赤酵母（Pichia pastoris）分泌表達(dá)載體pPICZaA和GS11菌株：美國(guó)Invitrogen公司。

1.1.2 酶和試劑

TaqDNA聚合酶、DNA連接酶以及限制性內(nèi)切酶、DNA Maker DL 2000、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒：日本TaKaRa公司；低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物回收試劑盒：上海捷瑞生物工程有限公司；博萊霉素（Zeocin）抗生素：美國(guó)Invitrogen公司；其他試劑均為國(guó)藥分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

圍繞全面“從嚴(yán)治黨”抓作風(fēng)，凝聚事業(yè)發(fā)展的正能量。抓班子帶隊(duì)伍。強(qiáng)化各級(jí)領(lǐng)導(dǎo)班子和隊(duì)伍建設(shè)；實(shí)施行政許可受理、審查、審批“三分離”制度，推行“一站式”服務(wù)，方便群眾辦事。抓廉政樹(shù)形象。加強(qiáng)執(zhí)紀(jì)監(jiān)督力度，扎實(shí)開(kāi)展各類專項(xiàng)整治；積極探索建立廉政風(fēng)險(xiǎn)防控機(jī)制。抓公開(kāi)促法治。所有案件全過(guò)程都進(jìn)行公示，自覺(jué)接受監(jiān)督；全面推進(jìn)行刑銜接，涉刑案件全部移送公安機(jī)關(guān)，增強(qiáng)震懾力。

畢赤酵母誘導(dǎo)表達(dá)前培養(yǎng)基（buffered glycerol-complexmedium，BMGY）：胰蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，Biotin 0.000 4g/L，0.1mol/L磷酸緩沖液（pH6.0）10%，無(wú)氨基酵母氮源（yeast nitrogen base without amino acids，YNB）13.4g/L，1%（v/v）甘油。

畢赤酵母誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基（buffered methanol-complex medium，BMMY）：除以0.5%（v/v）甲醇代替甘油，其余成分與BMGY相同。

酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose，YPD）：葡萄糖20g/L，胰蛋白胨20g/L，1mol/L山梨醇，酵母提取物10g/L，1.5%瓊脂粉。

1.2 儀器與設(shè)備

5417R高速冷凍離心機(jī)、Electroporator 2510電轉(zhuǎn)化儀：德國(guó)艾本德公司；SHP-150生化培養(yǎng)箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；T-Gradient梯度PCR儀：德國(guó)Biometra公司；DYY-6C電泳儀：北京六一儀器廠；G：BOXF3凝膠成像系統(tǒng)：英國(guó)Syngene公司。

1.3 方法

1.3.1 pPICZA-IFN-β載體的構(gòu)建

依據(jù)畢赤酵母特有的密碼子偏愛(ài)設(shè)計(jì)，委托上海捷瑞生物工程有限公司合成豬β-干擾素基因。通過(guò)XhoI和Xba I酶切位點(diǎn)將豬β-干擾素基因插入到pPICZaA質(zhì)粒，獲得重組質(zhì)粒pPICZA-PoIFN-β。

1.3.2 畢赤酵母的電轉(zhuǎn)化及篩選鑒定

按Invitrogen公司操作手冊(cè)制備畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115感受態(tài)細(xì)胞，將80～100μL感受態(tài)細(xì)胞和經(jīng)Sac I單酶切線性化的高濃度重組質(zhì)粒pPICZA-PoIFN-β 5～10μg混勻轉(zhuǎn)入預(yù)冷的0.2cm間距電擊杯，冰浴5min。用Eppendorf電轉(zhuǎn)儀在1 500V電壓條件下電擊轉(zhuǎn)化，快速加入800μL冰冷的0.1mol/L山梨醇，涂于含100μg/mL Zeocin的YPD平板上，28℃培養(yǎng)3d。

挑取單菌落至酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）液體培養(yǎng)基試管中，28℃、220r/min條件下培養(yǎng)過(guò)夜，離心收集菌體用試劑盒提取基因組，PCR鑒定，篩選出整合有目的基因的重組子。

1.3.3 畢赤酵母重組子的搖瓶誘導(dǎo)表達(dá)

將鑒定的重組子單菌落接種于裝有25mL BMGY的250mL三角瓶中，28℃、220r/min條件下培養(yǎng)至OD600nm為1.0～1.4，3 000r/min離心5min收集菌體，用25mL BMMY培養(yǎng)基重懸菌體，28℃、220r/min條件下培養(yǎng)培養(yǎng)，每24h補(bǔ)加無(wú)水甲醇至終體積分?jǐn)?shù)為1%，72h后取樣進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)載體構(gòu)建

依據(jù)畢赤酵母特有的密碼子偏愛(ài)設(shè)計(jì)PoIFN-β基因，在合成的基因的5′端和3′端分別加X(jué)ho I酶切位點(diǎn)和Xba I酶切位點(diǎn)，用下劃線標(biāo)注。

將優(yōu)化的PoIFN-β基因和pPICZa-A質(zhì)粒用Xho I和Xba I雙酶切后，膠回收連接，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZA-PoIFN-β如圖1所示。

2.2 酵母陽(yáng)性重組子的PCR鑒定

重組質(zhì)粒pPICZA-PoIFN-β經(jīng)Sac I酶切線性化后，電轉(zhuǎn)化到赤酵母GS115。以PoIFN-β基因上游和下游引物對(duì)在含100μg/mL Zeocin的YPDS平板上得到的轉(zhuǎn)化子提取的基因組和對(duì)照pPICZA-PoIFN-β質(zhì)粒為模板PCR鑒定，凝膠電泳分析結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，pPICZAPoIFN-β質(zhì)粒和轉(zhuǎn)化子基因組均在500bp處擴(kuò)增出一條特異條帶，與理論大小相符。擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序表明PoIFN-β基因整合到酵母基因組中，工程菌GS115/pPICZA-PoIFN-β構(gòu)建成功。

2.3 SDS-PAGE檢測(cè)PoIFN-β表達(dá)

重組酵母誘導(dǎo)72h后，離心，取上清電泳。SDS-PAGE結(jié)果表明，工程菌表達(dá)產(chǎn)生了相對(duì)分子質(zhì)量約22ku和26ku的產(chǎn)物，陰性對(duì)照菌株此處無(wú)條帶如圖3所示，這表明畢赤酵母成功表達(dá)PoIFN-β基因。采用薄層掃描儀，檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物電泳結(jié)果，測(cè)定分泌表達(dá)的PoIFN-β蛋白量約為80mg/L。

圖1 畢赤酵母重組表達(dá)載體pPICZA-PoIFN-βFig.1 Recombinant expression vector of yeastPichia pastoris

圖2 PCR鑒定畢赤酵母轉(zhuǎn)化子Fig.2 PCR identification ofP.pastoristransformant

圖3 SDS-PAGE分析PoIFN-β在畢赤酵母中的表達(dá)Fig.3 SDS-PAGE analysis of PoIFN-βexpressed in recombinant yeast

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)選用分泌型表達(dá)載體pPICZaA在畢赤酵母中表達(dá)PoIFN-β，得到了能較高表達(dá)PoIFN-β工程菌株，但表達(dá)的豬IFN-β蛋白分子質(zhì)量比預(yù)期片段（19ku）稍大，可能是因?yàn)镻oIFN-β多肽中含有幾個(gè)糖基結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)生了一定程度的糖基化，致使PoIFN-β蛋白分子質(zhì)量偏大。

由于畢赤酵母有自身的氨基酸密碼子偏愛(ài)性，同義密碼子的表達(dá)能力不同，對(duì)非自身的基因表達(dá)時(shí)，稀有密碼子更有可能限制外源基因的表達(dá)。本研究設(shè)計(jì)時(shí)，充分利用了優(yōu)勢(shì)密碼子的使用，以便適應(yīng)轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸（transfer ribonucleic acid，tRNA）的同工受體及宿主的反義密碼子搖擺位置處被修飾的核苷酸的豐度，同時(shí)也有利于翻譯的二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成。工程菌GS115/pPICZA-PoIFN-β分泌表達(dá)PoIFN-β蛋白量約為80mg/L，這與未經(jīng)密碼子優(yōu)化的文獻(xiàn)報(bào)道的相當(dāng)，究其原因，除密碼子偏愛(ài)外，外源基因整合的拷貝數(shù)，RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性，發(fā)酵條件等都對(duì)畢赤酵母表達(dá)外源蛋白水平有影響。

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Secreting expression of porcine interferon-βin genetically engineeredPichia pastoris

GAO Zhiming,ZHAO Qinqin,ZHANG Guohua,YAN Dazhong,LIU Jun*
(School of Biology and Pharmaceutical Engineering,Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023,China)

According toPichia pastorispreference of codon usage,the porcine interferon-βgene was synthesized and recombinant vector pPICZAPoIFN-βwas constructed.The recombinant plasmid was linearized withSacI and transformed intoP.pastorisGS115 by electroporation.The engineered strainP.pastoriGS115/pPICZA-PoIFN-βwas identified on zeocin resistant plate.1%methanol was used to induce the expression of GS115/pPICZA-PoIFN-β.SDS-PAGE indicated that the engineered strain efficiently secreted porcine IFN-β,with two molecular weight products of 22 ku and 26 ku,and the expression porcine IFN-βproteins were about 80 mg/L.

porcine interferon-β;secretion expression;Pichia pastoris

Q78

A

0254-5071（2014）04-0044-03

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.04.011

2014-02-11

湖北省自然科學(xué)基金（2008CDB067）

高智明（1988-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锷锛夹g(shù)。*

劉軍（1967-），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槊概c生物催化。